CN111802248B - 一种黄草乌胚状体的诱导培养方法 - Google Patents

一种黄草乌胚状体的诱导培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种黄草乌胚状体的诱导培养方法，该方法以黄草乌珠芽为外植体，珠芽消毒后先诱导出愈伤组织，从愈伤组织中选取颜色为带绿色的鹅黄色、分裂旺盛的胚性愈伤组织进行诱导培养，获得黄草乌胚状体，为黄草乌优质种苗的大量培育和快速繁殖提供了一条新途径，可有效解决当前黄草乌植物资源和种苗资源短缺，以及病害严重等问题。

Description

一种黄草乌胚状体的诱导培养方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种黄草乌胚状体的诱导培养方法。
背景技术
黄草乌（Aconitum vilmorinianum Kom.）为毛茛科乌头属多年生草质藤本植物，其块根有剧毒，具有祛风散寒、除湿止痛、解毒消肿等功效，常用于治疗跌打损伤、风湿痛、寒湿痹、手足厥冷、疮毒等症。黄草乌作为一种重要的中药材，长期以来主要以直接采挖野生资源供药用，遭到过度采挖，数量急剧减少。近年来，开始人工种植以解决资源匮缺的问题，主要采用种子繁殖、珠芽繁殖和小块根繁殖等方式。然而由于种子繁殖变异较大，而块根和珠芽繁殖后代的病害严重，因此，优质黄草乌种苗生产成为一个亟待解决的生产问题。胚状体诱导再生黄草乌植株，繁殖率高，病毒积累少，种苗健壮，可为黄草乌优质种苗生产提供一种新的途径。
胚状体是在植物细胞、组织或器官体外培养过程中，由一个或一些体细胞经过胚胎发生和发育过程，形成与合子胚相类似的结构，可进一步发育成植株。在体外，由体细胞可产生类似胚胎的结构，如某些植物以特定部位为外植体，通过组织培养，在特定条件下可能产生胚状体。胚状体的发育过程与合子胚类似，经过原胚、球形胚、心形胚、鱼雷形胚及子叶胚等几个阶段，在其发生的最早阶段就具有两极性，即根端（胚根）和茎端（胚芽），并且与母体细胞或外植体的维管束无直接连系，可以得到无病植株；说明胚状体一开始就是一个完整植物的雏形，可通过根端或类似胚柄结构从外植体或愈伤组织获取营养，也很容易从愈伤组织表面脱离下来，在适宜条件下长成新的植株，为快速生产种苗提供了新的途径。
艾洪莲等（2015）探讨了不同温度、激素和化学试剂对黄草乌种子发芽率和发芽指数的影响，20℃为黄草乌种子萌发的最适温度，GA3浸泡24h可显著提高种子的发芽率，5℃低温处理35d可显著缩短种子的萌发时间，适合大规模生产。沈芳晨（2018）以黄草乌种子为外植体，种子经75%酒精消毒30s，10% NaCl消毒30min，在MS+2.0mg/L 6-BA+0.1mg/LNAA芽诱导培养基中萌发，100mg/L浓度GA3对黄草乌种子进行打破休眠处理，摸索黄草乌种子萌发体系的最适培养条件。目前仅有利用黄草乌种子和珠芽进行扩繁的申请，如“用黄草乌种子进行扩繁的方法”（申请号CN201610666910.2）通过培育场地选择、场地平整操作和消毒处理、漂浮育苗系统，可有效避免黄草乌块根的使用，降低扩繁培育成本30～40%，提高黄草乌经济收益率；“黄草乌珠芽繁殖技术”（申请号CN201610031105.2）通过珠芽的分批采集，经贮藏、消毒、分级，可有效避免侧生块根繁殖不易保存、在保存过程中易发病及易引起连作带来的危害等一系列问题。目前还未见将黄草乌珠芽培养出原球茎胚性细胞后，再进一步由原球茎胚性细胞诱导培养出黄草乌胚状体的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种黄草乌胚状体的诱导培养方法，该方法利用黄草乌珠芽诱导培育出的黄草乌胚状体，黄草乌胚状体具有胚的特性，在适当的条件下可快速生长为再生的无病植株，能有效解决黄草乌生产中种苗短缺的问题，实现黄草乌优质种苗的快速繁殖。
