CN102860256A - 一种油棕组织培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属植物组织培养的培养基，具体地涉及一种油棕组织培养的方法，是切取油棕母株茎干生长点上的油棕茎段，然后取油棕嫩叶修剪成片样，接种到愈伤组织诱导培养基、胚性愈伤组织培养基、胚状体培养基中培养，获得油棕体细胞胚；将体细胞胚接种到芽诱导培养基、生根培养基、液体生根培养基中培养，获得油棕试管苗。本发明以油棕嫩叶作为外植体材料，利用组织培养技术对油棕进行快速繁殖，不受季节与气候的限制，可有效地大量繁殖油棕后代，极大的缩短了常规育种的繁殖周期，且后代遗传性状与亲本高度一致，为油棕良种的大面积推广应用提供一条有效途径。
Description
技术领域
本发明属植物组织培养的培养基，具体地涉及一种油棕组织培养的方法，利用培养基对油棕组织进行培养与快速繁殖，为油棕良种的大面积推广应用提供了技术支持。
背景技术
油棕原产地在南纬10°～北纬15°、海拔150米以下的非洲潮湿森林边缘地区，主要产地分布在亚洲的马来西亚、印度尼西亚、非洲的西部和中部、南美洲的北部和中美洲。我国引种油棕已有80多年的历史，主要分布于海南、云南、广东等地。油棕属热带木本油料作物，其单产是其它油料作物的几倍至数十倍，有“世界植物油王”之称。目前棕榈油的产量已经超过大豆油跃居为世界第一大油料作物，广泛应用于食品和工业产品中。
油棕目前是通过杂交种子进行繁殖，由于油棕的高度杂合性，后代性状分离严重，通过杂交育种方法繁殖油棕良种需要25～30年的时间。油棕只有一个生长点，因此常规的无性繁殖手段如扦插、嫁接都不能进行繁殖，因此油棕组织培养技术是在较短时间内繁殖油棕优良单株的有效途径。目前的实验结果表明通过油棕组织培养技术培育的油棕高产无性系，可比现有的主栽品种产量提高25～30%，因此有良好的市场应用前景和很高的商业化价值。
以油棕种胚和以非油棕种胚为外植体材料进行繁殖的主要区别在于，以油棕种胚为材料繁殖相当于无性繁殖油棕种子，而以非油棕种胚为外植体材料繁殖相当于无性繁殖油棕母树。目前，国内尚未有相关油棕组织培养基以及培养方法的报道，特别是应用非油棕种胚为外植体材料进行繁殖的方法。由于油棕后代的高度杂合性，以非油棕种胚为外植体材料繁殖具有商业化种植的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种油棕组织培养的方法，以油棕嫩叶作为外植体材料，利用组织培养技术对油棕进行快速繁殖，可有效地大量繁殖油棕后代，且后代遗传性状与亲本高度一致，具有高产、优质、抗逆性强等优良性状，为油棕良种的大面积推广应用提供一条有效途径。
本发明所采用的技术方案：
一种油棕组织培养的方法，其步骤如下：
1、外植体的选取
选取树龄8～10年的油棕母株，切取茎干生长点上15cm至95cm处的油棕茎段，经表面除杂、清洗后进行消毒处理，然后将晾干后的外植体转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。油棕母株的切面在外植体采集后，对切面进行防护处理，待恢复生长后可以重新取样。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50～65%的条件下进行暗培养，得到愈伤组织；将得到的愈伤组织转接入胚性愈伤组织培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50～65%的条件下暗培养，获得胚性愈伤组织。
3、体细胞胚的培养
将胚性愈伤组织转接到胚状体培养基中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%，每2个月继代一次，培养6～12个月后在胚性愈伤组织表面会出现白色的胚状体组织即为体细胞胚。
4、试管芽苗培养
将体细胞胚接种到芽诱导培养基中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%，培养60～90天获得油棕试管芽苗。所述芽诱导培养基是以改良MS培养基为基础培养基，并添加NAA 0.01～0.05mg/L、活性炭1000～5000mg/L、蔗糖30g/L、琼脂粉7g/L。
所述改良MS培养基是以MS培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整大量元素的含量为原量的1/4至全量，调整肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和烟酸的含量分别为：0.1～5mg/L、0.1～5mg/L、0.1～5mg/L、0.1～5mg/L，并添加精氨酸50～300mg/L、天冬氨酸50～300mg/L、谷氨酸50～300mg/L。
5、生根培养
将油棕试管芽苗切分成单株，接种到生根培养基中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%；培养3个月后再将油棕芽苗转接至液体生根培养基中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%，培养60天后获得油棕试管苗。所述生根培养基是以改良MS培养基为基础培养基，并添加NAA 10～30mg/L、活性炭1000～5000mg/L、蔗糖30g/L、琼脂粉7g/L。所述液体生根培养基以改良MS培养基为基础培养基，并添加NAA 5～30mg/L、活性炭1000～5000mg/L、琼脂粉7g/L。
