CN1140166C - 杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生与植株再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生与植株再生方法。鹅掌楸属种间杂交在生长、抗逆性和观赏性方面具有明显的优势。但鹅掌楸天然结实率低，有性繁殖能力差；扦插技术要求高，成活率也很低，不能满足生产应用的需要。本发明的特征是在鹅掌楸属杂交亲本选择和种间杂交育种的基础上，分别将正交、反交和回交制种所得数量有限的未成熟胚进行体细胞胚胎发生的诱导和培养，形成大量同步发育的体细胞胚，进而将体细胞胚培育成为完整的植株。利用本发明所提供的方法，可实现杂交鹅掌楸苗木的大规模、短周期、高繁殖率、低成本的工厂化生产和产业化开发。
Description
一、技术领域
本发明属林业行业中的细胞工程种苗繁育技术领域。
二、背景技术
鹅掌楸，又称马褂木、鸭脚木、九层皮、枫荷树等，是木兰科(Magnoliaceae)鹅掌楸属(Liriondendron)的植物。该属现在仅存两种，一种是分布于我国中、北亚热带地区(从东部的浙江、福建延伸到西南部的云南、中越边界)的中国鹅掌楸(L.chinense[Hemsl.]Sarg.)，另一种是分布于美国东部的北美鹅掌楸(L.tulipifera L.)。鹅掌楸属植物在被子植物分类地位中处于较原始的位置。虽然分布区广，但目前多呈小群体分布。其中分布于中国境内的鹅掌楸已被列为国家二级珍稀濒危保护树种。
中国鹅掌楸干形通直、树形美观；叶形奇特，叶片宽大，微凹，两侧有一裂片，先端截形，叶形俨然如中国古装马褂一般，故俗称马褂木；春天枝条顶端开淡黄色大型花朵，其状如杯似碗，光灿悦目，观赏价值高；果实圆锥形，亦极美观。该树种对二氧化硫和氯气有较强的抗性，广泛用于园林绿化。另外，鹅掌楸属植物木材淡红褐色，纹理通直，色泽美观，结构细密，材质轻软，刨面光洁，适合于用作胶合板、纸浆、家具以及室内装饰用材，以及用于建筑、造船等，经济价值极高，因此也是重要的用材树种。
作为世界珍稀名贵观赏风景树的北美鹅掌楸，同样树姿挺秀，叶形美丽，树形端正，树序整齐，花大而美。老龄树枝条平展，或微向下垂。每届花期，琼英压树，翠帷覆地，绮丽优雅。
叶培忠教授于1963年首次选用中国鹅掌楸和北美鹅掌楸为亲本进行正、反交组合人工杂交，育成种间杂种杂交鹅掌楸(L.chinense[Hemsl.]Sarg.×L.tulipifera L.和L.tulipifera L.×L.chinense[Hemsl.]Sarg)；1970年开始进行杂交鹅掌楸正、反交组合苗木栽培对比。试验表明，种间杂交后代具有明显的杂交优势，不仅树形比亲本更加通直，花叶更加幽丽，媲美众芳，俯视众卉，而且生长也更加迅速。如栽植于浙江富阳中国林科院亚林所的杂交鹅掌楸，12年生时树高达14米，胸径达37厘米；另据北京市园林局将杂交鹅掌楸作城市行道树试种，在北京地区表现出耐寒性强，生长迅速的特点；同时该树种无其他树种果毛、花絮飞散造成的空气污染之弊。因此，林业上对优质杂交鹅掌楸苗木的需求相当迫切。
但鹅掌楸的天然结实率很低，亲本和杂交新种均仅有1％左右，有性繁殖能力差；鹅掌楸的扦插技术要求很高，成活率低，无性繁殖困难。因此，目前的种苗繁殖技术无法满足大面积植树造林的需要。
