CN103782903A

CN103782903A - 一种黄梁木植株高效再生方法

Info

Publication number: CN103782903A
Application number: CN201310585131.6A
Authority: CN
Inventors: 陈晓阳; 黄浩; 欧阳昆唏; 李俊成
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2013-11-19
Filing date: 2013-11-19
Publication date: 2014-05-14

Abstract

本发明涉及一种黄梁木植株高效再生方法，在不同激素成份及浓度水平下，以DCR、MS为基本培养基，20d～25d无菌苗的子叶和下胚轴为外植体，经不定芽诱导分化、芽增殖和生根培养，形成完整植株小苗，将小苗移栽到育苗基质和种植到大田中，长大的植株与实生苗植株在形态上无明显差异；本发明应用生物技术方法克服种子幼苗高度参差不齐、个体分化大、育苗周期长等问题，提供一种高效、稳定的黄梁木植株再生方法；该方法可进行规模化、工厂化快速育苗，生产出健壮、整齐一致的黄梁木幼苗，不仅可满足市场对黄梁木种苗的需求，而且可以通过转基因研究对黄梁木种质资源进行改良和创新，为黄梁木种质资源的可持续利用奠定基础。

Description

一种黄梁木植株高效再生方法

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及黄梁木无菌苗子叶、下胚轴的组织培养和植株高效再生的方法。

背景技术

黄梁木(Neolamarckia cadamba)属茜草科(Rubiaceae)多用途、速生的高大乔木，原产中国云南、广东、广西以及越南、缅甸、马来西亚等地，5年生以前为高生长旺期，年平均高生长量3.0m～3.5m；其材质好，木材淡黄色，纹理通直，顺纹刨面光滑，干燥快，不易开裂变形，可作家具、建材、人造纤维、胶合板等原料；花是良好蜜源，果实可以食用，树皮提取物可用做香料精及治疗蛇咬伤、糖尿病、发烧、贫血、霍乱等多种疾病；枝叶可做家畜饲料；黄梁木全身是宝，被人们誉为“宝石之树”和“奇迹树”，是一种极具发展前景的乡土阔叶树种。

目前，人工栽培所需的幼苗大多通过种子播种经自然繁殖的方式获得，这种方式获得的幼苗生长慢，高度参差不齐，个体分化大，育苗周期长；另外，黄梁木植株的嫩枝和顶芽对低温较敏感，在12h的-2℃低温下就产生冻害甚至死亡，严重影响植株生长和树干的通直度，所以，黄梁木在国内仅分布于有较短时间(或无)零下低温的云南盈江、沧源、西双版纳、河口、文山等以南，广西南宁的南部，海南省，广东湛江至福建厦门沿海一带以及江西省、台湾省等地区；这些原因对黄梁木的人工栽培产生较大影响。

采用带腋芽的茎段、萌芽条作为外植体，分别诱导出腋芽和顶芽，然后进行增殖、生根和移栽的试验已有获得成功的报道(林良科等，2007；林碧珍，2009；詹艳玲，2010)；由于黄梁木茎段和萌芽条的髓部均为疏松的填充物，极易带有病菌，很难彻底消毒，经验证，通过茎段和萌芽条外植体获得无菌苗的机率极低，效率不高，技术很不稳定。

所以，利用黄梁木无菌苗子叶、下胚轴为外植体，通过组织培养技术建立稳定、可靠的植株高效再生技术体系，不仅能满足市场对种苗需求，而且可以通过转基因研究对黄梁木种质资源进行改良和创新，为黄梁木种质资源可持续利用奠定基础。

发明内容

本发明针对目前黄梁木种子自然繁殖育苗生长慢，幼苗高度参差不齐，个体分化大，育苗周期长，影响人工栽培的问题，提供一种稳定、可靠的黄梁木高效植株再生方法。

本发明技术方案如下，主要特点是：

A无菌苗的获得：将种子置于40℃恒温摇床上震荡浸泡24h～48h；在无菌超净台上，用10％NaClO溶液灭菌10min～15min，无菌水彻底冲洗5次，将种子播于不含任何激素的MS培养基中培养，培养基pH值为6.0，培养温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h。

