CN110810243B - 一种椰枣的愈伤组织诱导培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种椰枣的愈伤组织诱导培养方法，属于植物组织培养技术领域。一种椰枣的愈伤组织诱导培养方法，包括以下步骤：将消毒后的椰枣外植体接种至愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养；将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养；两次培养条件为暗培养，培养温度24～29℃，湿度为55％～68％，每50～70天继代一次；椰枣外植体包括椰枣种子合子胚、椰枣分蘖苗或椰枣幼苗的茎尖分生组织和嫩叶。本发明提供的方法，操作简单，成本低，效率高，有利于后期规模化生产的应用。

Description

一种椰枣的愈伤组织诱导培养方法
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种椰枣的愈伤组织诱导培养方法。
背景技术
椰枣树(Phoenix dactylifera L.)是多年生雌雄异株棕榈植物，是一种重要的木本粮食作物，适应于干旱和半干旱环境。椰枣可以通过种子进行有性繁殖，也可以通过分蘖苗进行无性繁殖，然而这两种繁殖方式在经济上效率低下，不满足大量种植需求，也不能满足选择优良基因型进行繁殖扩增的需要，植物组织培养技术可以克服这些困难。
目前，我国椰枣组织培养技术研究较少，椰枣作为棕榈科植物之一，与草本植物相比，存在诱导愈伤组织困难，且所需诱导时间长的问题。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种提早愈伤组织形成时间，提高愈伤诱导率的椰枣的愈伤组织诱导培养方法。
本发明提供了一种椰枣的愈伤组织诱导培养方法，包括以下步骤：
1)将消毒后的椰枣外植体接种至愈伤组织诱导培养基上愈伤组织诱导培养；
所述愈伤组织诱导培养的条件为暗培养，培养温度24～29℃，湿度为55％～68％，每50～70天继代一次；
所述愈伤组织诱导培养基为以4.43g/L复合维生素的MS培养基为基础培养基，还包括70～120mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、0～50mg/L麦草畏、60～100mg/L肌醇、3～5g/L植物凝胶、2.5～4g/L活性炭、40～50mg/L维生素C、40～50mg/L柠檬酸和25～35g/L蔗糖，其中2,4-二氯苯氧乙酸和麦草畏的总浓度为120mg/L；灭菌前的愈伤组织诱导培养基的pH值为5.65～5.8；
2)将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养；
所述胚性愈伤组织培养的条件为暗培养，培养温度24～29℃，湿度为55％～68％，每50～70天继代一次；
所述胚性愈伤组织培养基是以4.43g/L复合维生素的MS培养基为基础培养基，包括7～10mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、0～3mg/L麦草畏、60～100mg/L肌醇、100～200mg/L酸水解酪蛋白、3～5g/L植物凝胶、2.5～4.5g/L活性炭和25～35g/L蔗糖，其中2,4-二氯苯氧乙酸和麦草畏的总浓度为10mg/L；灭菌前培养基pH值为5.65～5.8。
优选的，所述椰枣外植体包括椰枣种子合子胚、椰枣分蘖苗或椰枣幼苗的茎尖分生组织和嫩叶。
优选的，所述椰枣种子合子胚在消毒前进行切割处理，所述切割的方法包括以下步骤：
成熟椰枣果去除果肉，清洗，晾干，去除包裹在种子表面的内果皮和种子表皮，得到的椰枣种子剪掉两端，剪后两端分别距离发芽孔的距离为0.15～0.25cm，将含有种子棱状的一边从中间剪掉，留有包裹胚，剪后椰枣种子的形状为正方体，得到椰枣种子合子胚。
优选的，所述椰枣种子合子胚、椰枣分蘖苗或椰枣幼苗的消毒方法包括以下步骤：
采用漂白液对所述椰枣种子合子胚、椰枣分蘖苗或椰枣幼苗消毒3次，第一次消毒时间为5～6min，第二次和第三消毒的时间分别为10～15min，共消毒25～35min，椰枣种子合子胚、椰枣分蘖苗或椰枣幼苗与漂白液的体积比为1:5，消毒过程中伴随搅拌，消毒后用灭菌纯水清洗3～5次。
优选的，在所述消毒前，所述椰枣分蘖苗还包括预消毒和切割；
所述预消毒和切割的方法包括以下步骤：
