CN106171993A - 一种以黄梁木叶片为外植体的高效再生方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种以黄梁木叶片为外植体的高效再生方法,属于植物组织培养技术领域。本发明以叶片作为外植体有其巨大的优势,取材方便、操作容易、来源广泛,有利于再生及遗传转化的重复进行等。因此,本发明以黄梁木无菌苗嫩叶为外植体,通过不定芽诱导、增殖、生根、炼苗移栽等过程成功获得了黄梁木离体再生植株,建立黄梁木高效再生体系,对于进行黄梁木优良品种的快速繁殖和大面积推广、促进黄梁木的产业化发展具有重要意义,并且为黄梁木遗传转化体系的构建奠定了基础,从而为在黄梁木中进行基因功能等分子生物学研究提供平台。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域,具体涉及一种以黄梁木叶片为外植体的高效再生方法。
背景技术
黄梁木(Neolamarckia cadamba)别名团花树,属茜草科团花属常绿阔叶乔木,在我国的华南地区广泛分布(Ouyang et al,2013)。高可达35m,胸径可达1m,树干通直圆满,10年左右成材,胸径可达40~50cm,衰退期晚,适合于培养大径级用材,5年以前为高生长期,年平均高生长量达3.0~3.5m,5~10年为直径生长旺期,年平均生长量达3~4cm(邓小梅等,2011)。由于其生长十分快速,在菲律宾被称颂为“宝石树”(Fox,1971),并在1972年的世界林业大会上被称为“奇迹树”。黄梁木材质良好,其木材淡黄色,纹理通直,锯刨切削容易,顺纹刨面光滑,且干燥快,不易开裂变形;可作家具、建材等,同时也是人造纤维、纤维板、胶合板等工业的理想原料。目前,黄梁木种苗主要通过种子播种方式繁育,存在周期长、成本高、效率低下等问题;种子播种虽然容易获得大量幼苗,然而经种子繁育的后代易发生性状分离,遗传性状不稳定,易丢失亲本的优良性状;黄梁木的种子也不耐贮藏,一年后种子活力就下降50%,随着贮藏时间延长,种子萌发率越来越低。因此,釆用植物组织培养技术来缓解其种苗紧张压力、进行可持续开发利用是十分必要的。
关于黄梁木的组织培养,国内外已有的报道分别为:1)用带芽茎段扩繁,但扩繁的速度慢、效率低,远不及通过不定芽诱导;2)以子叶和下胚轴为外植体,通过不定芽诱导构建再生体系,但这些材料过于幼嫩,在建立遗传转化体系过程中易损伤、操作不便,并且以此材料进行转基因功能研究时,缺少遗传背景一致的对照植株,不能准确验证基因功能。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足,本发明的目的在于提供一种以黄梁木叶片为外植体的高效再生方法。该方法以叶片为外植体,操作更简便、取材更广泛、扩繁更高效。通过诱导不定芽、丛生芽增殖、试管苗生根、炼苗移栽等阶段成功获得了黄梁木离体再生植株,建立黄梁木高效再生体系。
本发明的目的通过下述技术方案实现:
一种以黄梁木叶片为外植体的高效再生方法,包括如下步骤:
(1)不定芽的诱导:选取继代无菌苗的嫩叶为外植体,除去边缘并横向切2~3刀增加伤口;接种到诱导培养基上,于25~28℃条件下全暗培养3~4天,再转移至光照强度为1500~2500lx,光照时间12~15小时,培养温度为25~28℃的条件下培养,直至诱导形成不定芽;诱导率可达89%以上。
(2)继代培养:将步骤(1)获得的不定芽从基部切下,接种到增殖培养基上进行继代培养,接种后置于每天光照13~15小时,光照强度为2000~2500lx,培养温度为25~28℃的条件下培养。增殖系数达7.42~8.13。
步骤(1)中所述的诱导培养基为:MS+0.1~0.3mg/L TDZ+0.5~1.5mg/L 2,4-D+1.0~3.0mg/L IBA+15~30g/L蔗糖+3.5~6.0g/L琼脂,pH为5.4~5.8;
步骤(2)中所述的增殖培养基为:MS+2.0~4.0mg/L 6-BA+0.5~2.0mg/L NAA+15~30g/L蔗糖+3.5~6.0g/L琼脂,pH为5.4~5.8。
为了更好的实现本发明,还包括如下步骤:
(3)生根培养:将步骤(2)继代培养长至2~4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根,接种后先在25~28℃条件下全暗培养3~5天,然后置于每天光照12~15小时,光照强度为1500~2500lx,培养温度为25~28℃的条件下培养至生根;生根率可达96%以上。
(4)炼苗移栽:将长至6~8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗3~5天后,将试管苗从培养瓶中取出,洗掉根部培养基,栽入由泥炭土基质中并定植于塑料盆中。
步骤(3)中所述的生根培养基为:1/2MS+0.5~1.5mg/L IBA+0.5~1.5mg/L GGR+15~30g/L蔗糖+3.5~6.0g/L琼脂,pH为5.4~5.8。
