CN114788496A - 一种固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法，以落羽杉子叶胚为外植体，接入固体胚性愈伤组织诱导培养基中诱导出胚性愈伤组织，然后再进行固体增殖培养；完成后，转入继代培养基进行液体悬浮继代培养一次以上，将获得的悬浮液涂于滤纸上，然后将滤纸移至体胚诱导培养基诱导出成熟体胚，并接种于光照培养室组培瓶中，以成苗培养基继续培养得到落羽杉小苗。本发明首次建立了落羽杉的体胚发生体系，操作步骤简单，成本低，能够快速获得落羽杉体细胞胚胎，高效繁育大量落羽杉苗木，也有利于后期建立落羽杉的遗传转化体系。

Description

一种固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法

技术领域

本发明属于植物组培技术领域，具体涉及一种固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法。

背景技术

落羽杉(Taxodium distichum(L.)Rich.)为柏科落羽杉属的古老孑遗植物，其树形高大优美，叶片秀丽似羽毛，生长速度快且适应性强，拥有极强的耐水淹能力，广泛应用于景观绿化和生态防护。通过落羽杉属种间杂交选育的‘中山杉118’等系列无性系已经在我国东部沿海滩涂造林、长江流域湿地生态修复和内陆平原地区造林绿化工程中得到广泛应用，市场需求愈来愈大。

相关研究发现，利用传统的扦插方法繁育时，枝条的采集易受到数量与季节的限制，而且随着母树年龄的增长，枝条生根能力逐渐下降。体细胞胚胎发生技术具有繁殖数量多、速度快等优点，在大规模无性繁殖中表现出高效性和经济性，是实现市场需求大、常规繁殖技术困难的优良苗木模式化生产的重要手段，迄今为止，有关落羽杉属的高效体胚发生与植株再生的方法尚未见报道。因此，建立落羽杉属的体胚发生体系非常重要，可为后期‘中山杉’良种的扩繁和遗传转化提供理论和技术支持。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明所要解决的技术问题在于提供一种固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法，可快速产生大量落羽杉小苗。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法，以落羽杉子叶胚为外植体，接入固体胚性愈伤组织诱导培养基中诱导出胚性愈伤组织，然后再进行固体增殖培养；完成后，转入继代培养基进行液体悬浮继代培养一次以上，将获得的悬浮液涂于滤纸上，然后将滤纸移至体胚诱导培养基诱导出成熟体胚，并接种于光照培养室组培瓶中，以成苗培养基继续培养得到落羽杉小苗。

所述落羽杉子叶胚获得方式为：8月份采集的未成熟球果，剥出带壳种子后进行消毒，将所得无菌种子置于滤纸上吸干水分，剥出子叶胚。

所述胚性愈伤组织诱导培养基为DCR+2，4-D 3～5mg/L+6-BA 0.5～1.0mg/L+VC10mg/L+谷氨酰胺0.4～0.6g/L+水解酪蛋白0.5～1.0g/L+活性炭2.0～2.5g/L+麦芽糖20～25g/L+凝胶2.5g/L。

所述固体增殖培养采用的胚性愈伤组织增殖培养基为DCR+2，4-D 1～2mg/L+6-BA0.2～0.5mg/L+VC 10mg/L+谷氨酰胺0.4～0.6g/L+水解酪蛋白0.5～1.0g/L+活性炭2.0～2.5g/L+麦芽糖20～25g/L+凝胶2.5g/L。

悬浮培养所用的液体培养基为DCR+2，4-D 1～2mg/L+6-BA 0.2～0.5mg/L+VC10mg/L+谷氨酰胺0.4～0.6g/L+水解酪蛋白0.5～1.0g/L+麦芽糖20g/L，胚性愈伤组织悬浮培养的转速为95r/min。

所述体胚诱导培养基为DCR+ABA 8～12mg/L+PEG 170～190g/L+GA 1～5mg+VC15mg/L+谷氨酰胺0.4mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+活性炭2.0g/L+麦芽糖20g/L+凝胶3.0g/L。

