CN101112177A - 固体-液体交替培养诱导杂交鹅掌楸液体悬浮细胞体胚高频发生与植株再生方法 - Google Patents

Abstract

一种固体－液体交替培养诱导杂交鹅掌楸液体悬浮细胞体胚高频发生与植株再生方法，分离获得球形期至子叶期的未成熟合子胚后，分别经过胚性愈伤诱导阶段、胚性愈伤组织增殖阶段、胚性愈伤组织悬浮细胞系的建立和预增殖阶段、胚性悬浮细胞增殖阶段、胚性悬浮细胞增殖中止和原胚形成阶段、体细胞胚发育阶段和体胚植株再生阶段后，高效获得杂交鹅掌楸再生植株。

Description

固体-液体交替培养诱导杂交鹅掌楸液体悬浮细胞体胚高频发生与植株再生方法

一、技术领域

本发明属林业中的通过组织培养的植物再生技术领域，具体涉及一种固体-液体交替培养诱导杂交鹅掌楸液体悬浮细胞体胚高频发生与植株再生技术。

二、背景技术

鹅掌楸，又称马褂木、鸭脚木、九层皮、枫荷树等，是木兰科(MagnoLiaceae)鹅掌楸属(Liriondendron)的植物。该属现在仅存两种，一种是分布于我国中、北亚热带地区(从东部的浙江、福建延伸到西南部的云南、中越边界)的中国鹅掌楸(L.chinense[Hemsl.] Sarg.)，另一种是分布于美国东部的北美鹅掌楸(L.tulipifera L.)。鹅掌楸属植物在被子植物分类地位中处于较原始的位置。虽然分布区广，但目前多呈小群体分布。其中分布于中国境内的鹅掌楸已被列为国家二级珍稀濒危保护树种。

中国鹅掌楸干形通直、树形美观；叶形奇特，叶片宽大，微凹，两侧有一裂片，先端截形，叶形俨然如中国古装马褂一般，故俗称马褂木；春天枝条顶端开淡黄色大型花朵，其状如杯似碗，光灿悦目，观赏价值高；果实圆锥形，亦极美观。该树种对二氧化硫和氯气有较强的抗性，广泛用于园林绿化。另外，鹅掌楸属植物木材淡红褐色，纹理通直，色泽美观，结构细密，材质轻软，刨面光洁，适合于用作胶合板、纸浆、家具以及室内装饰用材，也可用于建筑、造船等，经济价值极高，因此也是重要的用材树种。

作为世界珍稀名贵观赏风景树的北美鹅掌楸，同样树姿挺秀，叶形美丽，树形端正，树序整齐，花大而美。老龄树枝条平展，或微向下垂。每届花期，琼英压树，翠帷覆地，绮丽优雅。

叶培忠[1899～1978]教授于1963年首次选用中国鹅掌楸和北美鹅掌楸为亲本进行正、反交组合人工杂交，育成种间杂种杂交鹅掌楸(L.chinense[Hemsl.]Sarg.×L.tulipifera L.和L.tulipiferaL.×L.chinense[Hemsl.]Sarg)；1970年开始进行杂交鹅掌楸正、反交组合苗木栽培对比。试验表明，种间杂交后代具有明显的杂交优势，不仅树形比亲本更加通直，花叶更加幽丽，媲美众芳，俯视众卉，而且生长也更加迅速。如栽植于浙江富阳中国林科院亚林所的杂交鹅掌楸，25年生时树高达21m，胸径达63.7cm；另据北京市园林局将杂交鹅掌楸作城市行道树试种，在北京地区表现出耐寒性强，生长迅速的特点；同时该树种无其他树种果毛、花絮飞散造成的空气污染之弊。因此，林业上对优质杂交鹅掌楸苗木的需求相当迫切。

但鹅掌楸的天然结实率很低，亲本和杂交新种均仅有1％左右，有性繁殖能力差；鹅掌楸的扦插技术要求很高，扦插周期长、成活率低，无性繁殖困难。因此，目前的种苗繁殖技术无法满足大面积植树造林的需要。