本发明以油棕嫩叶作为外植体材料，利用组织培养技术对油棕进行快速繁殖，不受季节与气候的限制，可有效地大量繁殖油棕后代，极大的缩短了常规育种的繁殖周期，且后代遗传性状与亲本高度一致，为油棕良种的大面积推广应用提供一条有效途径。
附图说明
图1 从油棕胚状体中诱导出的油棕试管芽苗。
图2 诱导出的油棕丛芽苗。
图3 油棕丛芽进行分株。
图4 油棕生根培养。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一
1、外植体的选取
选取树龄8年的油棕高产优质母株5株，切取茎干生长点上15cm至95cm处的油棕茎段，将得到的油棕茎干除去表面杂质后，在油棕茎干表面喷涂75%的酒精进行杀菌，晾干，然后将晾干的油棕茎干转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下进行暗培养，培养100天后得到愈伤组织；将得到的愈伤组织转接入胚性愈伤组织培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下暗培养，培养90天后获得胚性愈伤组织。
3、体细胞胚的培养
将胚性愈伤组织在超净工作台上及无菌条件下，转接到胚状体培养基中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%的条件下，进行胚状体诱导培养，经180天培养，获得油棕体细胞胚。
4、试管芽苗培养
在超净工作台上及无菌条件下，将体细胞胚接种到芽诱导培养基（改良MS培养基+ NAA 0.01mg/L +活性炭2000mg/L +蔗糖30g/L +琼脂粉7g/L，其中MS培养基中大量元素的含量是原量的1/3）中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%。培养60天后获得油棕试管芽苗，结果见表1。
5、生根培养
在超净工作台上及无菌条件下，将油棕试管芽苗按照芽苗数量切分成单株，切掉基部组织和部分叶片，然后接种到生根培养基（改良MS培养基+ NAA 10mg/L +活性炭2000mg/L +蔗糖30g/L +琼脂粉7g/L，其中MS培养基中大量元素的含量是原量的1/3）中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%。培养3个月后再将油棕芽苗转接至液体生根培养基（改良MS培养基+ NAA 5mg/L +活性炭2000mg/L +琼脂粉7g/L，其中MS培养基中大量元素的含量是原量的1/3）中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%。培养60天后获得油棕试管苗，结果见表1。
实施例二
选取树龄9年的油棕高产优质母株5株，切取茎干生长点上15cm至95cm处的油棕茎段，将得到的油棕茎干除去表面杂质后，在油棕茎干表面喷涂75%的酒精进行杀菌，晾干，然后将晾干的油棕茎干转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下进行暗培养，培养100天后得到愈伤组织；将得到的愈伤组织转接入胚性愈伤组织培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下暗培养，培养90天后获得胚性愈伤组织。
3、体细胞胚的培养
将胚性愈伤组织在超净工作台上及无菌条件下，转接到胚状体培养基中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%的条件下，进行胚状体诱导培养，经180天培养，获得油棕体细胞胚。
4、试管芽苗培养
在超净工作台上及无菌条件下，将体细胞胚接种到芽诱导培养基（改良MS培养基+ NAA 0.03mg/L +活性炭3000mg/L +蔗糖30g/L +琼脂粉7g/L，其中MS培养基中大量元素的含量是原量的1/2）中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%。培养60天后获得油棕试管芽苗，结果见表1。
5、生根培养
在超净工作台上及无菌条件下，将油棕试管芽苗按照芽苗数量切分成单株，切掉基部组织和部分叶片，然后接种到生根培养基（改良MS培养基+ NAA 20mg/L +活性炭3000mg/L +蔗糖30g/L +琼脂粉7g/L，其中MS培养基中大量元素的含量是原量的1/2）中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%。培养3个月后再将油棕芽苗转接至液体生根培养基（改良MS培养基+ NAA 20mg/L+活性炭3000mg/L +琼脂粉7g/L，其中MS培养基中大量元素的含量是原量的1/2）中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%。培养60天后获得油棕试管苗，结果见表1。
实施例三