所述成苗培养基为DCR基本培养基+蔗糖20g/L+凝胶2.5g/L。

成苗培养条件为：温度23℃，光照强度260±30μmol·m^-2·s^-1，光照时间16h/d。

所述的固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法，包括以下步骤：

1)于8月份，从落羽杉优良母树上采取球果，剥出带壳种子后进行消毒；

2)将步骤1)所得无菌种子置于滤纸上吸干水分，剥出子叶胚后接入胚性愈伤组织诱导培养基中，诱导出胚性愈伤组织；胚性愈伤组织诱导培养基为DCR+2，4-D 4mg/L，6-BA1.0mg/L，谷氨酰胺0.4g/L，水解酪蛋白0.5g/L，活性炭2.5g/L和麦芽糖20g/L；

3)将步骤2)所得胚性愈伤组织接种至增殖培养基中进行增殖培养；增殖培养基为DCR+2，4-D 1mg/L+6-BA 0.2mg/L；

4)将继代培养2周、生长旺盛的胚性愈伤组织接种至250mL的无菌三角瓶中，固液比例1∶9进行摇瓶悬浮培养，23℃下暗培养，每7d继代一次；液体培养基为DCR+2，4-D 1mg/L+6-BA 0.2mg/L，摇床转速为95r/min；

5)继代一次后，用移液枪吸取2mL悬浮液均匀涂于滤纸上，然后将滤纸移至体胚诱导培养基上，23℃下暗培养；体胚诱导培养基为DCR+VC 15mg/L+谷氨酰胺0.4mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+活性炭2.0g/L+麦芽糖20g/L+凝胶3.0g/L+ABA浓度分别为8～12mg/L+PEG190mg/L+GA浓度分别为1～5mg/L。

6)体胚诱导2个月后，将成熟体胚接种于光照培养室组培瓶中，以成苗培养基继续培养两个月后得到落羽杉小苗。

有益效果：相比于现有技术，本发明的优势为：

本发明提供的固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法，胚性愈伤组织可以大量不断扩繁，不受季节限制；悬浮培养操作简单，体胚发生效率高，体胚质量好；此外，体细胞胚再生植株直接拥有根系，省去了以往扦插繁育或器官发生中的生根培养环节，显著缩短了育种周期；落羽杉高效、稳定的体胚发生体系的建立，解决了其良种扩繁问题，有利于后期‘中山杉’优良无性系的高效扩繁与市场推广。

附图说明

图1是未成熟球果与子叶胚图，图A为落羽杉未成熟球果，图B为子叶胚，图C为子叶胚下胚轴部位产生的胚性愈伤组织；

图2是胚性愈伤组织增殖状态图；

图3是胚性愈伤组织悬浮培养图，左图为胚性愈伤悬浮培养扩大增殖，右图为悬浮培养下完整的胚性胚柄团结构；

图4是体胚诱导与萌发图；

图5是体胚再生植株图，左图为成熟体细胞胚胎，右图为体胚再生植株。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。

从落羽杉优良母树上采取绿色未成熟球果，剥取带壳种子后对其进行消毒；由于种子表面存在大量挥发性油，所以在灭菌前需要用洗洁精清洗3～5次，用75％乙醇消毒1min，5％次氯酸钠消毒12min，并加入适量的吐温，消毒过程中要不断晃动，使消毒液与种子充分接触，倒去次氯酸钠溶液，用无菌水冲洗3～4次。将无菌的种子置于干燥的滤纸上，吸去表面的水分，之后在体视镜下剥出子叶胚，并将其接种至胚性愈伤组织诱导培养基上。培养条件为23℃，暗培养。