体细胞胚胎发生及其植株再生技术是20世纪90年代形成的高新林业生物技术的重要内容之一，可用于优良品种的大规模工业化繁殖和用于遗传转化体系的建立。体细胞胚，是指二倍体或单倍体细胞在未经性细胞融合的过程，模拟合子胚发生的各个阶段而发育形成一个新的个体的形态发生和重建过程。在正常情况下有些植物的珠心组织或助细胞也可自发产生体细胞胚。在大量的组织培养过程中，许多离体培养的细胞、组织和器官，形成类似胚的结构。这种经体细胞胚发生而形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构被称之为体细胞胚或胚状体。无性胚状体可以像有性胚那样在一定的条件下发育成完整的植株。胚状体按其来源可分为两类：一类是由普通植物孢子体的各种器官的二倍体体细胞产生而来，通常称为体细胞胚；另一类是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的胚状体，通常简称为花粉胚，可发育成单倍体植株，但一般必须进行染色体加倍才能正常开花结实。另外，在一些植物中也可从胚乳培养得到胚状体，但未能成功地由胚状体发育成植株。朱微认为胚状体的定义包括三点含义：

1.胚状体是组织培养的产物，只限于在组织培养范围内使用，区别于无融合生殖的胚；

2.胚状体起源于非合子细胞，区别于合子胚；

3.胚状体的形成经历胚胎发育的过程，区别于与组织培养中分化的芽体。

1902年Haberlandt提出植物细胞的全能性观点，即每一个细胞都能不断分裂，进而形成完整的植株.Steward(1958)和Reincrt(1959)差不多同时发现，培养的胡萝卜根细胞产生一种与胚相似的结构，并观察到由这种结构长成完整的植株。从而证明Haberlandt关于细胞全能性概念的正确性。此后，植物学家对此进行了广泛的研究，并已在许多植物中利用不同的器官、组织、细胞和原生质体进行培养得到了体细胞胚。成功获得体细胞胚的有裸子植物、双子叶植物和单子叶植物。林木体细胞胚胎发生研究始于20世纪七十年代后期，八十年代后期迅速发展，并获得极大成功。全世界目前已有40多种木本植物获得了体细胞胚，尤其是用常规无性繁殖技术很难生根的针叶树的体胚发生取得了令人瞩目的进展。据初步统计，已从冷杉属、落叶松属、云杉属、松属、黄杉属和北美红杉属的至少20种不同的针叶树的外植体诱导成功了体细胞胚。在阔叶树种上，柳属、杨属、栗属、檀香属、枫香属、鹅掌楸属、榛属、栎属、板栗属、山茶属、桉树属、七叶树属、柑橘属、柚木、可可、油橄榄、橡胶、泡桐等20多个树种的组织培养中观察到体细胞胚胎发生或获得再生植株。其中，美国的惠豪公司、国际纸业公司、维斯瓦库公司和加拿大的一些公司、新西兰林业研究中心等已分别将火炬松、挪威云杉、花旗松和辐射松等树种的体细胞胚诱导和植株再生应用于生产实践。仅新西兰一家公司就形成了年产200万株辐射松体细胞胚再生植株的能力。中国科学院于1988年以华北云杉为实验材料，将幼胚产生的愈伤组织诱导出的体细胞胚胎发育成小苗。黑龙江农大(1993)进行黑穗醋粟末受精胚珠培养，成功诱导体细胞胚胎和植株。四川农大王米力等(1996)用尾叶桉种子下胚轴诱导体细胞胚胎发生，获得根苗齐全的再生植株。南京林业大学施季森、陈金慧等(一种杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生与植株再生技术CNZL 02112948.7)用杂交鹅掌楸未成熟胚通过固体培养的方式，成功诱导体细胞胚胎的发生，得到完整的植株。

目前研究人员诱导体细胞胚胎发生主要利用植物体的各种器官，如根、茎、叶、花、果实、种子、子房中的胚珠、雄蕊的花丝、花药及花粉等。但S.Merkle(1996)认为，树木的胚性培养只能来源于种子或幼苗，合子胚或种子的发育程度是很重要的，在许多树种的研究中表明，未成熟种子比成熟种子或幼苗有更高的诱导潜能。

组织培养诱导脱分化都主要通过2.4-D来诱导。在多篇文献中报道2，4-D能抑制胚状体的产生和发育，因此在诱导脱分化后必须降低或去掉2，4-D，胚性细胞才能正常发育.HaLperin(1970)取胡萝卜的叶柄切段，培养于添加不同激素成分的琼脂培养基上，然后移至不加任何激素的基本培养基上(仅有无机盐、蔗糖及维生素B1)，以检查对胚状体形成的影响。结果表明：