将1年以上的分蘖苗从椰枣母株切下，在切口喷施体积浓度75％酒精后用灭菌锡箔纸包裹伤口，对分蘖苗整体清洗后用体积浓度75％酒精进行预消毒，预消毒后切取宽3～12cm、长5～15cm的茎尖或嫩叶作为椰枣分蘖苗的外植体。
优选的，在所述消毒前，所述椰枣幼苗还包括预消毒和切割；
所述预消毒和切割的方法包括以下步骤：
将2～3年的椰枣幼苗清洗后用体积浓度75％酒精进行预消毒，切取宽为3～12cm、长为5～15cm的茎尖或嫩叶作为椰枣幼苗的外植体。
优选的，所述椰枣种子合子胚、椰枣幼苗的外植体的嫩叶或椰枣分蘖苗的外植体的嫩叶的接种量为2～4个/培养瓶。
优选的，椰枣幼苗的外植体的茎尖或椰枣分蘖苗的外植体的茎尖的接种量为1～2个/培养瓶。
本发明提供了一种椰枣的愈伤组织诱导培养方法，将消毒后的椰枣外植体接种至愈伤诱导培养基上愈伤组织诱导培养，将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养，本发明通过限定愈伤组织培养基和胚性愈伤组织培养基的成分及培养条件，实现了愈伤组织诱导率高且培养时间短的特点。实验表明，椰枣种子合子胚愈伤组织诱导率达到96％～97.5％，椰枣茎尖分生组织愈伤组织诱导率达到88％～89.5％，椰枣嫩叶愈伤组织诱导率达到52％～56％，比对照组相应外植体的诱导率分别依次提高了94％～95.5％，3％～4.5％，4％～8％；愈伤组织出现的时间从愈伤组织诱导培养17～86d不等，比对照组相应外植体分别提前了10d～15d、13d～21d和9d～11d。同时，本发明提供的方法，操作简单，成本低，效率高，有利于后期规模化生产的应用。
进一步的，本发明提供的愈伤组织诱导培养方法，进一步限定了椰枣外植体来源包括椰枣种子合子胚、椰枣分蘖苗或椰枣幼苗，同时进一步限定了不同种类外植体的处理方法。椰枣与其它经济棕榈，如椰子、油棕相比不同，椰枣母株可以生出分蘖苗。以分蘖苗作为组织培养外植体具有以下优点，首先对母株的伤害性小，可以留有母株进行后续的观察，其次分蘖苗所处位置低，便于取样。以椰枣种子合子胚作为外植体时，椰枣果获得容易，椰枣树的产量高，椰枣果实处理后便于保存，并且市售椰枣果随时可以买到，不受时间限制，外植体数量大，来源广泛。实验证明，以椰枣种子合子胚为外植体进行培养，愈伤组织诱导培养45d～50d出现愈伤组织，诱导率为96％～97.5％；以椰枣分蘖苗或椰枣幼苗的茎尖分生组织进行培养，愈伤组织诱导培养17d～25d出现愈伤组织，诱导率为88％～89.5％；以椰枣分蘖苗或椰枣幼苗的嫩叶进行培养，愈伤组织诱导培养74d～86d出现愈伤组织，诱导率为52％～56％。该结果表明，不同种类的椰枣外植体采用相同的诱导培养方法获得的愈伤组织的时间以及诱导率存在差异，以椰果种子合子胚为外植体效果最优。
进一步的，本发明提供的方法进一步的限定了椰枣外植体的消毒方法，消毒所采用的消毒剂方便购买，对环境无明显污染，污染率低，对材料的损害小，缩短愈伤开始形成的时间；无需将外植体在抗氧化剂中浸泡，缩短操作时间，通过培养基配方可以有效防止外植体褐化。
附图说明
图1为椰枣种子合子胚、嫩片、茎尖分生组织诱导形成的愈伤组织形态图，其中，a为椰枣种子合子胚诱导形成的愈伤组织形态图，b为椰枣嫩片诱导形成的愈伤组织形态图，c为茎尖分生组织诱导形成的愈伤组织形态图。
具体实施方式
本发明提供了一种椰枣的愈伤组织诱导培养方法，包括以下步骤：
1)将消毒后的椰枣外植体接种至愈伤组织诱导培养基上愈伤组织诱导培养；
所述愈伤组织诱导培养的条件为暗培养，培养温度24～29℃，湿度为55％～68％，每50～70天继代一次；
所述愈伤组织诱导培养基是以4.43g/L复合维生素的MS培养基为基础培养基，还包括70～120mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、0～50mg/L麦草畏、60～100mg/L肌醇、3～5g/L植物凝胶、2.5～4g/L活性炭、40～50mg/L维生素C、40～50mg/L柠檬酸和25～35g/L蔗糖，其中2,4-二氯苯氧乙酸和麦草畏的总浓度为120mg/L；灭菌前的愈伤组织诱导培养基的pH值为5.65～5.8；
2)将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养；
所述胚性愈伤组织培养的条件为暗培养，培养温度24～29℃，湿度为55％～68％，每50～70天继代一次；