B子叶和下胚轴外植体的获得：种子培养20d～25d后，无菌苗高度约为1cm，切取带子叶柄的1对子叶、下胚轴作为外植体。

C不定芽的诱导分化：将外植体接种到添加TDZ1.0mg/L～5.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L的DCR培养基中培养；培养20d～30d后，将外植体转移到添加6-BA3.0mg/L～5.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L的DCR培养基中培养；接种时，子叶的上表面朝上、下胚轴平行置于分化培养基中，培养基pH值为6.0，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h。

D增殖培养：在无菌超净台上，从分化出丛生芽的外植体中切取健壮的单芽，接种于添加6-BA1.0mg/L+IBA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L的MS基本培养基中培养，培养基pH值为6.0，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h。

E生根培养：选取增殖培养得到的健壮单株幼苗，切取带2-3个节的顶芽，接种于1/2MS+IBA0.1mg/L和NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L的生根培养基进行诱导生根，培养基pH值为6.0，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h。

F炼苗与移栽：生根培养10d后，将带瓶的组培苗移到温室中适应外界环境1d，然后将组培瓶盖从半开到全开炼苗，喷雾保持瓶内湿度；3d后将组培苗小心取出，洗净粘于根上的培养基，移栽到黄土和泥炭土混合比例为1：2的基质上，在移栽一周内，控制相对湿度75％～85％，温度20℃～35℃；10d后按生长需求浇水。

所述黄梁木植株高效再生方法的延伸技术方案包括：步骤A中涉及的种子浸泡、消毒方法和时间、步骤B中子叶和下胚轴外植体的取材方法以及步骤C、D和E中黄梁木组织培养和植物再生方法所述的培养基中涉及的植物生长激素，包括苯基噻二唑基脲(TDZ)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA)中的一种或几种。

所述黄梁木植株高效再生方法的延伸技术方案包括：步骤A中涉及的将种子置于40℃恒温摇床上震荡浸泡24h～48h和种子消毒试剂10％的NaClO溶液灭菌10min～15min。

所述黄梁木植株高效再生方法的延伸技术方案包括：步骤B所涉及的子叶和下胚轴外植体取材方法。

所述黄梁木植株高效再生方法的延伸技术方案包括：步骤C所涉及的植物生长激素包括为TDZ1.0mg/L～5.0mg/L，6-BA3.0mg/L～5.0mg/L，NAA0.05mg/L。

所述黄梁木植株高效再生方法的延伸技术方案包括：步骤C所涉及的子叶和下胚轴在分化培养基上的放置方法。

所述黄梁木植株高效再生方法的延伸技术方案包括：步骤D中所涉及的植物生长激素为6-BA1.0mg/L和IBA0.05mg/L。

所述黄梁木植株高效再生方法的延伸技术方案包括：步骤E中所涉及的植物生长激素为IBA0.1mg/L和NAA0.05mg/L。

本发明的高效组织培养和植株再生方法，可摆脱外界条件的影响，规模化和工厂化生产出健壮、整齐一致的黄梁木组培幼苗；经试验，在大田种植2年的组培苗植株在形态上与实生苗植株无明显差异；该方法不仅能满足市场对种苗的需求，并且可以通过转基因研究对黄梁木种质资源进行遗传改良和创新，为黄梁木种质资源的可持续利用奠定基础。

附图说明

图1为25d种子无菌苗，用于切取子叶和下胚轴外植体(子叶已切下)。

图2为在含TDZ2.0mg/L+NAA0.05mg/L分化培养基上培养25d的子叶外植体。

图3为在含TDZ2.0mg/L+NAA0.05mg/L分化培养基上培养25d的下胚轴外植体。

图4为培养25d后的外植体在含6-BA4.0mg/L+NAA0.05mg/L分化培养基上的丛生芽。

图5为在增殖培养基上生长的继代苗。

图6为在生根培养基中，根的诱导状况。

图7为移栽的黄梁木植株。

具体实施方式

结合实施例对本发明进行详细说明。

实施例一黄梁木不定芽诱导

将种子置于40℃恒温摇床上震荡浸泡48h；在无菌超净台上，用10％NaClO溶液灭菌15min，无菌水彻底冲洗5次，将种子播于不含任何激素的MS培养基中，培养基pH值为6.0，置于温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h的光照培养室培养。

培养25d后，切取带子叶柄的子叶、下胚轴作为外植体，将子叶上表面朝上、下胚轴平行于培养基表面，放在添加TDZ2.0mg/L+NAA0.05mg/L的DCR分化培养培养基中，培养25d后，外植体的分化诱导率达100％，并有少量不定芽形成。