1.促进胚性愈伤组织增殖的培养及其激素成分并不促进胚状体的分化；去除培养基中的2，4-D，则使胚状体形成；加入BA，组织增殖速度增加，但抑制了转移培养基上后胚状体的形成，并且一旦胚状体原始细胞形成后，BA对其发育成胚状体毫无影响。

2.加入赤霉素，完全抑制其后胚状体的分化。

3.细胞增殖过程中的激素环境对下一步器官分化有着明显的影响。

实验结果表明，2，4-D通过改变细胞内源IAA代谢而起作用，在水稻的早期胚性愈伤组织中，用ELISA酶联免疫分析证明胚性细胞出现时伴有较高的内源IAA水平，并且在胚性细胞转换时期添加外源IAA对胚性细胞出现有一定诱导效果。

渗透剂在林木体胚发生的各个阶段都发挥着重要作用。总的说来，渗透剂都是高度水合性的多羟基分子，包括单糖、多糖、己糖醇和环多醇。环多醇是六碳环的羟基复合物，较常用的环多醇有肌醇及其立体异构体肌醇等。蔗糖和葡萄糖是常用的两种糖类渗透剂，山梨醇、D-甘露醇和半乳糖醇的直链醇形式、乙二醇如聚乙二醇和聚丙二醇也可用作渗透剂。唐巍(1998)在火炬松的胚性愈伤组势诱导和植株再生的研究中，加入9000mg/L肌醇提高渗透压，以促进后期胚的发育。黄健秋(1995)将马尾松的早期原胚转至含9000mg/L肌醇的DCR培养基上，形成后期原胚。可见，体胚形成过程中适当提高渗透压可促进体胚形成。

在植物组织培养中，诱导体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有显著的特点：

1.具有两极性：在体细胞胚发生早期就具有胚根和胚芽两极，胚性细胞分裂多为不均等分裂，形成顶细胞和基细胞，其后有较小的顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，而较大的基细胞进行少数几次分裂成为胚柄部分，在形态上具有明显的极性。

2.存在生理隔离：体细胞胚形成后与母体植物或外植体的维管束系统联系较少，即出现所谓生理上的隔离现象。胚性细胞细胞壁加厚，与其它细胞分开，周围细胞处于解体状态，表明体细胞胚与合子胚相似，从一开始就是完整的植物体的雏形。

3.遗传相对稳定：通过体细胞胚形成的再生植株的变异性小于器官发生途径形成的再生植株，因为只有那些未经过畸变的细胞或变异较少的细胞团才能形成体细胞胚，实现全能型表达。

4.重演受精卵形态发生的特征：植物组织培养中形态发生的几种方式，虽然都是植物细胞全能性的具体表现，但体细胞胚胎发生途径是细胞全能型表达最完全的一种方式，它不仅表明植物体细胞具有全套遗传信息，而且重演了合子胚形态发生的进程。

植物组织培养中诱导体细胞胚发生途径可归纳为两种：直接途径与间接途径。直接途径就是从外植体某些部位直接诱导脱分化出体细胞胚，如槐树子叶在切口处产生愈伤组织的同时，在子叶组织中分化产生体细胞胚。间接途径通过脱分化形成愈伤组织后，再从愈伤组织的某些细胞分化出体细胞胚。大多数植物的体细胞胚胎发生多通过间接途径进行，在愈伤组织中某些体细胞转化为胚性细胞、胚性细胞继续分裂形成多细胞原胚以及不同发育时期的体细胞胚，如经过球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚而发育成小苗。

体细胞胚胎发生由于能在更短的时间内得到更多的无性繁殖体，以及获得更大的遗传增益，并且由于体胚发生培养物也是分离原生质体的重要来源，可用于林木的遗传转化以及体细胞杂交研究，在理论与应用研究中具有重要的作用。利用悬浮细胞诱导产生体细胞胚胎具有数量多、速度快、结构完整等显著特点，同时可以节约大量的试验场地，缩短培养时间，因而特别适合植物的大量繁殖。由于易在体外培养，并且可以比较体外非合子胚与种子的合子胚的异同，所以广泛用于研究植物体的生长发育过程。在基因工程研究中，将分离到的基因导入单个胚性细胞中，由这个胚性细胞长成植株的组织中，就含有整合进去的基因。