体细胞胚胎发生及其植株再生技术是20世纪90年代形成的高新林业生物技术的重要内容之一，可用于优良品种的大规模繁殖和用于遗传转化体系的建立。体细胞胚，是指二倍体或单倍体细胞在未经性细胞融合的过程，模拟合子胚发生的各个阶段而发育形成一个新的个体的形态发生和重建过程。在正常情况下有些植物的珠心组织或助细胞也可自发产生体细胞胚。在大量的组织培养过程中，许多离体培养的细胞、组织和器官，形成类似胚的结构。这种经体细胞胚发生而形成的在形态结构和功能上类似于有性胚的结构被称之为体细胞胚或胚状体。无性胚状体可以像有性胚那样在一定的条件下发育成完整的植株。胚状体按其来源可分为两类：一类是由普通植物孢子体的各种器官的二倍体体细胞产生而来，通常称为体细胞胚；另一类是由小孢子或其分裂产物等单倍体细胞产生的胚状体，通常简称为花粉胚，可发育成单倍体植株，但一般必须进行染色体加倍才能正常开花结实。另外，在一些植物中也可从胚乳培养得到胚状体，但未能成功地由胚状体发育成植株。朱微认为胚状体的定义包括三点含义：(1)胚状体是组织培养的产物，只限于在组织培养范围内使用，区别于无融合生殖的胚；(2)胚状体起源于非合子细胞，区别于合子胚；(3)胚状体的形成经历胚胎发育的过程，区别于与组织培养中分化的芽体。
1902年Haberlandt提出植物细胞的全能性观点，即每一个细胞都能不断分裂，进而形成完整的植株。Steward(1958)和Reinert(1959)差不多同时发现，培养的胡萝卜根细胞产生一种与胚相似的结构，并观察到由这种结构长成完整的植株。从而证明Haberlandt关于细胞全能性概念的正确性。此后，植物学家对此进行了广泛的研究，并已在许多植物中利用不同的器官、组织、细胞和原生质体进行培养得到了体细胞胚。成功获得体细胞胚的有裸子植物、双子叶植物和单子叶植物。林木体细胞胚胎发生研究始于20世纪七十年代后期，八十年代后期得到迅速发展，并获得极大成功。全世界目前已有40多种木本植物获得了体细胞胚，尤其是用常规无性繁殖技术很难生根的针叶树的体胚发生取得了令人瞩目的进展。据初步统计，已从冷杉属、落叶松属、云杉属、松属、黄杉属和北美红杉属的至少20种不同的针叶树的外植体诱导成功了体细胞胚。在阔叶树种上，柳属、杨属、栗属、檀香属、枫香属、鹅掌楸属、榛属、栎属、板栗属、山茶属、桉树属、七叶树属、柑橘属、柚木、可可、油橄榄、橡胶、泡桐等20多个树种的组织培养中观察到体细胞胚胎发生或获得再生植株。其中，美国的惠豪公司、国际纸业公司、维斯瓦库公司和加拿大的一些公司、新西兰林业研究中心等已分别将火炬松、挪威云杉、花旗松和辐射松等树种的体细胞胚诱导和植株再生应用于生产实践。仅新西兰一家公司就形成了年产200万株辐射松体细胞胚再生植株的能力。中国科学院于1988年以华北云杉为实验材料，将幼胚产生的愈伤组织诱导出的体细胞胚胎发育成小苗。黑龙江农大(1993)进行黑穗醋栗末受精胚珠培养，成功诱导体细胞胚胎和植株。四川农大王米力等(1996)用尾叶桉种子下胚轴诱导体细胞胚胎发生，获得根苗齐全的再生植株。在几十年的研究工作中，研究人员积累了大量的可贵资料，主要如下：
1.植物体的各种器官，如根、茎、叶、花、果实、种子、子房中的胚珠、雄蕊的花丝、花药及花粉都可以产生体细胞胚胎。但S.Merkle(1996)认为，树木的胚性培养只能来源于种子或幼苗，合子胚或种子的发育程度是很重要的，在许多树种的研究中表明，未成熟种子比成熟种子或幼苗有更高的诱导潜能。
2.外植体在接种前必须在低温条件下(4～8℃)冷藏一段时间，如裸子植物要冷藏1～2个月，没有低温处理不能启动。但低温冷藏时间过长，体胚发生能力会下降。
3.诱导体细胞胚胎，第一阶段需要高浓度的生长素，如2，4-D、NAA，此时外植体脱分化形成愈伤组织，即而诱导形成胚性细胞；第二阶段体细胞胚胎的形成和发育，必须降低生长素的浓度或完全除去生长素。
4.培养基中氮源的含量及形式是诱导体细胞胚胎的一个重要条件。还原态氮(NH4 +)对体细胞胚胎的诱导有利，而且高氮含量的MS培养基已经诱导出多种植物的体细胞胚胎。Reinert(1972)认为，体细胞胚胎的形成不是与培养基中氮的绝对量有关，而是与氮和生长素的比例有关。
5.一些天然复合物如水解酪蛋白(CH)、水解乳蛋白(LH)、大豆蛋白胨、麦芽汁、酵母提取物和椰子汁，它们既可以提供有机氮源、又对细胞分裂素和肌醇起作用，从而促进体细胞胚的形成。但在体细胞胚胎形成以后，要除去这些物质，否则会抑制体胚的发芽。