实施例1

(1)落羽杉胚性愈伤组织的诱导与增殖：

每年8月，采集落羽杉优良母树上的未成熟球果，剥取子叶胚为起始材料诱导胚性愈伤组织，以DCR为基础培养基，附加高浓度的生长素(2，4-D3～5mg/L)和细胞分裂素(6-BA0.5～1.0mg/L)，以及VC 10mg/L、谷氨酰胺0.4g～0.6/L、水解酪蛋白0.5～1.0g/L、活性炭2～2.5g/L、麦芽糖20～25g/L、凝胶2.5/L，pH调至5.8，23℃下暗培养。暗培养一个月左右，可在子叶胚的下胚轴或者胚根部位产生胚性愈伤组织，胚性愈伤组织表现为透明有粘性，质地松软(图1)。

用镊子将胚性愈伤组织分成小块，接种于增殖培养基上，每20d继代一次，可获得大量生长旺盛、状态良好的胚性愈伤组织，可用于后期体胚诱导(图2)。增殖培养时所用培养基为DCR+2，4-D 1～2mg/L+6-BA 0.2～0.5mg/L+VC 10mg/L+谷氨酰胺0.4～0.6g/L+水解酪蛋白0.5～1.0g/L+活性炭2.0～2.5g/L+麦芽糖20～25g/L+凝胶2.5g/L，与胚性愈伤组织诱导培养基相比，只需降低生长素和细胞分裂素的使用浓度，其余条件不变。

(2)落羽杉胚性愈伤组织悬浮系的建立与继代

液体悬浮培养所用培养基为DCR+2，4-D 1～2mg/L+6-BA 0.2～0.5mg/L+VC 10mg/L+谷氨酰胺0.4～0.6g/L+水解酪蛋白0.5～1.0g/L+麦芽糖20g/L，pH5.8，基本流程是：取继代15d左右长势良好的胚性愈伤组织，于无菌操作台内接种于250mL的三角瓶中，胚性愈伤组织与液体培养基的固液比例为1∶9，将接种好的悬浮系置于摇床内，95r/min，23℃暗培养(图3)。悬浮培养7d后，用400目的无菌细胞筛收集愈伤，滤出液体培养基后，将胚性愈伤组织转接至新的无菌三角瓶中，倒入新鲜的液体培养基继续培养。培养5d左右，可观察到较多的胚性胚柄团结构，此时可以进行后续的体细胞胚胎诱导(图3)。

(3)落羽杉体细胞胚的诱导与萌发

为了避免胚性胚柄团结构被破坏，需稍微剪去1mL枪头的尖端，用移液枪吸取2mL悬浮培养细胞液均匀涂布于滤纸上，然后将涂有细胞液的滤纸移至体胚诱导培养基上，23℃黑暗条件下培养。

培养两个月左右，滤纸上会长出大量的胚性愈伤组织以及不同发育阶段的体细胞胚胎，据统计每皿约有100个成熟子叶胚以及大量早期原胚和后期原胚，体胚发生效率大大提高(图4)。

(4)落羽杉体细胞胚植株再生

将成熟子叶胚接种至成苗培养基上，成苗培养基为DCR基本培养基+蔗糖20g/L+凝胶2.5g/L，培养条件为23℃，空气相对湿度42～43％，光照采用白炽灯光源，光照时间16h/d，光强为260±30μmol·m^-2·s^-1，培养2个月即可获得再生植株(图5)。

实施例2

胚性愈伤组织诱导阶段：采用DCR培养基，附加2，4-D 3～5mg/L，6-BA 0.5～1.0mg/L，谷氨酰胺0.4～0.6g/L，水解酪蛋白0.5～1.0g/L，活性炭2.0～2.5g/L和麦芽糖20～25g/L，具体培养基组合见表1。据观察，子叶胚接入培养基后2周左右开始启动，4周左右时在体视镜下可以观察到子叶胚的下胚轴或胚根部位会产生质地疏松、颜色透明的胚性愈伤组织。从表1可以看出，胚性愈伤组织的产生需要高浓度的2，4-D和6-BA细胞分裂素处理，同时也需要一些氨基酸补充养分以及麦芽糖提供碳源。