目前有关植物组织培养技术的各类文献中，除美国有北美鹅掌楸(Litiondendron tulipifera L.)组培相关专利技术的报导外和陈金慧通过固体培养诱导出杂交鹅掌楸(Liriondeadroa hybrid)体细胞胚胎的相关专利技术的报导外，尚未见有杂交鹅掌楸悬浮细胞诱导体细胞胚胎发生的成套技术发表。

三、发明内容

本发明的目的是，寻找新的杂交鹅掌楸组织培养方法，实现杂交鹅掌楸苗木的更大规模、短周期和高效生产。

本发明的技术解决方案为：一种固体-液体交替培养诱导杂交鹅掌楸液体悬浮细胞体胚高频发生与植株再生方法，其特征在于：采集人工杂交授粉发育的杂交鹅掌楸聚合翅果，在无菌条件下，分离球形期至子叶期的未成熟合子胚，按以下顺序和条件进行诱导、培养获得杂交鹅掌楸植株：

a.胚性愈伤诱导阶段，诱导培养基采用1/2 MS基本培养基；

b.胚性愈伤组织的增殖阶段，培养基采用1/2 MS基本固体培养基；

c.胚性愈伤组织悬浮细胞系的建立和预增殖阶段，培养基采用MS基本液体培养基；

d.胚性悬浮细胞的增殖阶段，培养基采用MS基本液体培养基；

e.胚性悬浮细胞增殖中止和原胚形成阶段，培养基采用MS改良液体培养基；

f.体细胞胚发育阶段，培养基采用MS改良固体培养基；

g.体胚植株再生阶段，培养基采用MS改良固体培养基。

除体胚植株再生阶段可直接使用MS改良固体培养基以外，不同培养阶段使用的不同形态培养基中，还可加入适当的添加剂，具体添加物质和用量如下：

a.胚性愈伤诱导阶段：1/2MS基本培养基，附加浓度为0.4～5.0mg/L的2，4-D，0～0.6mg/L的6-苄胺基嘌呤，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C，调pH为5.7；

b.胚性愈伤组织的增殖阶段，采用1/2MS基本固体培养基，附加浓度为0～0.5mg/L的2，4-D，0～0.25mg/L的6-苄胺基嘌呤，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和L～5mg/L的维生素C，调pH为5.7；

c.胚性愈伤组织悬浮细胞系的建立和预增殖阶段，采用MS基本液体培养基，附加蔗糖25～60g/L，0～2.5mg/L的2，4-D，0～0.25mg/L的6-苄胺基嘌呤，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C，调pH为5.7；

d.胚性悬浮细胞的增殖阶段，采用MS基本液体培养基，附加浓度为1.0～10.0mg/L的ABA，0～5.0mg/L的GA，蔗糖20～60g/L，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C，调pH为5.7；

e.胚性悬浮细胞增殖中止和原胚形成阶段，采用MS改良液体培养基，附加浓度为1.0～10.0mg/L的ABA，0～5.0mg/L的GA，蔗糖20～60g/L，1～5mg/L的维生素C，调pH为5.7；

f.体细胞胚发育阶段，采用MS改良固体培养基，附加浓度为1.0～10.0mg/L的ABA，0～5.0mg/L的GA，蔗糖20～60g/L，1～5mg/L的维生素C，琼脂5g/L，调pH为5.7。