本发明黄草乌胚状体的诱导培养方法包括以下步骤：
（1）珠芽选择：选择黄草乌生长健壮的植株，剪取叶腋间幼嫩的珠芽作为外植体；
（2）珠芽消毒：将步骤（1）选取的黄草乌珠芽在体积浓度75%的乙醇溶液中消毒20～60s，用无菌水清洗4～6次，然后放入质量浓度0.1%的HgCl2溶液中消毒10～15min，再用无菌水清洗4～6次，用无菌纸吸干水分；
（3）愈伤组织诱导：将步骤（2）消毒后的黄草乌珠芽接入固体培养基中，在培养温度为20～25℃、每天光照6～12h、光照强度2500～3500lx的条件下进行培养，培养15～25d，获得愈伤组织；
所述固体培养基配方为：MS培养基中添加2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）1.0～2.0mg/L、激动素（KT）0.1～0.5mg/L、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）1.0～3.0g/L、琼脂5.0～6.5g/L、蔗糖20～40g/L，培养基pH值为5.8～6.0；
（4）胚状体诱导：从步骤（3）愈伤组织中选取颜色为带绿色的鹅黄色、分裂旺盛的胚性愈伤组织，接入固体诱导培养基中，在培养温度为20～25℃、每天光照6～12h、光照强度2500～3500lx的条件下诱导产生胚状体；
所述固体诱导培养基配方为：MS培养基中添加2,4-D 1.5～1.8mg/L、KT 0.3～0.5mg/L、PVP 1.0～3.0g/L、琼脂5.0～6.5g/L、蔗糖20～40g/L，培养基pH值为5.8～6.0。
（5）胚状体培养：选取步骤（4）中获得的带绿色的胚状体，接入固体扩大培养基中，在培养温度为20～25℃、每天光照6～12h、光照强度2500～3500lx的条件下扩大培养胚状体；
所述MS培养基中添加2,4-D 1.0～1.5mg/L、KT 0.1～0.5mg/L、PVP 1.0～3.0g/L、琼脂5.0～6.5g/L、蔗糖20～40g/L，培养基pH值为5.8～6.0。
本发明采用组织培养技术，首先通过选取黄草乌珠芽和对黄草乌珠芽的消毒以及愈伤组织培养基和培养条件的筛选，培育出分裂能力强的愈伤组织，接着进行培养，诱导获得分裂能力强、颜色为带绿色的鹅黄色胚性愈伤组织，最后通过对胚性愈伤组织的培养获得黄草乌胚状体，为黄草乌优质种苗的大量培育和快速繁殖提供了一条新途径，可有效解决当前黄草乌植物资源和优质种苗资源短缺的问题。
附图说明
图1为黄草乌珠芽（图A）和珠芽培养状态图（图B）；
图2为黄草乌胚性愈伤组织诱导效果图；其中图A和图B为不同放大倍数；
图3为黄草乌胚状体诱导效果图；图中横箭头所指为胚性愈伤组织，竖箭头所指为胚状体；
图4为黄草乌植株诱导效果图；图A、图B为不同角度下的胚状体的幼芽；图C为胚状体诱导幼苗的芽（深色箭头）和根（浅色箭头）。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步说明，但这些实施例不得用于解释对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。
实施例1：本实施例提供的黄草乌胚状体培养方法包括以下步骤：