6.悬浮培养系的建立。在液体悬浮培养中，愈伤组织可以和培养基充分接触，营养物质在培养基的每个区域的浓度较均一，利于悬浮组织的同步生长。另外，悬浮培养大大改善了培养物的生存环境，这里气体交换顺畅，光照条件优越。
7.渗透压可以影响胚性细胞的生长发育，利用蔗糖、甘露醇、山梨醇和聚乙二醇(PEG)提高细胞的渗透压，创造一个干旱的环境，可以抑制早期萌发，明显提高胚成熟的概率而获得同步成熟好、质量高的体细胞胚胎，贮藏物的水平也会显著增加。
8.在生理浓度ABA(10-6和10-7mol/L)的作用下，胚发育不正常的情况如子叶合生、早熟发芽等会受到抑制。
9.光照和温度条件。组织培养中，除了某些材料需要在黑暗中生长外，一般均需要光照。S.Merkle认为，美国枫香的胚状体在黑暗与光照条件下均能发育，但是黑暗条件下发育得更健康。光源以荧光灯、白炽灯为多。不同波长的光源，对培养器官的增殖和器官分化有明显影响。如红豆杉的组培中，多采用红光。一般情况下，培养在25±2℃的恒温条件下进行。
在大量的研究中发现，在体细胞胚胎形成的所有条件中，培养基中的激素种类及浓度，培养基的多种营养成分均起着重要作用。而一些物理因素，如光照和温度等也有明显的影响。同时，也注意到组织的来源及其生理状态，对后期培养时的生长情况及分化有很大的影响。在培养基的各种成分之中，植物激素对于体胚形成，起着明显而重要的调节作用。其中影响最显著的是生长素和细胞分裂素。有时也是用赤霉素、脱落酸、乙烯以及其他人工合成的生长调节物质。使用激素要注意激素的种类和浓度，因为各种生长物质的稳定性、效应及其对体胚形成的影响有明显的差别。同时，不同激素处理的顺序也有明显的影响。在组织培养中用于调节胚状体形成的生长素和细胞分裂素，常用的种类如下：
生长素类：吲哚乙酸(IAA)、萘乙酸(NAA)、2，4-D，吲哚丁酸(IBA)；
细胞分裂素类：激动素(KT)、6-苄胺基嘌呤(BA)、异戊基腺嘌呤(2iP)、玉米素(ZT)。
为了诱导胚性愈伤组织或悬浮培养细胞形成胚状体，连续改变培养基特别是激素成分十分重要。2，4-D在胚性愈伤组织的诱导中起着重要作用，多种植物组织培养诱导脱分化都必须有2，4-D存在，而诱导脱分化后必须降低或去掉2，4-D，胚性细胞才能正常发育。Halperin(1970)取胡萝卜的叶柄切段，培养于加有不同激素成分的琼脂培养基上，然后移至不加任何激素的基本培养基上(仅有无机盐、蔗糖及维生素B1)，以检查对胚状体形成的影响。结果表明：①促进胚性愈伤组织增殖的培养及其激素成分并不促进胚状体的分化；去除培养基中的2，4-D，则使胚状体形成；加入BA，组织增殖速度增加，但抑制了转移培养基上后胚状体的形成，并且一旦胚状体原始细胞形成后，BA对其发育成胚状体毫无影响。②加入赤霉素，完全抑制其后胚状体的分化。③细胞增殖过程中的激素环境对下一步器官分化有着明显的影响。
有实验结果表明，2，4-D通过改变细胞内源IAA代谢而起作用，在水稻的早期胚性愈伤组织中，用ELISA酶联免疫分析证明胚性细胞出现时伴有较高的内源IAA水平，并且在胚性细胞转换时期添加外源IAA对胚性细胞出现有一定诱导效果。
ABA是体细胞胚发生中另外一种重要的激素，早在1974年，Ammirato报道了ABA可促进葛缕子体细胞胚胎发育。水稻愈伤组织浸ABA处理后，游离氨基酸含量明显提高，蛋白质含量与胚性对照相近，SDS-PAGE表明，出现胚性多肽谱带。用ELISA酶联免疫方法测定了党参胚性细胞形成球形胚的过程中，内源ABA的含量变化，结果表明，在这一过程中内源ABA含量持续增加。Kamada等在胡萝卜细胞培养中，发现内源ABA含量一直保持比较低的水平，但从非胚性细胞转化为胚性细胞，由胚性细胞团发育形成有形态结构的球形胚，在这两个体细胞胚发生的质变阶段中，均伴随着内源ABA的增加。在香莱体胚发生研究中，Ammirato(1973)发现在ABA的影响下，通常出现的不正常胚发育(如在下胚轴上形成不定胚，子叶合生，苗提前发育等)受到抑制；与不加ABA时所产生的胚状体相比更接近于合子胚的发育情况。