表1不同培养基对落羽杉胚性愈伤组织诱导的影响

	1	2	3	4
					2，4-D(mg/L)	4.0	4.0	5.0	3.0
6-BA(mg/L)	1.0	0.5	1.0	0.5
					谷氨酰胺(g/L)	0.4	0.4	0.6	0.5
水解酪蛋白(g/L)	0.5	0.5	1.0	1.0
					活性炭(g/L)	2.5	2.0	2.0	2.0
麦芽糖(g/L)	20	25	25	25
					诱导率(％)	11.09％	10.87％	9.31％	3.28％

实施例3

胚性愈伤组织增殖阶段：采用DCR培养基，附加2，4-D 1～2mg/L，6-BA 0.2～0.5mg/L，具体培养基组合见表2。将实施例2得到的胚性愈伤组织分成小块，接种于增殖培养基上，每20d继代一次。结果表明，增殖阶段的2，4-D和6-BA浓度过高会导致愈伤组织生长过快并且逐渐丧失胚性，愈伤组织表面变得纯白且干燥，因此在愈伤增殖阶段需要降低这两种激素的使用浓度，使愈伤组织维持在适宜的生长速率。

表2不同培养基对胚性愈伤组织增殖的影响

实施例4

悬浮细胞系的建立：从实施例3中挑选颜色透明、质地疏松的愈伤组织接种于250mL的三角瓶中，用镊子轻轻将愈伤组织压散，之后用液体培养基将愈伤组织冲入瓶底，置于恒温摇床上暗培养，液体培养基配方与愈伤增殖阶段培养基一致，无需添加活性炭和凝胶。将摇床转速分别设置为75,95和115r/min，23℃暗培养。悬浮培养7d后，用400目的无菌细胞筛收集愈伤，滤出液体培养基后，将胚性愈伤组织转接至新的无菌三角瓶中，倒入新鲜的液体培养基继续培养。培养5d左右，吸取100μl的悬浮液在显微镜下观察细胞结构，结果发现转速为75r/min和115r/min时，多数细胞的胚性胚柄团结构破坏，但是在95r/min时，大多数细胞的胚性胚柄团结构完整，可以进行后续的体细胞胚胎诱导。

表3不同转速对胚性胚柄图结构的影响

转速(r/min)	细胞状态
		75	胚性胚柄团结构破坏
95	胚性胚柄团结构多数完整
		115	胚性胚柄团结构破坏

实施例5

体胚诱导阶段：将实施例4得到的悬浮细胞系转接在以DCR为基本培养基，添加VC15mg/L，谷氨酰胺0.4mg/L，水解酪蛋白0.5g/L，活性炭2.0g/L，麦芽糖20g/L，凝胶3.0g/L的培养基上，另外ABA浓度分别为8，10，12mg/L，PEG浓度分别为150，170，190mg/L，GA浓度分别为1，3，5mg/L，采用L₉(3³)的正交试验设计进行试验(表4)，两个月后观察体胚发育情况。结果发现，当PEG浓度为150g/L时，没有子叶胚的形成，愈伤组织增殖明显，表面仅有少量的早期原胚；当PEG浓度为170g/L时，只有少量子叶胚的形成，愈伤组织表面有大量的后期原胚不能成熟；当PEG浓度为190g/L时，子叶胚数量较多，尤其是ABA浓度为10mg/L时，子叶胚诱导效率最高。

表4不同培养基对体胚形成的影响

本发明的固液交替培养方法，与直接在固体培养基上进行体胚诱导相比具有巨大的优势，尤其是在体胚诱导效率上增长了近10倍。悬浮培养时，胚性细胞系较为分散，接种至体胚诱导培养基上可直接进行分化。若直接在固体培养基上培养，愈伤团会增殖，不利于后期的体胚分化，虽然表面会有大量的后期原胚，但是很难进入成熟阶段。

Claims (9)

1.一种固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法，其特征在于，以落羽杉子叶胚为外植体，接入固体胚性愈伤组织诱导培养基中诱导出胚性愈伤组织，然后再进行固体增殖培养；完成后，转入继代培养基进行液体悬浮继代培养一次以上，将获得的悬浮液涂于滤纸上，然后将滤纸移至体胚诱导培养基诱导出成熟体胚，并接种于光照培养室组培瓶中，以成苗培养基继续培养得到落羽杉小苗。

