CN103181323A - 一种蓝莓胚状体培养方法 - Google Patents

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王祖华
李永程
关润伶
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Abstract

本发明公开了一种蓝莓胚状体培养方法，用长出2-3个月叶子的蓝莓作为外植体，配制培养基后，将外植体灭菌和接种，愈伤组织继代，诱导单细胞，单细胞分化，培养胚状体。利用蓝莓叶子诱导到蓝莓的愈伤组织，再将愈伤组织培养出单细胞，再将单细胞诱导出蓝莓胚状体，利用蓝莓的胚状体来培养蓝莓植株，减少不定芽和玻璃化苗的形成，提高有效苗的数量；采用PVP就可以使得愈伤组织不发生褐化，这对蓝莓愈伤组织很适用。培养速度快，可以在五个月内培养出十万支蓝莓组培苗；.培养出来的苗木长势基本一样；培养出的苗木植株品质较高，植物病毒比较少。

Description

一种蓝莓胚状体培养方法
技术领域
本发明涉及一种珍奇果品种蓝莓胚状体培养，属于植物组织培养领域。
背景技术
利用叶片来诱导愈伤组织在组培学上非常常见。蓝莓都用单芽枝进行组织分化丛生芽，丛生芽虽然比较容易培养，但这对于大量培养蓝莓苗木，是非常缓慢的。2007 年第5期《分子植物育种》宁志怨等用蓝莓丛生芽的诱导及植株再生即嫩叶的单芽枝培养蓝莓植株，当ZT的浓度过高时即超过2.0 mg/L，会形成大量的不定芽，出现一些愈伤组织和玻璃化苗，降低有效苗的数量；2010年第9期《北方园艺》，于强波等用蓝莓半质化新稍培养蓝莓植株，很容易发生褐化。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种快速培养蓝莓胚状体的方法。
本发明的技术方案是：一种蓝莓胚状体培养方法，用长出2-3个月叶子的蓝莓作为外植体，配制培养基后，将外植体灭菌和接种，愈伤组织继代，诱导单细胞，单细胞分化，培养胚状体。
所述配制培养基的配方为：
愈伤组织继代培养基配方：WPM+ZT0.1~0.5mg/L +2,4-D 1~4mg/L + NAA 0.3~1.4mg/L + 6-BA 1.0~4.0mg/L + 蔗糖20g/L + PVP 0.5~1g/L + 琼脂 5.2g/L，PH 5.2~5.8，温度25℃，黑暗培养；
单细胞培养配方：WPM + ZT0.1~0.5mg/L + 2,4-D 1~4mg/L + NAA0.5 ~1.5mg/L +6-BA 1.0~4.0mg/L+蔗糖20g/L + PVP 0.5~1g/L + 琼脂 5.2g/L，PH 5.2~5.8，温度25℃，黑暗培养；
单细胞脱分化配方：1/2WPM + 6-BA 1.0~3.0mg/L + NAA0.5~1.6 mg/L + KT 0.1~1.5 mg/L + 蔗糖15~40g/L + PVP 0.5g~1 g/L，PH 5.2-5.8，温度25℃，黑暗培养；
胚状体培养配方：WPM + ZT 0.1~2mg/L + IBA 1.0~2.0 mg/L+琼脂5.2g/L，PH 5.2-5.8，温度25℃，光照12h培养。
所述将外植体灭菌和接种的具体操作为：外植体用流水冲洗0.5h，将外植体刷干净，加入吐温几滴，放在流水下冲洗20~30min；处理好的外植体用酒精灭菌1min，再用升汞灭菌3min，用无菌水洗5~8遍，放入无菌水中待接种；灭菌好的外植体用剪刀减掉边缘，剪断叶脉；远轴面向上接种到诱导愈伤组织培养基上。
所述愈伤组织继代的具体操作为：将诱导出的愈伤组织剪下，接种到愈伤组织培养基上继代培养，将继代长出的愈伤组织再继代两次。
所述诱导单细胞的具体操作为：将继代好的愈伤组织接种到继代液体培养基上，加入珍珠岩，以200转/分钟震荡培养。
所述单细胞分化的具体操作为：从摇床上取出单细胞培养液，静置，取上层清液，然后接入单细胞诱导液体培养基，放在摇床上温度设成：25℃，转数200转/min，黑夜培养三天。