至于培养基的无机及有机营养物质的影响，相对来说没有激素的作用那么明显。同时，在培养基中通常已经包含植物生长所必需的无机元素和营养物质，不同的培养基配方尽管千差万别，但基本上都含有这些物质。虽然如此，在胡萝卜的细胞培养中已经发现培养基中的氮素含量与胚状体的形成有密切关系。组织培养中常用的两种培养基White培养基和MS培养基，其含氮量有很大的差异，前者在3.2mM，后者在60mM。通常认为White培养基不适于胚状体的分化。事实上，当把White培养基的含氮量用硝酸钾(KNO3)提高到40～60mM时，即可使之全部形成胚状体。Ammirato(1969)用NH4NO3提高White培养基的含氮量，也可达到MS培养基的效果。Reinert(1967)证实了NH4 +对于诱导胡萝卜培养中胚状体的形成，比其他氮源更为有效。Halperin(1971)亦发现不同氮源中对于胚状体的形成，NH4 +和水解酪蛋白的促进作用明显优于NO3 -或谷氨酰胺。
在所有的有机化合物中间，常用的有维生素、氨基酸、核酸碱基(嘌呤、嘧啶类化合物)、糖类等。维生素中常用的是硫胺素、肌醇、烟酸、吡哆素等，其中硫胺素的作用最为明显，而在组织培养中加入肌醇也一直认为是有好处的。为了促进胚状体的形成，在很多情况下也常用一些天然复合物，如水解酪蛋白或水解乳蛋白、大豆蛋白胨、麦芽汁、酵母提取物和椰子汁等，其中椰子汁使用特别多。现经大量的研究，已知其影响生长和分化的有效成分是细胞激动素类物质和肌醇等。
渗透剂在林木体胚发生的各个阶段都发挥着重要作用。总的说来，渗透剂都是高度水合性的多羟基分子，包括单糖、多糖、己糖醇和环多醇。环多醇是六碳环的羟基复合物，较常用的环多醇有肌醇及其立体异构体鲨肌醇等。蔗糖和葡萄糖是常用的两种糖类渗透剂，山梨醇、D-甘露醇和半乳糖醇的直链醇形式、及乙二醇如聚乙二醇和聚丙二醇也可用作渗透剂。唐巍(1998)在火炬松的胚性愈伤组织诱导和植株再生的研究中，加入9000mg/L肌醇提高渗透压，以促进后期胚的发育。黄健秋(1995)将马尾松的早期原胚转至含9000mg/L肌醇的DCR培养基上，形成后期原胚。可见，体胚形成过程中适当提高渗透压可促进体胚形成。
在植物组织培养中，诱导体细胞胚胎发生和诱导器官发生相比具有显著的特点：①具有两极性：在体细胞胚发生早期就具有胚根和胚芽两极，胚性细胞分裂多为不均等分裂，形成顶细胞和基细胞，其后有较小的顶细胞继续分裂形成多细胞原胚，而较大的基细胞进行少数几次分裂成为胚柄部分，在形态上具有明显的极性。②存在生理隔离：体细胞胚形成后与母体植物或外植体的维管束系统联系较少，即出现所谓生理上的隔离现象。胚性细胞细胞壁加厚，与其它细胞分开，周围细胞处于解体状态，表明体细胞胚与合子胚相似，从一开始就是完整的植物体的雏形。③遗传相对稳定：通过体细胞胚形成的再生植株的变异性小于器官发生途径形成的再生植株，因为只有那些未经过畸变的细胞或变异较少的细胞团才能形成体细胞胚，实现全能型表达。④重演受精卵形态发生的特征：植物组织培养中形态发生的几种方式，虽然都是植物细胞全能性的具体表现，但体细胞胚胎发生途径是细胞全能型表达最完全的一种方式，它不仅表明植物体细胞具有全套遗传信息，而且重演了合子胚形态发生的进程。
植物组织培养中诱导体细胞胚发生途径可归纳为两种：直接途径与间接途径。直接途径就是从外植体某些部位直接诱导分化出体细胞胚，如槐树子叶在切口处产生愈伤组织的同时，在子叶组织中分化产生体细胞胚。槐树子叶离体培养既可以直接途径形成体细胞胚，也可以通过脱分化形成愈伤组织后，再从愈伤组织的某些细胞分化出体细胞胚，即称为间接途径。大多数植物的体细胞胚胎发生多通过间接途径进行，在愈伤组织中某些体细胞转化为胚性细胞、胚性细胞继续分裂形成多细胞原胚以及不同发育时期的体细胞胚，如经过球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚而发育成小苗。