所述胚性愈伤组织培养基是以4.43g/L复合维生素的MS培养基为基础培养基，包括7～10mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、0～3mg/L麦草畏、60～100mg/L肌醇、100～200mg/L酸水解酪蛋白、3～5g/L植物凝胶、2.5～4.5g/L活性炭和25～35g/L蔗糖，其中2,4-二氯苯氧乙酸和麦草畏的总浓度为10mg/L；灭菌前培养基的pH值为5.65～5.8。
本发明将消毒后的椰枣外植体接种至愈伤组织诱导培养基上愈伤组织诱导培养。
在本发明中，所述椰枣外植体优选包括椰枣种子合子胚、椰枣分蘖苗或椰枣幼苗的茎尖分生组织和嫩叶。所述椰枣种子合子胚优选在消毒前进行切割处理，所述切割的方法包括以下步骤：成熟椰枣果去除果肉，清洗，晾干，去除包裹在种子表面的内果皮和种子表皮，得到的椰枣种子剪掉两端，剪后两端分别距离发芽孔的距离为0.15～0.25cm，将含有种子棱状的一边从中间剪掉，留有包裹胚，剪后椰枣种子的形状为正方体，得到椰枣种子合子胚。所述剪后两端分别距离发芽孔的距离为0.2cm。所述切割处理方法处理的椰枣种子合子胚进行愈伤组织诱导培养，具有操作方便、愈伤诱导率高、污染率低、畸形苗率低以及占用空间小的特点。优点：(1)在操作台外修剪，操作简单，易学，所需时间短，效率高。(2)修剪后体积小，相对于全种子消毒可以采用少量的消毒液达到较好的消毒效果。(3)有少量胚乳包裹种胚，消毒时可以保护种子合子胚。(4)占用的空间小，可以提高每个培养盒的外植体接种数。(5)出愈伤所需时间短，褐化率低，愈伤诱导率高。
当以椰枣种子直接接种时，在所述培养基环境下，有污染率高，畸形苗，占用空间大的问题。采用剥胚接种，所需操作时间长，愈伤诱导率很低。当采用对晾干后的包裹在种子表面的内果皮和种子表皮刮皮，将晾干后种子的表皮刮干净，用枝剪将种子的两头减掉，剪后两端分别距离发芽孔的距离为0.2cm，去掉两端后的形状优选为圆柱体的处理方法处理椰枣种子时，存在出愈伤所需时间长，褐化严重，出愈伤组织率低的问题。
在本发明中，所述椰枣种子合子胚、椰枣分蘖苗或椰枣幼苗的消毒方法优选包括以下步骤：采用漂白液对所述椰枣种子合子胚消毒3次，第一次消毒时间为5～6min，第二次和第三消毒的时间分别为10～15min，共消毒25～35min，椰枣种子合子胚与漂白液的体积比为1:5，消毒过程中伴随搅拌，消毒后用灭菌纯水清洗3～5次。所述漂白液的浓度优选为2～20％，更优选为5～10％。清洗后，将清洗后的椰枣种子合子胚放在灭菌后的无尘擦纸吸收多余的水分，然后再将包裹种子合子胚的正方体直接接种于愈伤诱导培养基。椰枣种子合子胚的接种量为2～4个外植体/培养瓶。
在本发明中，在所述消毒前，所述椰枣分蘖苗还优选包括预消毒和切割；
所述预消毒和切割的方法包括以下步骤：将1年以上的分蘖苗从椰枣母株切下，在切口喷施体积浓度75％酒精后用灭菌锡箔纸包裹伤口，对分蘖苗整体清洗后用体积浓度75％酒精进行预消毒，预消毒后切取宽3～12cm、长5～15cm的茎尖或嫩叶作为椰枣分蘖苗的外植体。
在所述消毒前，所述椰枣幼苗还优选包括预消毒和切割；所述预消毒和切割的方法包括以下步骤：将2～3年的椰枣幼苗清洗后用体积浓度75％酒精进行预消毒，切取宽为3～12cm、长为5～15cm的茎尖或嫩叶作为椰枣幼苗的外植体。所述椰枣幼苗的外植体的嫩叶或椰枣分蘖苗的外植体的嫩叶的接种量优选为2～4个/培养瓶，更优选为3个/培养瓶。椰枣幼苗的外植体的茎尖或椰枣分蘖苗的外植体的茎尖的接种量优选为1～2个/培养瓶。
在本发明中，所述愈伤组织诱导培养基优选以4.43g/L复合维生素的MS培养基为基础培养基，还包括80～110mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、10～40mg/L麦草畏、70～90mg/L肌醇、3.5～4.5g/L植物凝胶、3～3.5g/L活性炭、42～48mg/L维生素C、42～48mg/L柠檬酸和28～32g/L蔗糖，其中2,4-二氯苯氧乙酸和麦草畏的总浓度为120mg/L；灭菌前的愈伤组织诱导培养基的pH值为5.7；最优选还包括为100mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、30mg/L麦草畏、80mg/L肌醇、4.0g/L植物凝胶、3.2g/L活性炭、45mg/L维生素C、45mg/L柠檬酸和30g/L蔗糖。所述复合维生素的MS培养基来源于PhytoTechnology公司生产的M519。本发明对所述愈伤组织诱导培养基的配制方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的配制方法即可。所述愈伤组织诱导培养基与本领域常规诱导培养基相比具有椰枣外植体诱导愈伤组织能力强的特点，并且能够大大缩短愈伤组织出现时间。所述愈伤组织诱导培养基各项组分作用如下：