附：MS基本培养基(Murashing and Skoog medium)标准配方：

            NH₄NO₃            1650mg/l

            KNO₃              1900mg/l

            CaCl₂·2H₂O       440mg/l

            MgSO₄·7H₂O       370mg/l

            KH₂PO₄            170mg/l

            KI                0.83mg/l

            H₃BO₃             6.2mg/l

            MnSO₄·H₂O        16.9mg/l

            ZnSO₄·7H₂O       8.6mg/l

            Na₂MoO4·2H₂O     0.25mg/l

            CuSO₄·5H₂O       0.025mg/l

            CoCl₂·6H₂O       0.025mg/l

            FeSO₄·7H₂O       27.8mg/l

            Na₂-EDTA          37.3mg/l

            肌醇              100mg/l

            烟酸              0.5mg/l

            盐酸硫胺素        0.1mg/l

            盐酸吡哆醇        0.5mg/l

            甘氨酸            2mg/l

在该标准配方中添加使用肌醇50mg/L，即可获得MS基本固体培养基；

在该标准配方中添加使用KNO₃ 1000mg/L，即可获得MS改良固体培养基；

在该标准配方中添加使用肌醇100mg/L，即可获得MS基本液体培养基；

在该标准配方中添加使用KNO₃ 1000mg/L，CaNO₃ 500mg/L，即可获得MS改良液体培养基。

本发明与现有技术相比，其显著优点是极大的提高了杂交鹅掌楸的再生效率和繁殖系数，为工业化快速繁殖杂交鹅掌楸苗木提供了一种新方法。

四、附图说明

图1为在预增殖阶段悬浮细胞的状态；

图2为在胚性悬浮细胞增殖和产生阶段悬浮细胞的形态，其中a为胚性细胞开始横向和纵向分裂，极性形成，b为胚性细胞开始分裂；

图3为在胚性悬浮细胞增殖中止和原胚形成阶段悬浮细胞的状态；

图4为在体细胞胚发育阶段的状态，下部两个小图为局部放大图；

图5为体细胞胚胎的再生植株，其中a为移栽前的试管苗，b为移栽后的露地苗。

五、具体实施方式

未成熟胚的制取方法

选定父、母本优良植株。四月底到五月初，在盛花期的母株上选择花冠顶端微微松动、雌蕊柱头布满粘液和晶莹亮点而即将开放的花蕾、剥开花瓣去雄，然后用镊子从父本花朵上夹下雄蕊，从上到下轻轻触动雌蕊柱头，直到柱头上涂满一层金黄色的花粉为止，最后将花瓣合拢。授粉两个月后(7月盛夏时)收集聚合翅果。

将采下的聚合翅果于4℃条件下低温冷藏10天，剖开且剪去种翅。用洗洁精清洗种子，以除去其表面的油污，自来水冲洗30分钟，蒸馏水冲洗3次，75％的乙醇处理40秒，0.1％的氯化汞处理4分钟，无菌水冲洗4次。无菌状态下，剥去种皮获得未成熟胚，将未成熟胚接入诱导培养基。

a.胚性愈伤诱导阶段

未成熟胚接入诱导培养基后进入胚性愈伤诱导阶段，诱导培养基采用MS基本培养基，附加激素是浓度分别为2，4-D 0.5-4.0mg/L。添加500-1200mg/L的天然复合物水解酪蛋白。维生素C 5mg/L，蔗糖4％，琼脂0.65％，灭菌前将诱导培养基(下同)调至pH5.7，121℃高温、高压灭菌16分钟，培养温度23-27℃，黑暗条件下培养，每二十天继代培养一次。

b.胚性愈伤组织的增殖阶段

阶段a胚性愈伤组织，1/2MS基本固体培养基，附加浓度为0～0.5mg/L的2，4-D，0～0.25mg/L的6-苄胺基嘌呤，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C，调pH为5.7；暗培养温度为23-25℃，培养时间：10～14天；

c.胚性愈伤组织悬浮细胞系的建立和预增殖阶段

将获得的胚性愈伤组织放入50mL MS基本液体培养基，蔗糖浓度控制为25～60g/L，附加浓度为0～2.5mg/L的2，4-D，0～0.25mg/L的6-苄胺基嘌呤，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C的培养基中，灭菌前将培养基调至pH5.7；摇床转速为70-100r.p.m，暗培养温度为23-25℃，培养时间：10～14天；

附图1为在预增殖阶段悬浮细胞的状态。

d.胚性悬浮细胞的增殖和产生阶段

将c阶段获得的悬浮细胞沉淀后，弃上清液，悬浮细胞转入MS基本液体培养基，附加浓度为1.0～10.Om9/L的ABA，0～5.0mg/L的GA，蔗糖20～60g/L，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C的培养基中，灭菌前将培养基调至pH5.7；摇床转速为70-100r.p.m，暗培养温度为23-25℃，培养时间：10～14天；

附图2为在胚性悬浮细胞增殖和产生阶段悬浮细胞的形态。

e.胚性悬浮细胞增殖中止和原胚形成阶段

把d阶段获得的悬浮细胞沉淀后，弃上清液，悬浮细胞转入MS改良液体培养基；附加浓度为1.0～10.0mg/L的ABA，0～5.0mg/L的GA，蔗糖20～60g/L，1～5mg/L的维生素C，灭菌前将pH调至pH5.7；摇床转速为70-100r.p.m，暗培养温度为23-25℃，培养时间：10～14天；