将培养的外植体转接到添加6-BA4.0mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L的DCR分化培养基中，培养30d后，每个外植体分化出的不定芽大于30个。

实施例二黄梁木增殖、生根培养和移栽

从分化出丛生芽的外植体中切取健壮的单芽，，转接到MS+6-BA1.0mg/L+IBA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L的增殖培养基中培养，3周后，增殖系数和有效芽分别高达5.92和2.96个。

选取健壮的有效芽，转接到1/2MS+IBA0.1mg/L+NAA0.05mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L的生根诱导培养基中培养，15d后，不定根的诱导率为95.4％，平均生根6.04条，平均根长0.89cm。

将生根培养10d的组培苗带瓶移至温室中，适应外界环境1d，然后逐步将组培瓶盖从半开到全开炼苗，并喷雾保湿，3d后将组培苗小心取出并洗净粘于根上的培养基，移栽到黄土和泥炭土混合比例为1：2的混合基质上；移栽一周内，保持相对湿度75％～85％，温度20℃～35℃；10d后按生长需求浇水，该移栽成活率高于95％。

上述实例的组织培养和植株再生状况见附图。

以上结合附图对本发明的具体实施方式作了说明，但这些说明不能被理解为限制了本发明的范围，本发明的保护范围由随附的权利要求书限定，任何在本发明权利要求基础上的改动都是本发明的保护范围。

Claims

1.本发明所述的一种黄梁木植株高效再生方法，其主要特征在于：

A无菌苗的获得：将种子置于40℃恒温摇床上震荡浸泡24h～48h；在无菌超净台上，用10％NaClO溶液灭菌10min～15min，无菌水彻底冲洗5次，将种子播于不含任何激素的MS培养基中培养。

B子叶和不胚轴外植体的获得：种子培养20d～25d后，切取无菌苗中带子叶柄的子叶和下胚轴作为外植体。

C不定芽诱导分化：将外植体接种于添加TDZl.0～5.0mg/L+NAA0.05mg/L的DCR培养基中；培养20d～30d后，将外植体转移到添加6-BA3.0～5.0mg/L+NAA0.05mg/L的DCR培养基中培养。

D增殖培养：在超净台上，从外植体丛生芽中剪取粗壮的单株芽，接种于添加6-BA1.0mg/L+IBA0.05mg/L的MS培养基中培养。

E生根培养：选取增殖培养得到的健壮幼苗，切掉腋芽和稍大的叶片，置于1/2MS+IBA0.1mg/L和NAA0.05mg/L生根培养基诱导生根。

2.根据权利要求1所述的黄梁木植株高效再生方法，其特征在于步骤A中所涉及的种子浸泡、消毒方法和时间、步骤B中子叶和下胚轴外植体的取材方法以及步骤C、D和E中黄梁木组织培养和植物再生方法所述的培养基中涉及的植物生长激素，包括苯基噻二唑基脲(TDZ)、6-苄基腺嘌呤(6-BA)、吲哚丁酸(IBA)和萘乙酸(NAA)中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的黄梁木植株高效再生方法，其特征在于步骤A中所涉及的将种子置于40℃恒温摇床上震荡浸泡24h～48h和种子消毒试剂10％的NaClO溶液灭菌10min～15min。

4.根据权利要求1所述的黄梁木植株高效再生方法，其特征在于步骤B所涉及的子叶和下胚轴外植体取材方法。

5.根据权利要求1所述的黄梁木植株高效再生方法，其特征在于步骤C所涉及的植物生长激素和浓度，包括TDZ1.0mg/L～5.0mg/L，6-BA3.0mg/L～5.0mg/L，NAA0.05mg/L。

6.根据权利要求1所述的黄梁木植株高效再生方法，其特征在于步骤C所涉及的子叶上表面朝上、下胚轴平行置于分化培养基中的接种方法。

7.根据权利要求1所述的黄梁木植株高效再生方法，其特征在于步骤D中所涉及的植物生长激素和浓度为6-BA1.0mg/L和IBA0.05mg/L。

8.根据权利要求1所述的黄梁木植株高效再生方法，其特征在于步骤E中所涉及的植物生长激素为IBA0.1mg/L和NAA0.05mg/L。