（1）珠芽选择：选择黄草乌生长健壮的植株，剪取叶腋间幼嫩的珠芽作为外植体（图1A）；
（2）珠芽消毒：将步骤（1）选取的黄草乌珠芽在75%的乙醇消毒30s，用无菌水清洗5次，然后放入0.1%的HgCl2溶液中消毒10min，再用无菌水清洗5次，用无菌纸吸干水分；
（3）愈伤组织诱导：如图1B所示，将步骤（2）消毒后的黄草乌珠芽接入固体培养基（MS培养基中添加2,4-二氯苯氧乙酸2.0mg/L、KT 0.5mg/L、PVP 1.5g/L、琼脂5.0g/L、蔗糖20g/L，培养基pH值为5.8）中，在培养温度为25℃、每天光照12h、光照强度3500lx的条件下进行培养，培养15d后统计，珠芽污染率为2.31%，褐化率为1.58%，愈伤组织诱导率为92.36%，结果见图2；
（4）胚状体诱导：从步骤（3）愈伤组织中选取颜色为带绿色的鹅黄色、分裂旺盛的胚性组织愈伤，接入固体诱导培养基（MS培养基中添加2,4-D 1.8mg/L、KT 0.5mg/L、PVP1.5g/L、琼脂5.0g/L、蔗糖20g/L，培养基pH值为5.8）中，在培养温度为25℃、每天光照12h、光照强度3500lx的条件下进行培养20d，胚状体的诱导率为76.21%，结果见图3；
（5）胚状体培养：选取步骤（4）中获得的带绿色的胚状体，接入固体扩大培养基（MS培养基中添加2,4-D 1.5mg/L、KT 0.5mg/L、PVP 1.5g/L、5.0g/L琼脂、蔗糖为20g/L，培养基pH值为5.8）中，在培养温度为25℃、每天光照12h、光照强度3500lx的条件下扩大培养胚状体（图4）；胚状体在培养基中可以直接产生完整的植株，避免了愈伤组织诱导芽，再诱导根的过程，提高组织培养的扩繁效率。
实施例2：本实施例提供的黄草乌胚状体培养方法包括以下步骤：
（1）珠芽选择：选择黄草乌生长健壮的植株，剪取叶腋间幼嫩的珠芽作为外植体；
（2）珠芽消毒：将步骤（1）选取的黄草乌珠芽在75%的乙醇消毒60s，用无菌水清洗6次，然后放入0.1%的HgCl2溶液中消毒15min，再用无菌水清洗5次，用无菌纸吸干水分；
（3）愈伤组织诱导：将步骤（2）消毒后的黄草乌珠芽接入固体培养基（MS培养基中添加2,4-D 1.5mg/L、KT 0.3mg/L、PVP 1.5g/L、琼脂5.5g/L、蔗糖30g/L，培养基pH值为5.8）中，在培养温度为25℃、每天光照12h、光照强度3500lx的条件下进行培养，培养15d后统计，珠芽污染率为0%，褐化率为0%，愈伤组织诱导率为87.25%；
（4）胚状体诱导：从步骤（3）愈伤组织中选取颜色为带绿色的鹅黄色、分裂旺盛的胚性愈伤组织，接入固体诱导培养基（MS培养基中添加2,4-D 1.8mg/L、KT 0.5mg/L、PVP1.5g/L、琼脂5.5g/L、蔗糖30g/L，培养基pH值为5.8）中，在培养温度为25℃、每天光照12h、光照强度3500lx的条件下进行培养20d，胚状体的诱导率为74.13%；
（5）胚状体培养：选取步骤（4）中获得的带绿色的胚状体，接入固体扩大培养基（MS培养基中添加2,4-D 1.5mg/L、KT 0.5mg/L、PVP 1.5g/L、琼脂5.5g/L、蔗糖30g/L，培养基pH值为5.8）中，在培养温度为25℃、每天光照12h、光照强度3500lx的条件下扩大培养胚状体；胚状体在培养基中可以直接产生完整的植株，避免了愈伤组织诱导芽，再诱导根的过程，提高组织培养的扩繁效率。
实施例3：本实施例提供的黄草乌胚状体培养方法包括以下步骤：
（1）珠芽选择：选择黄草乌生长健壮的植株，剪取叶腋间幼嫩的珠芽作为外植体；