附图3为在胚性悬浮细胞增殖中止和原胚形成阶段悬浮细胞的状态。

f.体细胞胚发育阶段

e阶段的悬浮细胞沉淀后，弃上清液，将悬浮细胞转入MS改良固体培养基；附加浓度为1.0～10.0mg/L的ABA，0～5.0mg/L的GA，蔗糖20～60g/L，1～5mg/L的维生素C，灭菌前将pH调至pH5.7，琼脂5g/L；暗培养温度为23-25℃；球形胚形成以后，转入MS改良培养基使其继续发育，球形胚经过近两个月，依次经过球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚阶段，直至得到体细胞胚。

附图4为在体细胞胚发育阶段的状态。

g.体胚植株再生阶段

将获得的体细胞胚放入MS改良固体培养基中在正常光照培养条件下继续培养，且降低蔗糖浓度为25g/L，直至体细胞胚萌发再生成植株。

附图5为体细胞胚胎的再生植株。

h.移苗定植阶段

体胚发芽后，瓶苗长至2厘米高，且根叶发达时，从瓶中取出；洗去幼苗根部培养基，植入主要由珍珠岩构成的基质中。移苗后一周内湿度保持在95～100％，一个月内的管理要特别细致，注意湿度与温度的协调。移苗后一个星期，即可按常规苗木栽培工艺进行定植。

采用本发明提供的的方法，由于胚性悬浮细胞的产生和增殖潜力大，繁殖效率可在“一种杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生与植株再生技术(CNZL02112948.7)”单纯依靠体细胞胚再生植株的基础上提高200％以上，为大规模、快速繁殖杂交鹅掌楸提供了一种更为高效的方法。

Claims (2)

1.一种固体-液体交替培养诱导杂交鹅掌楸液体悬浮细胞体胚高频发生与植株再生方法，其特征在于：采集人工杂交授粉发育的杂交鹅掌楸聚合翅果，在无菌条件下，分离球形期至子叶期的未成熟合子胚，按以下顺序和条件进行诱导、培养获得杂交鹅掌楸植株：

a.胚性愈伤诱导阶段，诱导培养基采用1/2 MS基本培养基；

b.胚性愈伤组织的增殖阶段，培养基采用1/2 MS基本固体培养基；

c.胚性愈伤组织悬浮细胞系的建立和预增殖阶段，培养基采用MS基本液体培养基；

d.胚性悬浮细胞的增殖阶段，培养基采用MS基本液体培养基；

e.胚性悬浮细胞增殖中止和原胚形成阶段，培养基采用MS改良液体培养基；

f.体细胞胚发育阶段，培养基采用MS改良固体培养基；

g.体胚植株再生阶段，培养基采用MS改良固体培养基。

2.如权利要求1所述的固体-液体交替培养诱导杂交鹅掌楸液体悬浮细胞体胚高频发生与植株再生方法，其特征在于不同培养阶段使用的不同形态培养基中，还可加入适当的添加剂，具体添加物质和用量如下：

a.胚性愈伤诱导阶段：1/2MS基本培养基，附加浓度为0.4～5.0mg/L的2，4-D，0～0.6mg/L的6-苄胺基嘌呤，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C，调pH为5.7；

b.胚性愈伤组织的增殖阶段，采用1/2 MS基本固体培养基，附加浓度为0～0.5mg/L的2，4-D，0～0.25mg/L的6-苄胺基嘌呤，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和L～5mg/L的维生素C，调pH为5.7；

c.胚性愈伤组织悬浮细胞系的建立和预增殖阶段，采用MS基本液体培养基，附加蔗糖25～60g/L，0～2.5mg/L的2，4-D，0～0.25mg/L的6-苄胺基嘌呤，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C，调pH为5.7；

d.胚性悬浮细胞的增殖阶段，采用MS基本液体培养基，附加浓度为1.0～10.0mg/L的ABA，0～5.0mg/L的GA，蔗糖20～60g/L，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C，调pH为5.7；

e.胚性悬浮细胞增殖中止和原胚形成阶段，采用MS改良液体培养基，附加浓度为1.0～10.0mg/L的ABA，0～5.0mg/L的GA，蔗糖20～60g/L，1～5mg/L的维生素C，调pH为5.7；

f.体细胞胚发育阶段，采用MS改良固体培养基，附加浓度为1.0～10.0mg/L的ABA，0～5.0mg/L的GA，蔗糖20～60g/L，1～5mg/L的维生素C，琼脂5g/L，调pH为5.7。

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