所述胚状体培养的具体操作为：震荡培养2-3d后瓶中出现浑浊，光强调为5000勒克斯，再静置培养12h，然后取上层清液接种到单细胞诱导培养基上，培养5-8d。
本发明的有益效果是：利用蓝莓叶子诱导到蓝莓的愈伤组织，再将愈伤组织培养出单细胞，再将单细胞诱导出蓝莓胚状体，利用蓝莓的胚状体来培养蓝莓植株，减少不定芽和玻璃化苗的形成，提高有效苗的数量；采用PVP就可以使得愈伤组织不发生褐化，这对蓝莓愈伤组织很适用。培养速度快，可以在五个月内培养出十万支蓝莓组培苗；.培养出来的苗木长势基本一样；培养出的苗木植株品质较高，植物病毒比较少。
具体实施方式
实施例1
一种蓝莓胚状体培养方法，用生长在东北长白山野生蓝莓为材料，用长出2-3个月叶子作为外植体，配制培养基后，将外植体灭菌和接种，愈伤组织继代，诱导单细胞，单细胞分化，培养胚状体。所述配制培养基的配方为：愈伤组织继代培养基配方：WPM+ZT0.1mg/L +2,4-D 1mg/L + NAA 0.3mg/L + 6-BA 1.0mg/L + 蔗糖20g/L + PVP 0.5g/L + 琼脂 5.2g/L，PH 5.2，温度25℃，黑暗培养；单细胞培养配方：WPM + ZT0.1mg/L + 2,4-D 1mg/L + NAA0.5mg/L +6-BA 1.0mg/L+蔗糖20g/L + PVP 0.5g/L + 琼脂 5.2g/L，PH 5.2，温度25℃，黑暗培养；单细胞脱分化配方：1/2WPM + 6-BA 1.0mg/L + NAA0.5 mg/L + KT 0.1 mg/L + 蔗糖15g/L + PVP 0.5g g/L，PH 5.2，温度25℃，黑暗培养；胚状体培养配方：WPM + ZT 0.1mg/L + IBA 1.0 mg/L+琼脂5.2g/L，PH 5.2，温度25℃，光照12h培养。将外植体灭菌和接种的具体操作为：外植体用流水冲洗0.5h，将外植体刷干净，加入吐温几滴，放在流水下冲洗20~30min；处理好的外植体用酒精灭菌1min，再用升汞灭菌3min，用无菌水洗5~8遍，放入无菌水中待接种；灭菌好的外植体用剪刀减掉边缘，剪断叶脉；远轴面向上接种到诱导愈伤组织培养基上。愈伤组织继代的具体操作为：将诱导出的愈伤组织剪下，接种到愈伤组织培养基上继代培养，将继代长出的愈伤组织再继代两次。刚诱导出的愈伤组织为绿色带点黄色，而继代两次后愈伤组织变成淡黄色，并且愈伤组织比较疏松。在愈伤继代培养中不能超过五次，超过五次后单细胞不能分化成胚状体。诱导单细胞的具体操作为：将继代好的愈伤组织接种到继代液体培养基上，加入珍珠岩，以200转/分钟震荡培养。加入珍珠岩，是将愈伤组织打成大的细胞团，而大的细胞团在裂成小细胞团，然后再被打成单细胞。所述单细胞分化的具体操作为：从摇床上取出单细胞培养液，静置，取上层清液，然后接入单细胞诱导液体培养基，放在摇床上温度设成：25℃，转数200转/min，黑夜培养三天。胚状体培养的具体操作为：震荡培养2-3d后瓶中出现浑浊，光强调为5000勒克斯，再静置培养12h，然后取上层清液接种到单细胞诱导培养基上，培养5-8d。固体培养基上又很多密密麻麻的绿点，胚状体已经开始萌发，培养5-8d培养基表面长出叶子并伴随着出现根源基，三天后，可以清晰的看见植株的芽和白根，胚状体培养已经成功。
实施例2