(1)MS培养基：提供外植体诱导愈伤所需的大量元素，微量元素，维生素，氨基酸等营养成分。本发明对所述MS培养基的配方没有改进，采用市售PhytoTechnology公司生产的M519即可。
(2)2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和麦草畏(dicamba)：生长素，协同作用用于椰枣细胞启动脱分化，诱导形成愈伤组织。
(3)肌醇：由于MS培养基中提供的肌醇的浓度不够，需要另外添加，作用是参与碳水化合物代谢、磷脂代谢等生理活动，帮助活性物质发挥作用，使培养组织快速生长。
(4)植物凝胶：凝固剂，凝固培养基，是较好的支持物。
(5)活性炭：植物外植体的有害分泌物，防止组织培养物的褐变发生，提高愈伤诱导率。
(6)维生素C和柠檬酸：防止外植体褐化。
(7)蔗糖：提供碳源，促进组织生长，调节培养基中的渗透压。
(8)pH值，在此范围内培养基的凝固性好，适宜于植物细胞的分裂、生长、分化。
在本发明中，所述培养的温度优选为25～28℃，更优选为26℃。湿度优选为58％～65％，更优选为60％～63％。优选每55～65天继代一次，更优选为60天继代一次。愈伤组织诱导培养采用暗培养有利于椰枣外植体在所述培养基上进行脱分化，得到愈伤组织。
得到愈伤组织后，本发明将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养。
在本发明中，所述胚性愈伤组织培养的条件优选如下：25～28℃，更优选为26℃；湿度优选为58％～65％，更优选为60％～63％。优选每55～65天继代一次，更优选为60天继代一次。
在本发明中，所述胚性愈伤组织培养基是以4.43g/L复合维生素的MS培养基为基础培养基，优选包括8～9mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1～2mg/L麦草畏、70～90mg/L肌醇、120～180mg/L酸水解酪蛋白、3.5～4.5g/L植物凝胶、3～4g/L活性炭和28～32g/L蔗糖，其中2,4-二氯苯氧乙酸和麦草畏的总浓度为10mg/L；灭菌前培养基的pH值为5.7；更优选包括8.5mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1.5mg/L麦草畏、80mg/L肌醇、150mg/L酸水解酪蛋白、4g/L植物凝胶、3.5g/L活性炭和30g/L蔗糖。所述胚性愈伤组织培养基中以2,4-二氯苯氧乙酸和麦草畏作为植物激素，配合肌醇、酸水解酪蛋白、植物凝胶、活性炭、蔗糖和MS培养基共同发挥胚性愈伤组织的培养作用。
下面结合实施例对本发明提供的一种椰枣的愈伤组织诱导培养方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种以椰枣种子合子胚为外植体的愈伤组织诱导培养方法，其步骤如下：
1.椰枣种子合子胚的处理
取带有果肉的成熟椰枣果，接种前一天，将果肉剥掉，先用洗洁精将粘在种子上的果肉清洗干净，再用自来水将泡沫清洗干净，晾干。用单面刀片对晾干后的包裹在种子表面的内果皮和种子表皮刮皮，将晾干后种子的表皮刮干净，用枝剪将种子的两头减掉，剪后两端分别距离发芽孔的距离为0.2cm，将含有种子棱状的那一边从中间减掉，留有包裹胚，剪后的形状为正方体。
2.外植体的消毒和切割
将修剪过的样品在超净工作台上进行消毒和清洗处理。对切割后的种子合子胚采用市售漂白液消毒3次，共消毒35min，第一次的灭菌时间5min，后两次消毒的时间分别为15min，种子合子胚与灭菌液的体积比为1:5，灭菌过程中不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫，市售漂白液消毒后用灭菌纯水清洗3次，放在灭菌后的无尘擦纸吸收多余的水分。吸收水分后，包裹种子合子胚的正方体直接接种于愈伤诱导培养基，每个培养瓶中接种3个种子合子胚的正方体。
3.愈伤组织诱导培养