（2）珠芽消毒：将步骤（1）选取的黄草乌珠芽在75%的乙醇消毒50s，用无菌水清洗4次，然后放入0.1%的HgCl2溶液中消毒12min，再用无菌水清洗6次，用无菌纸吸干水分；
（3）愈伤组织诱导：将步骤（2）消毒后的黄草乌珠芽接入固体培养基（MS培养基中添加2,4-D 1.0mg/L、KT 0.1mg/L、PVP 1.5g/L、琼脂6.0g/L、蔗糖35g/L，培养基pH值为5.8）中，在培养温度为23℃、每天光照10h、光照强度3000lx的条件下进行培养，培养20d后统计，珠芽污染率为0%，褐化率为0%，愈伤组织诱导率为62.41%；
（4）胚状体诱导：从步骤（3）愈伤组织中选取颜色为带绿色的鹅黄色、分裂旺盛的胚性愈伤组织，接入固体诱导培养基（MS培养基中添加2,4-D 2.0mg/L、KT 0.5mg/L、PVP1.5g/L、琼脂6.0g/L、蔗糖35g/L，培养基pH值为5.8）中，在培养温度为23℃、每天光照10h、光照强度3000lx的条件下进行培养20d，胚状体的诱导率为71.82%；
（5）胚状体培养：选取步骤（4）中获得的带绿色的胚性组织愈伤，接入固体扩大培养基（MS培养基中添加2,4-D 1.5mg/L、KT 0.5mg/L、PVP 1.5g/L、琼脂6.0g/L、蔗糖为35g/L，培养基pH值为5.8）中，在培养温度为23℃、每天光照10h、光照强度3500lx的条件下扩大培养胚状体；胚状体在固体扩大培养基中可以直接产生完整的植株，避免了愈伤组织诱导芽，再诱导根的过程，提高组织培养的扩繁效率。
实施例4：本实施例提供的黄草乌胚状体培养方法包括以下步骤：
（1）珠芽选择：选择黄草乌生长健壮的植株，剪取叶腋间幼嫩的珠芽作为外植体；
（2）珠芽消毒：将步骤（1）选取的黄草乌珠芽在75%的乙醇消毒40s，用无菌水清洗5次，然后放入0.1%的HgCl2溶液中消毒11min，再用无菌水清洗6次，用无菌纸吸干水分；
（3）愈伤组织诱导：将步骤（2）消毒后的黄草乌珠芽接入固体培养基（MS培养基中添加2,4-D 1.5mg/L、KT 0.5mg/L、PVP 1.0g/L、琼脂6.0g/L、蔗糖为25g/L，培养基pH值为5.8）中，在培养温度为20℃、每天光照10小时、光照强度3000lx的条件下进行培养，培养20d后统计，珠芽污染率为0%，褐化率为0%，愈伤组织诱导率为93.17%；
（4）胚状体诱导：从步骤（3）愈伤组织中选取颜色为带绿色的鹅黄色、分裂旺盛的胚性愈伤组织，接入固体诱导培养基（MS培养基中添加2,4-D 1.5mg/L、KT 0.3mg/L、PVP2.0g/L、琼脂6.0g/L、蔗糖25g/L，培养基pH值为5.8）中，在培养温度为20℃、每天光照12h、光照强度2500lx的条件下进行培养20d，胚状体的诱导率为61.25%；
（5）胚状体培养：选取步骤（4）中获得的带绿色的胚性组织愈伤，接入固体扩大培养基（MS培养基中添加2,4-D 1.5mg/L、KT 0.4mg/L、PVP 2.5g/L、琼脂6.0g/L、蔗糖25g/L，培养基pH值为5.8）中，在培养温度为20℃、每天光照12h、光照强度3500lx的条件下扩大培养胚状体；胚状体在培养基中可以直接产生完整的植株，避免了愈伤组织诱导芽，再诱导根的过程，提高组织培养的扩繁效率。
实施例5：本实施例提供的黄草乌胚状体培养方法包括以下步骤：
（1）珠芽选择：选择黄草乌生长健壮的植株，剪取叶腋间幼嫩的珠芽作为外植体；
（2）珠芽消毒：将步骤（1）选取的黄草乌珠芽在75%的乙醇消毒40s，用无菌水清洗5次，然后放入0.1%的HgCl2溶液中消毒11min，再用无菌水清洗6次，用无菌纸吸干水分；