选取树龄10年的油棕高产优质母株5株，切取茎干生长点上15cm至95cm处的油棕茎段，将得到的油棕茎干除去表面杂质后，在油棕茎干表面喷涂75%的酒精进行杀菌，晾干，然后将晾干的油棕茎干转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下进行暗培养，培养100天后得到愈伤组织；将得到的愈伤组织转接入胚性愈伤组织培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下暗培养，培养90天后获得胚性愈伤组织。
3、体细胞胚的培养
将胚性愈伤组织在超净工作台上及无菌条件下，转接到含有胚状体培养基中，然后将其置于普通日光灯为光源的环境下，在光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%的条件下，进行胚状体诱导培养，经180天培养，获得油棕体细胞胚。
4、试管芽苗培养
在超净工作台上及无菌条件下，将体细胞胚接种到芽诱导培养基（改良MS培养基+ NAA 0.04mg/L +活性炭4500mg/L +蔗糖30g/L +琼脂粉7g/L，其中MS培养基中大量元素的含量不变）中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%。培养60天后获得油棕试管芽苗，结果见表1。
5、生根培养
在超净工作台上及无菌条件下，将油棕试管芽苗按照芽苗数量切分成单株，切掉基部组织和部分叶片，然后接种到生根培养基（改良MS培养基+ NAA 25mg/L +活性炭4000mg/L +蔗糖30g/L +琼脂粉7g/L，其中MS培养基中大量元素的含量不变）中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%。培养3个月后再将油棕芽苗转接至液体生根培养基（改良MS培养基+ NAA 25mg/L +活性炭4000mg/L +琼脂粉7g/L，其中MS培养基中大量元素的含量不变）中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%。培养60天后获得油棕试管苗，结果见表1。
表1油棕组织的诱导率
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (1)
1.一种油棕组织培养的方法，其特征在于，其步骤如下：
1）、外植体的选取
选取树龄8～10年的油棕母株，切取茎干生长点上15cm至95cm处的油棕茎段，经表面除杂、清洗后进行消毒处理，然后将晾干后的外植体转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶；
2）、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50～65%的条件下进行暗培养，得到愈伤组织；将得到的愈伤组织转接入胚性愈伤组织培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50～65%的条件下暗培养，获得胚性愈伤组织；
3）、体细胞胚的培养
将胚性愈伤组织转接到胚状体培养基中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%，每2个月继代一次，培养6～12个月后在胚性愈伤组织表面会出现白色的胚状体组织即为体细胞胚；
4）、试管芽苗培养
将体细胞胚接种到芽诱导培养基中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%，培养60～90天获得油棕试管芽苗；所述芽诱导培养基是以改良MS培养基为基础培养基，并添加NAA 0.01～0.05mg/L、活性炭1000～5000mg/L、蔗糖30g/L、琼脂粉7g/L；
所述改良MS培养基是以MS培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整大量元素的含量为原量的1/4至全量，调整肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和烟酸的含量分别为：0.1～5mg/L、0.1～5mg/L、0.1～5mg/L、0.1～5mg/L，并添加精氨酸50～300mg/L、天冬氨酸50～300mg/L、谷氨酸50～300mg/L；
5）、生根培养
将油棕试管芽苗切分成单株，接种到生根培养基中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%；培养3个月后再将油棕芽苗转接至液体生根培养基中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为14小时，温度为25～28℃，湿度为50～65%，培养60天后获得油棕试管苗；所述生根培养基是以改良MS培养基为基础培养基，并添加NAA 10～30mg/L、活性炭1000～5000mg/L、蔗糖30g/L、琼脂粉7g/L；所述液体生根培养基以改良MS培养基为基础培养基，并添加NAA 5～30mg/L、活性炭1000～5000mg/L、琼脂粉7g/L。
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| C06 | Publication | ||
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20130109 |