体细胞胚胎发生由于能在更短的时间内得到更多的营养繁殖体，以及获得更大的遗传增益，并且由于体胚发生培养物也是分离原生质体的重要来源，可用于林木的遗传转化以及体细胞杂交研究，在理论与应用研究中具有重要的作用。体细胞胚胎具有数量多、速度快、结构完整等显著特点，而且体细胞再生植株的优点是分化效率高、繁殖系数大、根系发达、繁殖速率比其它途径快，因而特别适合植物的大量繁殖；由于易在体外培养，并且可以比较体外非合子胚与种子的合子胚的异同，所以广泛用于研究植物体的生长发育过程；在基因工程研究中，将分离到的基因导入单个胚性细胞中，由这个胚性细胞长成植株的组织中，就含有整合进去的基因。
目前有关植物组织培养技术的各类文献中，除美国有北美鹅掌楸(Liriondendron tulipifera L.)组培相关专利技术的报导外，尚未见有杂交鹅掌楸(Liriondendron hybrid)体细胞胚胎发生的成套技术发表。
三、发明内容
本发明的主要目的是针对鹅掌楸天然结实率低，扦插困难，种苗繁殖技术无法满足大面积植树造林需要的现状，寻找一种杂交鹅掌楸细胞胚胎发生与植株再生的技术，为杂交鹅掌楸的大规模无性繁殖育苗提供一种周期短、繁殖率高、成本低廉的方法。
本发明的主要技术特征在于，在鹅掌楸杂交亲本选择的基础上进行杂交，分别将正交、反交和回交制种所获得的杂交幼胚，植于专用配方的培养基上，实现杂交鹅掌楸规模细胞胚胎的发生和植株再生。具体方法如下：
一、未成熟胚的制取
选定父、母本优良植株。四月底到五月初，在盛花期的母本植株上选择花冠顶端微微松动、雌蕊柱头布满粘液和晶莹亮点而即将开放的花蕾、剥开花瓣去雄，然后用镊子从父本花朵上夹下雄蕊，从上到下轻轻触动雌蕊柱头，直到柱头上涂满一层金黄色的花粉为止，最后将花瓣合拢。七月份收集聚合翅果，制取获得未成熟合子胚，
二、不同发育阶段需要的不同基本培养基配方
1.胚性愈伤诱导阶段采用1/2MS基本培养基，即将MS(Murashing andSkoog medium)培养基大量元素减半，其余成分保持不变。附加浓度为0.5～5.0mg/L的2，4-D，0～0.5mg/L的6-苄胺基嘌呤(BA)，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C。
2.胚性愈伤组织的增殖阶段，继续使用1/2MS基本培养基。附加浓度为0～0.5mg/L的2，4-D，0～0.25mg/L的6-苄胺基嘌呤(BA)，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C。
3.胚性愈伤组织的状态调整阶段，改用MS基本培养基，并提高蔗糖浓度，附加浓度为0～0.5mg/L的2，4-D，0～0.25mg/L的6-苄胺基嘌呤(BA)，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C。
4.胚状体的发生阶段，采用MS基本培养基，适当提高细胞分裂素、特别是玉米素ZT的浓度。即附加浓度为0.5～5.0mg/L的ZT，0～1.0mg/L的IAA。
5.球形胚形成以后阶段，采用MS改良培养基，调整MS培养基中的含氮量，直至胚状体发育成苗。
6.幼苗发育阶段，采用White培养基。
以上所涉及的各类培养基具体配方如下：
1.MS基本培养基(Murashing and Skoog medium，1962)标准配方
NH4NO3 1650mg/L
KNO3 1900mg/L
CaCl2·2H2O 440mg/L