（3）愈伤组织诱导：将步骤（2）消毒后的黄草乌珠芽接入固体培养基（MS培养基中添加2,4-D 2.0mg/L、KT 0.2mg/L、PVP 3.0g/L、琼脂5.0g/L、蔗糖为25g/L，培养基pH值为6.0）中，在培养温度为25℃、每天光照12h、光照强度3500lx的条件下进行培养，培养15d后统计，珠芽污染率为0%，褐化率为0%，愈伤组织诱导率为91.83%；
（4）胚状体诱导：从步骤（3）愈伤组织中选取颜色为带绿色的鹅黄色、分裂旺盛的胚性愈伤组织，接入固体诱导培养基（MS培养基中添加2,4-D 1.0mg/L、KT 0.1mg/L、PVP2.0g/L、琼脂6.0g/L、蔗糖25g/L，培养基pH值为6.0）中，在培养温度为25℃、每天光照12h、光照强度3500lx的条件下进行培养20d，胚状体的诱导率为40.18%；
（5）胚状体培养：选取步骤（4）中获得的带绿色的胚性组织愈伤，接入固体扩大培养基（MS培养基中添加2,4-D 1.5mg/L、KT 0.5mg/L、PVP 1.5g/L、琼脂5.0g/L、蔗糖20g/L，培养基pH值为6.0）中，在培养温度为25℃、每天光照12h、光照强度3500lx的条件下扩大培养胚状体；胚状体在培养基中可以直接产生完整的植株，避免了愈伤组织诱导芽，再诱导根的过程，提高组织培养的扩繁效率。

Claims (1)

1.一种黄草乌胚状体的诱导培养方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）珠芽选择：选择黄草乌生长健壮的植株，剪取叶腋间幼嫩的珠芽作为外植体；
（2）珠芽消毒：将步骤（1）选取的黄草乌珠芽在体积浓度75%的乙醇溶液中消毒20～60s，用无菌水清洗4～6次，然后放入质量浓度0.1%的HgCl2溶液中消毒10～15min，再用无菌水清洗4～6次，用无菌纸吸干水分；
（3）愈伤组织诱导：将步骤（2）消毒后的黄草乌珠芽接入固体培养基中，在培养温度为20～25℃、每天光照6～12h、光照强度2500～3500lx的条件下进行培养，培养15～25d，获得愈伤组织；
所述固体培养基配方为：MS培养基中添加2,4-二氯苯氧乙酸1.0～2.0mg/L、激动素0.1～0.5mg/L、聚乙烯吡咯烷酮1.0～3.0g/L、琼脂5.0～6.5g/L、蔗糖20～40g/L，培养基pH值为5.8～6.6；
（4）胚状体诱导：从步骤（3）愈伤组织中选取颜色为带绿色的鹅黄色、分裂旺盛的胚性愈伤组织，接入固体诱导培养基中，在培养温度为20～25℃、每天光照6～12h、光照强度2500～3500lx的条件下诱导产生胚状体；
所述固体诱导培养基配方为：MS培养基中添加2,4-二氯苯氧乙酸1.5～1.8mg/L、激动素0.3～0.5 mg/L、聚乙烯吡咯烷酮1.0～3.0g/L、琼脂5.0～6.5g/L、蔗糖20～40g/L，培养基pH值为5.8～6.0；
（5）胚状体培养：选取步骤（4）中获得的带绿色的胚状体，接入固体扩大培养基中，在培养温度为20～25℃、每天光照6～12h、光照强度2500～3500lx的条件下扩大培养胚状体；
所述固体扩大培养基配方为：MS培养基中添加2,4-二氯苯氧乙酸1.0～1.5mg/L、激动素0.1～0.5mg/L、聚乙烯吡咯烷酮1.0～3.0g/L、琼脂5.0～6.5g/L、蔗糖20～40g/L，培养基pH值为5.8～6.0。
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