本发明的机理是:本发明利用植物组织培养技术进行黄梁木种苗规模化生产,建立了黄梁木的组织培养快繁方法,具有简单、易行、经济的特点。通过本发明育成的黄梁木组培苗移栽成活率达到98%以上,可以为黄梁木规模化种植提供优质种苗保障。
本发明相对于现有技术,具有如下的优点及效果:
本发明以叶片作为外植体有其巨大的优势,取材方便、操作容易、来源广泛,有利于再生及遗传转化的重复进行等。因此,本发明以黄梁木无菌苗嫩叶为外植体,通过不定芽诱导、增殖、生根、炼苗移栽等过程成功获得了黄梁木离体再生植株,建立黄梁木高效再生体系,对于进行黄梁木优良品种的快速繁殖和大面积推广、促进黄梁木的产业化发展具有重要意义,并且为黄梁木遗传转化体系的构建奠定了基础,从而为在黄梁木中进行基因功能等分子生物学研究提供平台。
附图说明
图1是本发明的以黄梁木叶片为外植体的高效再生过程;其中,图A为继代无菌苗的嫩叶片,用于本发明中的外植体材料;图B和C为在MS+0.1~0.3mg/L TDZ+0.5~1.5mg/L2,4-D+1.0~3.0mg/L IBA+15~30g/L蔗糖+3.5~6.0g/L琼脂,pH为5.4~5.8的芽诱导培养上培养直至长出不定芽;图D为在MS+2.0~4.0mg/L 6-BA+0.5~2.0mg/L NAA+15~30g/L蔗糖+3.5~6.0g/L琼脂,pH为5.4~5.8的增殖培养基上培养丛生芽;图E为在1/2MS+0.5~1.5mg/L IBA+0.5~1.5mg/L GGR+15~30g/L蔗糖+3.5~6.0g/L琼脂,pH为5.4~5.8的生根培养基上诱导出根;图F为炼苗成活的黄梁木植株。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述,但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
(1)诱导不定芽:选取继代无菌苗的嫩叶为外植体,除去边缘并横向切2~3刀增加伤口。接种到诱导培养基上,于25℃条件下全暗培养3天,再转移至光照强度为1500lx,光照时间12小时,培养温度为25℃的条件下培养,直至诱导形成不定芽,不定芽诱导率可达92.7%。所述的诱导培养基为:MS+0.1mg/L TDZ+0.5mg/L 2,4-D+1.0mg/L IBA+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂,pH为5.5;
(2)继代培养:将步骤(1)获得的不定芽从基部切下,接种到增殖培养基上进行继代培养,接种后置于每天光照13小时,光照强度为2500lx,培养温度为25℃的条件下培养,20天转接一次,增殖系数为7.64。所述的增殖培养基为:MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+25g/L蔗糖+5.0g/L琼脂,pH为5.5;
(3)生根培养:将步骤(2)继代培养长至2~4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根,接种后先在25℃条件下全暗培养3天,然后置于每天光照12小时,光照强度为1500lx,培养温度为25℃的条件下培养7天即开始生根,生根率可达96.2%。所述的生根培养基为:1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L GGR(注:双吉尔-GGR,购自北京艾比蒂研究开发中心)+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂,pH为5.4;
(4)炼苗移栽:将长至6~8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗5天后,将试管苗从培养瓶中取出,洗掉根部培养基,栽入泥炭土基质中并定植于塑料盆中,移栽成活率为100%。
实施例2
(1)诱导不定芽:选取继代无菌苗的嫩叶为外植体,除去边缘并横向主叶脉切3刀增加伤口。接种到诱导培养基上,于26℃条件下全暗培养4天,再转移至光照强度为2000lx,光照时间13小时,培养温度为26℃的条件下培养,直至诱导形成不定芽,不定芽诱导率可达95.4%。所述的诱导培养基为:MS+0.2mg/L TDZ+1.0mg/L 2,4-D+2.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+3.5g/L琼脂,pH为5.4;
(2)继代培养:将步骤(1)获得的不定芽从基部切下,接种到增殖培养基上进行继代培养,接种后置于每天光照14小时,光照强度为2000lx,培养温度为26℃的条件下培养,25天转接一次,增殖系数为8.13。所述的增殖培养基为:MS+3.0mg/L 6-BA+1.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂,pH为5.8;