MgSO4·7H2O 370mg/L
KH2PO4 170mg/L
KI 0.83mg/L
H3BO3 6.2mg/L
MnSO4·H2O 16.9mg/L
ZnSO4·7H2O 8.6mg/L
Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L
CuSO4·5H2O 0.025mg/L
CoCl2·6H2O 0.025mg/L
FeSO4·7H2O 27.8mg/L
Na2-EDTA 37.3mg/L
肌醇 100mg/L
烟酸 0.5mg/L
盐酸硫胺素 0.1mg/L
盐酸吡哆醇 0.5mg/L
甘氨酸 2mg/L
2.1/2MS培养基，即大量元素减半的MS培养基(Murashing and Skoogmedium，1962)标准配方
NH4NO3 825mg/L
KNO3 950mg/L
CaCl2·2H2O 220mg/L
MgSO4·7H2O 185mg/L
KH2PO4 85mg/L
KI 0.83mg/L
H3BO3 6.2mg/L
MnSO4·H2O 16.9mg/L
ZnSo4·7H2O 8.6mg/L
Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L
CuSO4·5H2O 0.025mg/L
CoCl2·6H2O 0.025mg/L
FeSO4·7H2O 27.8mg/L
Na2-EDTA 37.3mg/L
肌醇 100mg/L
烟酸 0.5mg/L
盐酸硫胺素 0.1mg/L
盐酸吡哆醇 0.5mg/L
甘氨酸 2mg/L
3.MS改良培养基配方
NH4NO3 1200mg/L
KNO3 1000mg/L
CaCl2·2H2O 440mg/L
MgSO4·7H2O 370mg/L
KH2PO4 170mg/L
KI 0.83mg/L
H3BO3 6.2mg/L
MnSO4·H2O 16.9mg/L
ZnSO4·7H2O 8.6mg/L
Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L
CuSO4·5H2O 0.025mg/L
CoCl2·6H2O 0.025mg/L
FeSO4·7H2O 27.8mg/L
Na2-EDTA 37.3mg/L
肌醇 100mg/L
烟酸 0.5mg/L
盐酸硫胺素 0.1mg/L
盐酸吡哆醇 0.5mg/L
甘氨酸 2mg/L
4.White培养基(1964)标准配方
Ca(NO3)2·4H2O 300mg/L
KNO3 80mg/L
MgSO4·7H2O 740mg/L
NaH2PO4·H2O 16.5mg/L
KI 0.75mg/L
KCl 65mg/L
Na2SO4 200mg/L
H3BO3 1.5mg/L
MnSO4·4H2O 7mg/L
ZnSO4·7H2O 3mg/L
MoO3 0.001mg/L
FeSO4·7H2O 27.8mg/L
Na2-EDTA 37.3mg/L
肌醇 10.0mg/L
烟酸 0.1mg/L
盐酸硫胺素 1.0mg/L
盐酸吡哆醇 0.1mg/L
四、附图说明
图1为2，4-D浓度与胚性愈伤诱导率的关系曲线。图中的横坐标轴表示2，4-D的浓度，单位为mg/L，纵坐标为诱导率(％)。
图2为细胞分裂素ZT与胚状体诱导效率之间的关系曲线。图中的横坐标轴表示细胞分裂素ZT的浓度，单位为mg/L，纵坐标为诱导率(％)。
五、具体实施方式
以下是采用本发明的典型实施例：
1.采用未成熟合子胚进行胚性愈伤组织的诱导。春季人工授粉，盛夏收集聚合翅果，将采下的聚合翅果于4℃条件下低温冷藏4～6天，剖开且剪去翅膀。用洗洁精清洗种子，以除去其表面的油污，自来水冲洗30分钟，蒸馏水冲洗3次，75％的乙醇处理20秒，0.1％的氯化汞4分30秒，无菌水冲洗4次。无菌状态下，剥去种皮，将未成熟胚接入诱导培养基。