2.根据权利要求1所述的固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法，其特征在于：所述落羽杉子叶胚获得方式为：8月份采集的未成熟球果，剥出带壳种子后进行消毒，将所得无菌种子置于滤纸上吸干水分，剥出子叶胚。

3.根据权利要求1所述的固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法，其特征在于：所述胚性愈伤组织诱导培养基为DCR+2，4-D 3～5mg/L+6-BA 0.5～1.0mg/L+VC 10mg/L+谷氨酰胺0.4～0.6g/L+水解酪蛋白0.5～1.0g/L+活性炭2.0～2.5g/L+麦芽糖20～25g/L+凝胶2.5g/L。

4.根据权利要求1所述的固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法，其特征在于：所述固体增殖培养采用的胚性愈伤组织增殖培养基为DCR+2，4-D 1～2mg/L+6-BA 0.2～0.5mg/L+VC 10mg/L+谷氨酰胺0.4～0.6g/L+水解酪蛋白0.5～1.0g/L+活性炭2.0～2.5g/L+麦芽糖20～25g/L+凝胶2.5g/L。

5.根据权利要求1所述的固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法，其特征在于：悬浮培养所用的液体培养基为DCR+2，4-D 1～2mg/L+6-BA 0.2～0.5mg/L+VC 10mg/L+谷氨酰胺0.4～0.6g/L+水解酪蛋白0.5～1.0g/L+麦芽糖20g/L，胚性愈伤组织悬浮培养的转速为95r/min。

6.根据权利要求1所述的固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法，其特征在于：所述体胚诱导培养基为DCR+ABA 8～12mg/L+PEG 170～190g/L+GA 1～5mg+VC 15mg/L+谷氨酰胺0.4mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+活性炭2.0g/L+麦芽糖20g/L+凝胶3.0g/L。

7.根据权利要求1所述的固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法，其特征在于：所述成苗培养基为DCR基本培养基+蔗糖20g/L+凝胶2.5g/L。

8.根据权利要求1所述的固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法，其特征在于：成苗培养条件为：温度23℃，光照强度260±30μmol·m^-2·s^-1，光照时间16h/d。

9.根据权利要求1所述的固液交替培养诱导落羽杉高效体胚发生的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)于8月份，从落羽杉优良母树上采取球果，剥出带壳种子后进行消毒；

2)将步骤1)所得无菌种子置于滤纸上吸干水分，剥出子叶胚后接入胚性愈伤组织诱导培养基中，诱导出胚性愈伤组织；胚性愈伤组织诱导培养基为DCR+2，4-D 4mg/L，6-BA1.0mg/L，谷氨酰胺0.4g/L，水解酪蛋白0.5g/L，活性炭2.5g/L和麦芽糖20g/L；

3)将步骤2)所得胚性愈伤组织接种至增殖培养基中进行增殖培养；增殖培养基为DCR+2，4-D 1mg/L+6-BA 0.2mg/L；

4)将继代培养2周、生长旺盛的胚性愈伤组织接种至250mL的无菌三角瓶中，固液比例1∶9进行摇瓶悬浮培养，23℃下暗培养，每7d继代一次；液体培养基为DCR+2，4-D 1mg/L+6-BA0.2mg/L，摇床转速为95r/min；

5)继代一次后，用移液枪吸取2mL悬浮液均匀涂于滤纸上，然后将滤纸移至体胚诱导培养基上，23℃下暗培养；体胚诱导培养基为DCR+VC 15mg/L+谷氨酰胺0.4mg/L+水解酪蛋白0.5g/L+活性炭2.0g/L+麦芽糖20g/L+凝胶3.0g/L+ABA浓度分别为8～12mg/L+PEG 190mg/L+GA浓度分别为1～5mg/L。

6)体胚诱导2个月后，将成熟体胚接种于光照培养室组培瓶中，以成苗培养基继续培养两个月后得到落羽杉小苗。

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