CN113115706A - 一种长白落叶松胚性愈伤组织胚性恢复与保持的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是恢复和保持长白落叶松胚性愈伤组织的胚性—通过调节胚性愈伤组织继代培养基中激素浓度的方法。胚性愈伤组织在S+0.1mg·L‑12，4‑D+0.04mg·L‑1BA+0.02mg·L‑1KT激素条件下，继代6个月后发现胚性愈伤组织的体胚分化率急剧下降。经去除2，4‑D，逐渐降低NAA的方法恢复胚性：将胚性愈伤组织接种在每2周NAA浓度从0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg·L‑1依次降低的S培养基中进行胚性恢复培养，其中S培养基中激素还包含0.5mg·L‑1BA、0.5mg·L‑1KT。最终在S+0.2mg·L‑1NAA+0.5mg·L‑1BA+0.5mg·L‑ 1KT+0.5g·L‑1谷氨酰胺+0.5g·L‑1水解酪蛋白+30g·L‑1蔗糖+3g·L‑1植物凝胶培养条件下持续继代2年，胚性仍然保持良好。将胚性恢复的愈伤组织经分化培养后，体胚发生率可达100％。将发育正常的体细胞胚胎转入萌发培养基中，4周后成苗率可达46.2％。

Description

一种长白落叶松胚性愈伤组织胚性恢复与保持的方法
技术领域
本发明涉及一种落叶松胚性愈伤组织胚性恢复与保持的方法。本发明属于林业生物技术领域。
背景技术
长白落叶松(Larix olgensis)别名黄花落叶松、朝鲜落叶松，属松科、落叶松属高大乔木，其木材重而实、耐久用，是我国东北地区营造短周期天然林不可代替的树种。利用落叶松未成熟合子胚诱导的胚性愈伤组织，在持续继代过程中存在着胚性下降甚至消失的问题，严重制约着落叶松体细胞胚胎发生途径和林木遗传转化工作的研究。
1989年Kimaszewska等以日本×欧洲杂种落叶松(Larix×eurolepis)的未成熟合子胚为材料，诱导出胚性愈伤组织，在持续继代过程中发现体胚分化率下降，发现用0.4％结冷胶代替1.0％琼脂的MSG培养基可以长久维持愈伤组织的胚性(Klimaszewska K.PlantScience,1989,63(1):95-103)。相继在美西落叶松(Larix occidentalis)(Thompson R G,Aderkas P V.Plant Cell Reports,1992,11(8):379-385)、日本×杂种落叶松(Larix×leptoeuropaea)(Lelu M A,Klimaszewska K,Charest P J.Revue Canadienne DeRecherche Forestière,1994,24(1):100-106)、北美落叶松(Larix laricina)(Klimaszewska K,Devantier Y,Lachance D,Canadian Journal of Forest Research,1997,27(4):538-550)、日本落叶松(Larix leptolepis)(Kim Y W,Youn Y,Noh E R,etal.Plant Cell,Tissue and Organ Culture,1998,55(2):95-101)、华北落叶松(Larixprincipis-Rupprechtii)(Li Q I,Ewald D,Ying H S.Acta Biologiae ExperimentalisSinica,2000,33(4):357)、日本×长白；日本×兴安杂种落叶松(Larix kaempferi×L.olgensis；Larix kaempferi×L.gemlinii)(王伟达,李成浩,杨静莉,等.林业科学,2009,45(8):34-38)、西伯利亚落叶松(Larix sibirica)(Tret’yakova I N,Barsukova AV.Russian Journal of Developmental Biology,2012,43(6):353-361)、长白落叶松(Larix olgensis)(宋跃，张含国，等.林业科学,2016,52(10):45-54)等落叶松属的胚性愈伤组织在持续继代过程中均发现胚性下降，体胚发生率降低的问题。因此，利用植物组织培养技术对胚性愈伤组织进行胚性恢复和保持显得格外重要。