一种蓝莓胚状体培养方法，用生长在东北长白山野生蓝莓为材料，用长出2-3个月叶子作为外植体，配制培养基后，将外植体灭菌和接种，愈伤组织继代，诱导单细胞，单细胞分化，培养胚状体。所述配制培养基的配方为：愈伤组织继代培养基配方：WPM+ZT0.5mg/L +2,4-D 4mg/L + NAA 1.4mg/L + 6-BA 4.0mg/L + 蔗糖20g/L + PVP 1g/L + 琼脂 5.2g/L，PH 5.8，温度25℃，黑暗培养；单细胞培养配方：WPM + ZT0.5mg/L + 2,4-D 4mg/L + NAA1.5mg/L +6-BA 4.0mg/L+蔗糖20g/L + PVP 1g/L + 琼脂 5.2g/L，PH 5.8，温度25℃，黑暗培养；单细胞脱分化配方：1/2WPM + 6-BA 3.0mg/L + NAA1.6 mg/L + KT 1.5 mg/L + 蔗糖40g/L + PVP 1 g/L，PH 5.8，温度25℃，黑暗培养；胚状体培养配方：WPM + ZT 0.1~2mg/L + IBA 2.0 mg/L+琼脂5.2g/L，PH 5.8，温度25℃，光照12h培养。将外植体灭菌和接种的具体操作为：外植体用流水冲洗0.5h，将外植体刷干净，加入吐温几滴，放在流水下冲洗30min；处理好的外植体用酒精灭菌1min，再用升汞灭菌3min，用无菌水洗8遍，放入无菌水中待接种；灭菌好的外植体用剪刀减掉边缘，剪断叶脉；远轴面向上接种到诱导愈伤组织培养基上。愈伤组织继代的具体操作为：将诱导出的愈伤组织剪下，接种到愈伤组织培养基上继代培养，将继代长出的愈伤组织再继代两次。刚诱导出的愈伤组织为绿色带点黄色，而继代两次后愈伤组织变成淡黄色，并且愈伤组织比较疏松。在愈伤继代培养中不能超过五次，超过五次后单细胞不能分化成胚状体。诱导单细胞的具体操作为：将继代好的愈伤组织接种到继代液体培养基上，加入珍珠岩，以200转/分钟震荡培养。加入珍珠岩，是将愈伤组织打成大的细胞团，而大的细胞团在裂成小细胞团，然后再被打成单细胞。所述单细胞分化的具体操作为：从摇床上取出单细胞培养液，静置，取上层清液，然后接入单细胞诱导液体培养基，放在摇床上温度设成：25℃，转数200转/min，黑夜培养三天。胚状体培养的具体操作为：震荡培养2-3d后瓶中出现浑浊，光强调为5000勒克斯，再静置培养12h，然后取上层清液接种到单细胞诱导培养基上，培养5-8d。固体培养基上又很多密密麻麻的绿点，胚状体已经开始萌发，培养5-8d培养基表面长出叶子并伴随着出现根源基，三天后，可以清晰的看见植株的芽和白根，胚状体培养已经成功。
实施例3
一种蓝莓胚状体培养方法，用生长在东北长白山野生蓝莓为材料，用长出2-3个月叶子作为外植体，配制培养基后，将外植体灭菌和接种，愈伤组织继代，诱导单细胞，单细胞分化，培养胚状体。所述配制培养基的配方为：愈伤组织继代培养基配方：WPM+ZT0.1~0.5mg/L +2,4-D 1~4mg/L + NAA 0.3~1.4mg/L + 6-BA 1.0~4.0mg/L + 蔗糖20g/L + PVP 0.5~1g/L + 琼脂 5.2g/L，PH 5.2~5.8，温度25℃，黑暗培养；单细胞培养配方：WPM + ZT0.1~0.5mg/L + 2,4-D 1~4mg/L + NAA0.5~1.5mg/L +6-BA 1.0~4.0mg/L+蔗糖20g/L + PVP 0.5~1g/L + 琼脂 5.2g/L，PH 5.2~5.8，温度25℃，黑暗培养；单细胞脱分化配方：1/2WPM + 6-BA 1.0~3.0mg/L + NAA0.5~1.6 mg/L + KT 0.1~1.5 mg/L + 蔗糖15~40g/L + PVP 0.5g~1 g/L，PH 5.2-5.8，温度25℃，黑暗培养；胚状体培养配方：WPM + ZT 0.1~2mg/L + IBA 1.0~2.0 mg/L+琼脂5.2g/L，PH 5.2-5.8，温度25℃，光照12h培养。将外植体灭菌和接种的具体操作为：外植体用流水冲洗0.5h，将外植体刷干净，加入吐温几滴，放在流水下冲洗20~30min；处理好的外植体用酒精灭菌1min，再用升汞灭菌3min，用无菌水洗5~8遍，放入无菌水中待接种；灭菌好的外植体用剪刀减掉边缘，剪断叶脉；远轴面向上接种到诱导愈伤组织培养基上。愈伤组织继代的具体操作为：将诱导出的愈伤组织剪下，接种到愈伤组织培养基上继代培养，将继代长出的愈伤组织再继代两次。