愈伤诱导培养条件为暗培养，培养温度24℃，湿度为68％，每50天继代一次。所述的愈伤组织诱导培养基为以含有维生素的4.43g/LMS培养基为基础培养基，再添加其他物质，所添加物质包括110mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和10mg/L麦草畏(dicamba)，60mg/L肌醇，5g/L植物凝胶，4g/L活性炭(200目)，40mg/L维生素C，50mg/L柠檬酸，25g/L蔗糖。灭菌前培养基pH值为5.8。
4.胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养，培养条件为暗培养，培养温度29℃，湿度为55％，每70天继代一次。所述胚性愈伤组织培养基是4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基再添加其他物质，包括7mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，3mg/L麦草畏，60mg/L肌醇，200mg/L酸水解酪蛋白，3g/L植物凝胶，4.5g/L活性炭(200目)，25g/L蔗糖，灭菌前培养基pH值为5.8。
实施例2
一种以茎尖分生组织为外植体的愈伤组织诱导培养方法，其步骤如下：
1.椰枣分蘖苗
选取长在树龄为3～6年健康的椰枣雌株的1年以上的分蘖苗，将分蘖苗全部用消毒的刀从母株切取下来。椰枣母株切取分蘖苗后进行消毒和防护处理，喷施75％酒精后，用愈伤膏封口。椰枣分蘖苗切口喷施75％酒精后，用灭菌锡箔纸包裹伤口，带回实验室对分蘖苗整体清洗，清洗后用75％酒精进行消毒，消毒后将分蘖苗外层的老叶片剥除，切除包裹在外的叶子，将切割宽为3～12cm，长为5～15cm包含有茎尖放在超净工作台上。
2.椰枣幼苗
选取2～3年的椰枣幼苗，将幼苗带回实验室，流动自来水将椰枣幼苗清洗干净后，清洗后用75％酒精进行消毒。将椰枣幼苗的根用消毒后的刀切取下来，剥除外层的老叶，切除包裹在外的叶子。最后将切割宽为3～12cm，长为5～15cm包含有茎尖放在超净工作台上。
3.茎尖分生组织的消毒和接种
将修剪过的样品在超净工作台上进行消毒和清洗处理。对椰枣幼苗或椰枣分蘖苗分离的茎尖分生组织采用市售漂白液消毒3次，共消毒35min，第一次的消毒时间5min，后两次消毒的时间分别为15min，茎尖分生组织与消毒液的体积比为1:5，消毒过程中不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫，市售漂白液消毒后用灭菌纯水清洗3次，放在灭菌后的无尘擦纸吸收多余的水分。吸收水分后，茎尖分生组织切成长为2.0cm小块后接种于愈伤诱导培养基，每个培养瓶中接种1个茎尖分生组织。
4.愈伤组织诱导培养
愈伤诱导培养条件为暗培养，培养温度24℃，湿度为68％，每50天继代一次。所述的愈伤组织诱导培养基为以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，所添加物质包括110mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和10mg/L麦草畏(dicamba)，60mg/L肌醇，5g/L植物凝胶，4g/L活性炭(200目)，40mg/L维生素C，50mg/L柠檬酸，25g/L蔗糖。灭菌前培养基pH值为5.8。
5.胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养，培养条件为暗培养，培养温度29℃，湿度为55％，每70天继代一次。所述胚性愈伤组织培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，包括7mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，3mg/L麦草畏，60mg/L肌醇，200mg/L酸水解酪蛋白，3g/L植物凝胶，4.5g/L活性炭(200目)，25g/L蔗糖，灭菌前培养基pH值为5.8。
实施例3
一种以嫩叶为外植体的愈伤组织诱导培养方法，其步骤如下：
1.椰枣分蘖苗
选取长在树龄为3～6年健康的椰枣雌株的1年以上的分蘖苗，将分蘖苗全部用消毒的刀从母株切取下来。椰枣母株切取分蘖苗后进行消毒和防护处理，喷施75％酒精后，用愈伤膏封口。椰枣分蘖苗切口喷施75％酒精后，用灭菌锡箔纸包裹伤口，带回实验室对分蘖苗整体清洗，清洗后用75％酒精进行消毒，消毒后将分蘖苗外层的老叶片剥除，切除包裹在外的叶子，将切割宽为3～12cm，长为5～15cm包含有嫩叶放在超净工作台上。
2.椰枣幼苗