胚性愈伤诱导阶段采用1/2MS培养基，附加激素是浓度分别为2，4-D 0.5，1.0，1.5，2.0，3.0，4.0，5.0mg/L，6-BA 0，0.1，0.2，0.4，0.5mg/L。添加500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白。维生素C 5mg/L，培养基中含蔗糖4％，琼脂0.65％，灭菌前将pH调至pH5.7，121℃高温、高压灭菌16分钟，培养温度24～26℃，黑暗条件下培养，每二十天继代培养一次。
幼胚接入诱导培养基后约15天开始启动，长出的愈伤组织色淡，晶莹，透明。25天左右，有些发生少许褐变，经继代后，褐变停止，并开始长出白色快速增殖的胚性愈伤组织，10天左右的时间，即可长满整个培养瓶。这种愈伤组织在解剖镜下观察，多为圆球状，水分含量多，细胞质稀薄的薄壁细胞。
各种浓度的2，4-D均能诱导胚性愈伤组织产生，但浓度过低，胚性细胞生长太慢，浓度过高，长势过于迅猛，胚性细胞状态不易调整。结果表明，2，4-D1.5，2.0，3.0三种浓度较为合适。
2，4-D对胚性愈伤组织诱导的影响参见附图1。
同时，比较了合子胚发育阶段(聚合翅果采集时间)对体胚发生的影响。表1说明聚合翅果采集时间即幼胚发育阶段，对体细胞胚胎的诱导起着至关重要的作用，球形期至子叶期的幼胚对体胚诱导都有效。但是采集时间过早幼胚发育不好，采集过迟胚胎已经发育成熟，都不利于体胚的诱导。
幼胚发育阶段对体细胞胚胎发生的影响参见表1。
表1幼胚发育阶段对体细胞胚胎发生的影响
| 采集时间 | 胚性愈伤 | 胚状体 |
| 6月28日 | - | - |
| 7月6日 | - | - |
| 7月13日 | - | - |
| 7月19日 | + | + |
| 7月26日 | + | + |
| 8月2日 | + | + |
| 8月9日 | - | - |
| 8月16日 | - | - |
| 8月23日 | - | - |
+表示能够诱导体胚发生
-表示不能诱导体胚发生
2.胚性愈伤组织的增殖阶段，继续使用1/2MS基本培养基，及时降低生长素2，4-D浓度为0，0.1，0.2，0.4，0.5mg/L，细胞分裂素BA的浓度为0，0.1，0.25mg/L，水解酪蛋白浓度保持不变。大量研究表明，诱导体细胞胚胎，第一阶段需要高浓度的生长素，如2，4-D、NAA，此时外植体脱分化形成愈伤组织，即而诱导形成胚性细胞；第二阶段体细胞胚胎的形成和发育，必须降低2，4-D的浓度或完全除去。降低外源生长素的含量，愈伤组织细胞生长速度得到控制，有利于原始胚性细胞的形成。
3.胚性愈伤组织的状态调整，基本培养基改用MS培养基，并提高蔗糖浓度至50～60g/L以提高渗透压，激素浓度与增殖阶段相同。试验证明，渗透压对体细胞胚胎的形成起着重要的作用，在胚状体形成阶段，渗透压可能达到200～400mM/kg左右。在试验中，我们发现，随着渗透压的提高愈伤组织含水量逐渐减少而变得干燥，紧密。培养一个月后，形成颗粒状的愈伤组织，进而发育成胚状体。说明随着渗透压的提高，体胚诱导能力增强。但是渗透压过高，超出一定范围，其诱导体细胞胚胎的能力反而下降，在本发明中，蔗糖浓度60g/L时的渗透压为最适渗透压。
蔗糖浓度对体胚发生的影响见表2。
表2蔗糖浓度对体胚发生的影响
4.胚状体的发生，MS基本培养基，附加的激素组合分别是0.5，1.0，2.0，4.0，5.0mg/L的ZT，0，0.1，0.5，1.0mg/L的IAA，这时培养基中的蔗糖浓度降低为30g/L。