刚诱导出的愈伤组织为绿色带点黄色，而继代两次后愈伤组织变成淡黄色，并且愈伤组织比较疏松。在愈伤继代培养中不能超过五次，超过五次后单细胞不能分化成胚状体。诱导单细胞的具体操作为：将继代好的愈伤组织接种到继代液体培养基上，加入珍珠岩，以200转/分钟震荡培养。加入珍珠岩，是将愈伤组织打成大的细胞团，而大的细胞团在裂成小细胞团，然后再被打成单细胞。所述单细胞分化的具体操作为：从摇床上取出单细胞培养液，静置，取上层清液，然后接入单细胞诱导液体培养基，放在摇床上温度设成：25℃，转数200转/min，黑夜培养三天。胚状体培养的具体操作为：震荡培养2-3d后瓶中出现浑浊，光强调为5000勒克斯，再静置培养12h，然后取上层清液接种到单细胞诱导培养基上，培养5-8d。固体培养基上又很多密密麻麻的绿点，胚状体已经开始萌发，培养5-8d培养基表面长出叶子并伴随着出现根源基，三天后，可以清晰的看见植株的芽和白根，胚状体培养已经成功。

Claims (7)

1. 一种蓝莓胚状体培养方法，其特征在于：用长出2-3个月叶子的蓝莓作为外植体，配制培养基后，将外植体灭菌和接种，愈伤组织继代，诱导单细胞，单细胞分化，培养胚状体。
2. 根据权利要求1所述的蓝莓胚状体培养方法，其特征在于：所述配制培养基的配方为：
愈伤组织继代培养基配方：WPM+ZT0.1~0.5mg/L +2,4-D 1~4mg/L + NAA 0.3~1.4mg/L + 6-BA 1.0~4.0mg/L + 蔗糖20g/L + PVP 0.5~1g/L + 琼脂 5.2g/L，PH 5.2~5.8，温度25℃，黑暗培养；
单细胞培养配方：WPM + ZT0.1~0.5mg/L + 2,4-D 1~4mg/L + NAA0.5 ~1.5mg/L +6-BA 1.0~4.0mg/L+蔗糖20g/L + PVP 0.5~1g/L + 琼脂 5.2g/L，PH 5.2~5.8，温度25℃，黑暗培养；
单细胞脱分化配方：1/2WPM + 6-BA 1.0~3.0mg/L + NAA0.5~1.6 mg/L + KT 0.1~1.5 mg/L + 蔗糖15~40g/L + PVP 0.5g~1 g/L，PH 5.2-5.8，温度25℃，黑暗培养；
胚状体培养配方：WPM + ZT 0.1~2mg/L + IBA 1.0~2.0 mg/L+琼脂5.2g/L，PH 5.2-5.8，温度25℃，光照12h培养。
3. 根据权利要求1所述的蓝莓胚状体培养方法，其特征在于：所述将外植体灭菌和接种的具体操作为：外植体用流水冲洗0.5h，将外植体刷干净，加入吐温几滴，放在流水下冲洗20~30min；处理好的外植体用酒精灭菌1min，再用升汞灭菌3min，用无菌水洗5~8遍，放入无菌水中待接种；灭菌好的外植体用剪刀减掉边缘，剪断叶脉；远轴面向上接种到诱导愈伤组织培养基上。
4. 根据权利要求1所述的蓝莓胚状体培养方法，其特征在于：所述愈伤组织继代的具体操作为：将诱导出的愈伤组织剪下，接种到愈伤组织培养基上继代培养，将继代长出的愈伤组织再继代两次。
5. 根据权利要求1所述的蓝莓胚状体培养方法，其特征在于：所述诱导单细胞的具体操作为：将继代好的愈伤组织接种到继代液体培养基上，加入珍珠岩，以200转/分钟震荡培养。
6. 根据权利要求1所述的蓝莓胚状体培养方法，其特征在于：所述单细胞分化的具体操作为：从摇床上取出单细胞培养液，静置，取上层清液，然后接入单细胞诱导液体培养基，放在摇床上温度设成：25℃，转数200转/min，黑夜培养三天。
7. 根据权利要求1所述的蓝莓胚状体培养方法，其特征在于：所述胚状体培养的具体操作为：震荡培养2-3d后瓶中出现浑浊，光强调为5000勒克斯，再静置培养12h，然后取上层清液接种到单细胞诱导培养基上，培养5-8d。
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