选取2～3年的椰枣幼苗，将幼苗带回实验室，流动自来水将椰枣幼苗清洗干净后，清洗后用75％酒精进行消毒。将椰枣幼苗的根用消毒后的刀切取下来，剥除外层的老叶，切除包裹在外的叶子。最后将切割宽为3～12cm，长为5～15cm包含有嫩叶放在超净工作台上。
3.嫩叶的消毒和接种
将修剪过的样品在超净工作台上进行消毒和清洗处理。对椰枣幼苗或椰枣分蘖苗分离的嫩叶采用市售漂白液消毒3次，共消毒35min，第一次的灭菌时间5min，后两次消毒的时间分别为15min，嫩叶与灭菌液的体积比为1:5，灭菌过程中不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫，市售漂白液消毒后用灭菌纯水清洗3次，放在灭菌后的无尘擦纸吸收多余的水分。吸收水分后，嫩叶切成长为2.0cm小块后接种于愈伤诱导培养基，每个培养瓶中接种3个嫩叶。
4.愈伤组织诱导培养
愈伤诱导培养条件为暗培养，培养温度24℃，湿度为68％，每50天继代一次。所述的愈伤组织诱导培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，所添加物质包括110mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和10mg/L麦草畏(dicamba)，60mg/L肌醇，5g/L植物凝胶，4g/L活性炭(200目)，40mg/L维生素C，50mg/L柠檬酸，25g/L蔗糖。灭菌前培养基pH为5.8。
5.胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养，培养条件为暗培养，培养温度29℃，湿度为55％，每70天继代一次。所述胚性愈伤组织培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，包括7mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，3mg/L麦草畏，60mg/L肌醇，200mg/L酸水解酪蛋白，3g/L植物凝胶，4.5g/L活性炭(200目)，25g/L蔗糖，灭菌前培养基pH值为5.8。
实施例4
一种以椰枣种子合子胚为外植体的愈伤组织诱导培养方法，其步骤如下：
1.椰枣种子合子胚的处理
取带有果肉的成熟椰枣果，接种前一天，将果肉剥掉，先用洗洁精将粘在种子上的果肉清洗干净，再用自来水将泡沫清洗干净，晾干。用单面刀片对晾干后的包裹在种子表面的内果皮和种子表皮刮皮，将晾干后种子的表皮刮干净，用枝剪将种子的两头减掉，剪后两端分别距离发芽孔的距离为0.15cm，将含有种子棱状的那一边从中间减掉，留有包裹胚，剪后的形状为正方体。
2.外植体的消毒和切割
将修剪过的样品在超净工作台上进行消毒和清洗处理。对切割后的种子合子胚采用市售漂白液消毒3次，共消毒30min，第一次的灭菌时间6min，后两次消毒的时间分别为12min，种子合子胚与灭菌液的体积比为1:5，灭菌过程中不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫，市售漂白液消毒后用灭菌纯水清洗3次，放在灭菌后的无尘擦纸吸收多余的水分。吸收水分后，包裹种子合子胚的正方体直接接种于愈伤诱导培养基，每个培养瓶中接种2个种子合子胚的正方体。
3.愈伤组织诱导培养
愈伤诱导培养条件为暗培养，培养温度29℃，湿度为55％，每70天继代一次。所述的愈伤组织诱导培养基为以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，所添加物质包括120mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，60mg/L肌醇，5g/L植物凝胶，2.5g/L活性炭(200目)，50mg/L维生素C，40mg/L柠檬酸，35g/L蔗糖。灭菌前培养基pH为5.65。
4.胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养，培养条件为暗培养，培养温度26℃，湿度为65％，每50天继代一次。所述胚性愈伤组织培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，包括10mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，100mg/L肌醇，100mg/L酸水解酪蛋白，5g/L植物凝胶，2.5g/L活性炭(200目)，35g/L蔗糖，灭菌前培养基pH值为5.65。
实施例5