尽管每种落叶松的胚性愈伤组织在其适宜条件下均保持一段时间胚性，但是利用逐渐降低NAA浓度搭配高浓度的细胞分裂素的方法来恢复和维持胚性愈伤组织的胚性还未见有报道。本发明介绍的是调节增殖继代培养基中激素浓度及配比来长期维持体胚分化的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种恢复和保持胚性愈伤组织胚性的方法--利用逐渐降低NAA浓度搭配高浓度的细胞分裂素的方法。该发明对进一步完善落叶松体胚发生途径具有重要意义，并为林木资源快速繁育和遗传改良奠定基础。
本发明提供一种长白落叶松胚性愈伤组织恢复与保持的方法。
具体的发明内容的技术路线包括以下内容：
(1)胚性愈伤组织继代过程中胚性的恢复与保持
S+0.5mg·L-1BA+0.5mg·L-1KT+0.5g·L-1谷氨酰胺+0.5g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖
采取了除去2，4-D，逐渐减低NAA的浓度的措施来恢复与保持愈伤组织的胚性。具体措施(如表1)是将继代的胚性愈伤组织接种在除去2，4-D，且每4周NAA浓度从0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg·L-1依次降低的S培养基中(包含0.5mg·L-1BA+0.5mg·L-1KT+0.5g·L-1谷氨酰胺+0.5g·L-1水解酪蛋白+30g·L-1蔗糖)进行胚性恢复培养。每两周继代一次，在每个降低的NAA浓度里，继代一次后一部分转入下一个浓度梯度，一部分转入体胚发生培养基，诱导体胚发生。根据体胚发生率确定恢复愈伤组织胚性的最佳NAA浓度。
表1胚性愈伤组织增殖培养基
Figure BDA0002367265120000011
(2)体细胞胚发生及萌发
将胚性恢复的愈伤组织接种在含有PEG400060g·L-1、蔗糖60g·L-1的S培养基中预培养10天后，转接至含有ABA 20mg·L-1、PEG400060g·L-1、蔗糖60g·L-1的S培养基中，6周后统计体胚发生率。将发育状态良好的体胚先接种在含有6mg·L-1间苯三酚的WPM培养基中，2周后统计体胚萌发率；将萌发状态良好的体胚苗转接至含有0.5mg·L-1GA3、0.4mg·L-1NAA、1.0mg·L-1IBA的B5培养基中，2周后统计成苗率。
本发明的特征：
能够恢复胚性下降的愈伤组织的胚性，并将长期保持胚性愈伤组织分化能力。
附图说明
图1体细胞胚胎发生及萌发。A,B,C,D分别为胚性愈伤组织分化2,4,5,6周时的状态(比例尺：1.5cm)；E是发育状态良好的体细胞胚放大图(比例尺：2.0cm)；F是从分化培养基上挑取的单个体胚转接到萌发培养基上，2周后发育状态的早期体胚苗(比例尺：2.0cm)。
具体实施方式
实例1胚性愈伤组织继代过程中胚性的恢复与保持
继代的胚性愈伤组织接种在NAA浓度从0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg·L-1依次降低的S培养基中，进行胚性恢复培养。每个梯度继代两次后转入分化培养基，诱导体胚发生，6周后统计体胚发生情况。
表2胚性愈伤组织胚性恢复处理对体胚发生的影响
Figure BDA0002367265120000021
注：运用Duncan多重比较。不同字母表示在0.05水平上差异显著。
如表2所示：对照组的体胚发生率为45.3％，体胚数量为16.5个·g-1。1、2、3、4、5实验组与对照组相比，用NAA代替2，4-D，同时提高BA和KT的浓度，可以明显提高愈伤组织的体胚发生率和体胚数量。NAA浓度在0.5-0.1范围内，随着NAA浓度的逐渐递减，体胚发生率呈现先缓慢增高再降低的趋势，体胚数量也先变多后变少。当NAA浓度为0.2mg·L-1时，体胚发生率最大为72.4％，体胚数量最多为48.6个·g-1。同比对照，体胚发生率提高了27.1％，体胚数量增加了32.1个·g-1。说明0.2mg·L-1的NAA对愈伤组织的胚性恢复效果最好。将胚性愈伤组织长期继代在S+0.2mg·L-1NAA+0.5mg·L-1BA+0.5mg·L-1KT的培养条件下，可长久维持其胚性。
实例2体细胞胚胎发生及萌发
胚性愈伤组织预培养10天后接种至分化培养基中，4周后体胚发生率可达100％。长势优良的体胚转入萌发培养基2周后体胚萌发率可达81.3％，转入B5培养基2周后成苗率可达46.2％。