细胞分裂素ZT，对体细胞胚胎的形成起着重要的作用。在高浓度的生长素的作用下，细胞生长速度很快，这样形成大量的薄壁细胞并不有利于体细胞胚胎的形成，而细胞分裂素ZT，可以中和生长素的后续效应，调整细胞状态，减慢细胞生长速度，经过一段时间以后，愈伤组织逐渐由水浸状变为颗粒状，发育形成胚状体。胚性细胞呈卵圆形，细胞核大，核仁明显，核中移，线粒体、质体、核糖体、高尔基体、内质网等细胞器增多，淀粉粒、脂滴积累，有较活跃的自体吞噬现象，在细胞核、液泡膜、线粒体、内质网等部位有较高的ATP酶活性。并且在含ZT的培养基中，随着ZT浓度升高，诱导率也呈梯度上升，说明ZT浓度与诱导效率存在正相关，但ZT浓度过高，也会有副作用。
ZT与胚状体诱导效率之间的关系参见附图2。
5.胚状体的发育和成熟。球形胚形成以后，转入MS改良培养基使其继续发育，球形胚经过近两个月的发育，会依次经过球形胚、心形胚、鱼雷胚和子叶胚阶段而发育成苗。
在本发明改良培养基上，成功地调整了胚性细胞的生长状况，使得体细胞胚胎发生中最难的关键技术问题——畸形苗的发生得到有效控制，并且胚性愈伤组织上会不断分化形成新的胚状体，繁殖系数大，在直径为1厘米的胚性愈伤组织上，通常可看到10～20个子叶胚发育。
另外，由于体细胞胚胎发生具有两极性的特点，所以，胚状体同时形成芽和根，成为完整的幼苗，很好地解决了组织培养中生根难的问题。
6.幼苗在White培养基上发育成小植株，继续降低蔗糖浓度为20g/L。体细胞胚胎发生中另外一个难题是很难形成发达的根系，解决的办法是降渗，即降低蔗糖浓度和无机盐浓度，抑制主根过度延长，必要时可加入0.1mg/L的IBA，这样可以诱导根系发达的须根系统。
7.移苗定植阶段。体胚发芽后，瓶苗长至2厘米高，且根叶发达时，从瓶中取出洗去幼苗根部培养基，植入主要由珍珠岩构成的基质中。移苗后一周内湿度保持在95～100％，一个月内的管理要特别细致，注意湿度与温度的协调。移苗后一个星期，可以开始叶面施肥，成活后就可以根部施肥，并按常规苗木栽培工艺进行定植。
采用本发明提供的技术，可以为杂交鹅掌楸的工厂化无性繁殖育苗提供一种周期短、繁殖率高、成本低廉的方法。突破了鹅掌楸天然结实率低，扦插困难，种苗繁殖技术无法满足大面积植树造林需要的限制。
Claims (2)
1.一种杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于采集人工杂交授粉发育的杂交鹅掌楸聚合翅果，在无菌条件下，分离球形期至子叶期的未成熟合子胚进行体胚发生培养；体胚发生培养不同发育阶段所使用的培养基和附加激素配方为：
a.胚性愈伤诱导阶段采用1/2MS基本培养基，附加浓度为0.5～5.0mg/L的2，4-D，0～0.5mg/L的6-苄胺基嘌呤，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C；
b.胚性愈伤组织的增殖阶段，使用1/2MS基本培养基，附加浓度为0～0.5mg/L的2，4-D，0～0.25mg/L的6-苄胺基嘌呤，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C；
c.胚性愈伤组织的状态调整阶段，采用MS基本培养基，蔗糖浓度控制为50～60g/L，附加浓度为0～0.5mg/L的2，4-D，0～0.25mg/L的6-苄胺基嘌呤，500～1000mg/L的天然复合物水解酪蛋白和1～5mg/L的维生素C；
d.胚状体的发生阶段，采用MS基本培养基，附加浓度为0.5～5.0mg/L的玉米素，0～1.0mg/L的吲哚乙酸；
e.球形胚形成以后阶段，采用MS改良培养基；
f.体胚植株再生阶段，采用White培养基。
2.如权利要求1所述的杂交鹅掌楸体细胞胚胎发生与植株再生的方法，其特征在于：
a.胚性愈伤诱导阶段，2，4-D的最佳值为1.5～3.0mg/L；
b.胚性愈伤组织的状态调整阶段，蔗糖浓度的最佳值为60g/L；
c.胚状体的发生阶段，玉米素的最佳值为2～4mg/L。
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