(3)生根培养:将步骤(2)继代培养长至2~4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根,接种后先在26℃条件下全暗培养4天,然后置于每天光照15小时,光照强度为2000lx,培养温度为26℃的条件下培养10天即开始生根,生根率可达97%。所述的生根培养基为:1/2MS+1.5mg/L IBA+1.0mg/L GGR(注:双吉尔-GGR,购自北京艾比蒂研究开发中心)+20g/L蔗糖+5.0g/L琼脂,pH为5.8;
(4)炼苗移栽:将长至6~8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗4天后,将试管苗从培养瓶中取出,洗掉根部培养基,栽入泥炭土基质中并定植于塑料盆中,移栽成活率为100%。
实施例3
(1)诱导不定芽:选取继代无菌苗的嫩叶为外植体,除去边缘并横向主叶脉切3刀增加伤口。接种到诱导培养基上,于28℃条件下全暗培养4天,再转移至光照强度为2500lx,光照时间15小时,培养温度为28℃的条件下培养,直至诱导形成不定芽,不定芽诱导率可达89.1%。所述的诱导培养基为:MS+0.3mg/L TDZ+1.5mg/L 2,4-D+3.0mg/L IBA+15g/L蔗糖+6.0g/L琼脂,pH为5.4;
(2)继代培养:将步骤(1)获得的不定芽从基部切下,接种到增殖培养基上进行继代培养,接种后置于每天光照15小时,光照强度为2500lx,培养温度为28℃的条件下培养,20天转接一次,增殖系数为7.42。所述的增殖培养基为:MS+4.0mg/L 6-BA+2.0mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂,pH为5.8;
(3)生根培养:将步骤(2)继代培养长至2~4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根,接种后先在28℃条件下全暗培养5天,然后置于每天光照14小时,光照强度为2500lx,培养温度为28℃的条件下培养7天即开始生根,生根率可达100%。所述的生根培养基为:1/2MS+1.0mg/L IBA+1.5mg/L GGR(注:双吉尔-GGR,购自北京艾比蒂研究开发中心)+30g/L蔗糖+6.0g/L琼脂,pH为5.8;
(4)炼苗移栽:将长至6~8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗3天后,将试管苗从培养瓶中取出,洗掉根部培养基,栽入泥炭土基质中并定植于塑料盆中,移栽成活率为98%。
上述实施例为本发明较佳的实施方式,但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制,其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化,均应为等效的置换方式,都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (5)
1.一种以黄梁木叶片为外植体的高效再生方法,其特征在于包括如下步骤:
(1)不定芽的诱导:选取继代无菌苗的嫩叶为外植体,除去边缘并横向切2~3刀增加伤口;接种到诱导培养基上,于25~28℃条件下全暗培养3~4天,再转移至光照强度为1500~2500lx,光照时间12~15小时,培养温度为25~28℃的条件下培养,直至诱导形成不定芽;
(2)继代培养:将步骤(1)获得的不定芽从基部切下,接种到增殖培养基上进行继代培养,接种后置于每天光照13~15小时,光照强度为2000~2500lx,培养温度为25~28℃的条件下培养。
2.根据权利要求1所述的以黄梁木叶片为外植体的高效再生方法,其特征在于:步骤(1)中所述的诱导培养基为:MS+0.1~0.3mg/L TDZ+0.5~1.5mg/L 2,4-D+1.0~3.0mg/LIBA+15~30g/L蔗糖+3.5~6.0g/L琼脂,pH为5.4~5.8。
3.根据权利要求1所述的以黄梁木叶片为外植体的高效再生方法,其特征在于:步骤(2)中所述的增殖培养基为:MS+2.0~4.0mg/L 6-BA+0.5~2.0mg/L NAA+15~30g/L蔗糖+3.5~6.0g/L琼脂,pH为5.4~5.8。
4.根据权利要求1~3任一项所述的以黄梁木叶片为外植体的高效再生方法,其特征在于还包括如下步骤:
(3)生根培养:将步骤(2)继代培养长至2~4cm的不定芽分切并接种到生根培养基上进行诱导生根,接种后先在25~28℃条件下全暗培养3~5天,然后置于每天光照12~15小时,光照强度为1500~2500lx,培养温度为25~28℃的条件下培养至生根;
(4)炼苗移栽:将长至6~8cm的生根试管苗的培养瓶瓶盖打开并置于自然光照下炼苗3~5天后,将试管苗从培养瓶中取出,洗掉根部培养基,栽入由泥炭土基质中并定植于塑料盆中。
5.根据权利要求4所述的以黄梁木叶片为外植体的高效再生方法,其特征在于:步骤(3)中所述的生根培养基为:1/2MS+0.5~1.5mg/L IBA+0.5~1.5mg/L GGR+15~30g/L蔗糖+3.5~6.0g/L琼脂,pH为5.4~5.8。
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