Claims (1)

1.一种长白落叶松胚性愈伤组织胚性恢复与保持的方法，其特征在于：
以在添加2，4-D、BA、KT的S基本培养基中增殖继代而胚性下降的胚性愈伤组织为材料，将BA、KT的浓度都调整为0.5mg·L-1；用NAA代替2,4-D，并在每2周的继代过程中逐渐减低NAA的浓度：0.5、0.4、0.3、0.2、0.1mg·L-1；每次继代的同时一部分转入分化培养基，根据分化情况，最终确定胚性恢复的最佳NAA浓度为0.2mg·L-1；并在此条件下进行长期继代，胚性仍然良好；因此，胚性恢复与保持的条件为S+0.2mg·L-1NAA+0.5mg·L-1BA+0.5mg·L-1KT+0.5g·L-1谷氨酰胺+0.5g·L-1水酪蛋白+30g·L-1蔗糖。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111466294A (zh) * 2020-05-29 2020-07-31 北京林业大学 一种华北落叶松胚性组织超低温保存的方法

Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6692963B1 (en) * 2001-06-19 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of reproducing plants by somatic embryogenesis
CN1922985A (zh) * 2006-09-04 2007-03-07 中国科学院植物研究所 落叶松属植物胚性愈伤组织的继代方法及其专用培养基
KR20070049889A (ko) * 2005-11-09 2007-05-14 대한민국(관리부서 : 산림청 국립산림과학원장) 체세포배 유도법에 의한 낙엽송의 번식 방법
CN101218894A (zh) * 2007-09-26 2008-07-16 南京林业大学 湿地松和加勒比松杂种体细胞胚胎发生和植株再生方法
CN105409767A (zh) * 2015-10-23 2016-03-23 东北林业大学 一种提高长白落叶松体细胞胚发生和植株再生效率的过渡培养基及培养方法
CN111280065A (zh) * 2020-04-07 2020-06-16 北京林业大学 一种落叶松体细胞胚再生的方法

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6692963B1 (en) * 2001-06-19 2004-02-17 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of reproducing plants by somatic embryogenesis
KR20070049889A (ko) * 2005-11-09 2007-05-14 대한민국(관리부서 : 산림청 국립산림과학원장) 체세포배 유도법에 의한 낙엽송의 번식 방법
CN1922985A (zh) * 2006-09-04 2007-03-07 中国科学院植物研究所 落叶松属植物胚性愈伤组织的继代方法及其专用培养基
CN101218894A (zh) * 2007-09-26 2008-07-16 南京林业大学 湿地松和加勒比松杂种体细胞胚胎发生和植株再生方法
CN105409767A (zh) * 2015-10-23 2016-03-23 东北林业大学 一种提高长白落叶松体细胞胚发生和植株再生效率的过渡培养基及培养方法
CN111280065A (zh) * 2020-04-07 2020-06-16 北京林业大学 一种落叶松体细胞胚再生的方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
YUE SONG等: "Screening and verification of the factors influencing somatic embryo maturation of Larix olgensis", 《JOURNAL OF FORESTRY RESEARCH》 *
刘威锋等: "通过多种培养基优化长白落叶松体细胞胚再生", 《分子植物育种》 *
刘建飞等: "长白落叶松体胚发生再生体系优化", 《植物学报》 *
宋跃等: "长白落叶松胚性愈伤组织诱导及体细胞胚胎发生", 《林业科学》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111466294A (zh) * 2020-05-29 2020-07-31 北京林业大学 一种华北落叶松胚性组织超低温保存的方法
CN111466294B (zh) * 2020-05-29 2023-05-30 北京林业大学 一种华北落叶松胚性组织超低温保存的方法

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