一种以茎尖分生组织为外植体的愈伤组织诱导培养方法，其步骤如下：
1.椰枣分蘖苗
选取长在树龄为3～6年健康的椰枣雌株的1年以上的分蘖苗，将分蘖苗全部用消毒的刀从母株切取下来。椰枣母株切取分蘖苗后进行消毒和防护处理，喷施75％酒精后，用愈伤膏封口。椰枣分蘖苗切口喷施75％酒精后，用灭菌锡箔纸包裹伤口，带回实验室对分蘖苗整体清洗，清洗后用75％酒精进行消毒，消毒后将分蘖苗外层的老叶片剥除，切除包裹在外的叶子，将切割宽为3～12cm，长为5～15cm包含有茎尖组织放在超净工作台上。
2.椰枣幼苗
选取2～3年的椰枣幼苗，将幼苗带回实验室，流动自来水将椰枣幼苗清洗干净后，清洗后用75％酒精进行消毒。将椰枣幼苗的根用消毒后的刀切取下来，剥除外层的老叶，切除包裹在外的叶子。最后将切割宽为3～12cm，长为5～15cm包含有茎尖组织放在超净工作台上。
3.茎尖分生组织的消毒和接种
将修剪过的样品在超净工作台上进行消毒和清洗处理。对椰枣幼苗或椰枣分蘖苗分离的茎尖分生组织采用市售漂白液消毒3次，共消毒30min，第一次的灭菌时间6min，后两次消毒的时间分别为12min，茎尖分生组织与灭菌液的体积比为1:5，灭菌过程中不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫，市售漂白液消毒后用灭菌纯水清洗3次，放在灭菌后的无尘擦纸吸收多余的水分。吸收水分后，茎尖分生组织切成长为2.0cm小块后接种于愈伤诱导培养基，每个培养瓶中接种1个茎尖分生组织。
4.愈伤组织诱导培养
愈伤诱导培养条件为暗培养，培养温度29℃，湿度为55％，每70天继代一次。所述的愈伤组织诱导培养基以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，所添加物质包括120mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，60mg/L肌醇，5g/L植物凝胶，2.5g/L活性炭(200目)，50mg/L维生素C，40mg/L柠檬酸，35g/L蔗糖。灭菌前培养基pH为5.65。
5.胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养，培养条件为暗培养，培养温度26℃，湿度为65％，每50天继代一次。所述胚性愈伤组织培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，包括10mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，100mg/L肌醇，100mg/L酸水解酪蛋白，5g/L植物凝胶，2.5g/L活性炭(200目)，35g/L蔗糖，灭菌前培养基pH值为5.65。
实施例6
一种以嫩叶为外植体的愈伤组织诱导培养方法，其步骤如下：
1.椰枣分蘖苗
选取长在树龄为3～6年健康的椰枣雌株的1年以上的分蘖苗，将分蘖苗全部用消毒的刀从母株切取下来。椰枣母株切取分蘖苗后进行消毒和防护处理，喷施75％酒精后，用愈伤膏封口。椰枣分蘖苗切口喷施75％酒精后，用灭菌锡箔纸包裹伤口，带回实验室对分蘖苗整体清洗，清洗后用75％酒精进行消毒，消毒后将分蘖苗外层的老叶片剥除，切除包裹在外的叶子，将切割宽为3～12cm，长为5～15cm包含有嫩叶放在超净工作台上。
2.椰枣幼苗
选取2～3年的椰枣幼苗，将幼苗带回实验室，流动自来水将椰枣幼苗清洗干净后，清洗后用75％酒精进行消毒。将椰枣幼苗的根用消毒后的刀切取下来，剥除外层的老叶，切除包裹在外的叶子。最后将切割宽为3～12cm，长为5～15cm包含有嫩叶放在超净工作台上。
3.嫩叶的消毒和接种
将修剪过的样品在超净工作台上进行消毒和清洗处理。对椰枣幼苗或椰枣分蘖苗分离的嫩叶采用市售漂白液消毒3次，共消毒30min，第一次的灭菌时间6min，后两次消毒的时间分别为12min，嫩叶与灭菌液的体积比为1:5，灭菌过程中不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫，市售漂白液消毒后用灭菌纯水清洗3次，放在灭菌后的无尘擦纸吸收多余的水分。吸收水分后，嫩叶切成长为2.0cm小块后接种于愈伤诱导培养基，每个培养瓶中接种3个嫩叶。
4.愈伤组织诱导培养
愈伤诱导培养条件为暗培养，培养温度29℃，湿度为55％，每70天继代一次。所述的愈伤组织诱导培养基为4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519，再添加其他物质，所添加物质包括120mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，60mg/L肌醇，5g/L植物凝胶，2.5g/L活性炭(200目)，50mg/L维生素C，40mg/L柠檬酸，35g/L蔗糖。灭菌前培养基pH为5.65。
5.胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养，培养条件为暗培养，培养温度26℃，湿度为65％，每50天继代一次。所述胚性愈伤组织培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，包括10mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，100mg/L肌醇，100mg/L酸水解酪蛋白，5g/L植物凝胶，2.5g/L活性炭(200目)，35g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.65。
实施例7
一种以椰枣种子合子胚为外植体的愈伤组织诱导培养方法，其步骤如下：
1.椰枣种子合子胚的处理
取带有果肉的成熟椰枣果，接种前一天，将果肉剥掉，先用洗洁精将粘在种子上的果肉清洗干净，再用自来水将泡沫清洗干净，晾干。用单面刀片对晾干后的包裹在种子表面的内果皮和种子表皮刮皮，将晾干后种子的表皮刮干净，用枝剪将种子的两头减掉，剪后两端分别距离发芽孔的距离为0.20cm，将含有种子棱状的那一边从中间减掉，留有包裹胚，剪后的形状为正方体。
2.外植体的消毒和切割
将修剪过的样品在超净工作台上进行消毒和清洗处理。对切割后的种子合子胚采用市售漂白液消毒3次，共消毒25min，第一次的灭菌时间5min，后两次消毒的时间分别为10min，种子合子胚与灭菌液的体积比为1:5，灭菌过程中不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫，市售漂白液消毒后用灭菌纯水清洗3次，放在灭菌后的无尘擦纸吸收多余的水分。吸收水分后，包裹种子合子胚的正方体直接接种于愈伤诱导培养基，每个培养瓶中接种4个种子合子胚的正方体。
3.愈伤组织诱导培养
愈伤诱导培养条件为暗培养，培养温度25℃，湿度为60％，每60天继代一次。所述的愈伤组织诱导培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，所添加物质包括100mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，20mg/L麦草畏(dicamba)，80mg/L肌醇，4g/L植物凝胶，3g/L活性炭(200目)，45mg/L维生素C，45mg/L柠檬酸，30g/L蔗糖。灭菌前培养基pH值为5.7。
4.胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养，培养条件为暗培养，培养温度26℃，湿度为60％，每60天继代一次。所述胚性愈伤组织培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，包括8mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，2mg/L麦草畏(dicamba)，80mg/L肌醇，150mg/L酸水解酪蛋白，4g/L植物凝胶，3.5g/L活性炭(200目)，30g/L蔗糖，灭菌前培养基pH值为5.7。
实施例8
一种以茎尖分生组织为外植体的愈伤组织诱导培养方法，其步骤如下：
1.椰枣分蘖苗
选取长在树龄为3～6年健康的椰枣雌株的1年以上的分蘖苗，将分蘖苗全部用消毒的刀从母株切取下来。椰枣母株切取分蘖苗后进行消毒和防护处理，喷施75％酒精后，用愈伤膏封口。椰枣分蘖苗切口喷施75％酒精后，用灭菌锡箔纸包裹伤口，带回实验室对分蘖苗整体清洗，清洗后用75％酒精进行消毒，消毒后将分蘖苗外层的老叶片剥除，切除包裹在外的叶子，将切割宽为3～12cm，长为5～15cm包含有茎尖组织放在超净工作台上。
2.椰枣幼苗
选取2～3年的椰枣幼苗，将幼苗带回实验室，流动自来水将椰枣幼苗清洗干净后，清洗后用75％酒精进行消毒。将椰枣幼苗的根用消毒后的刀切取下来，剥除外层的老叶，切除包裹在外的叶子。最后将切割宽为3～12cm，长为5～15cm包含有茎尖组织放在超净工作台上。
3.茎尖分生组织的消毒和接种
将修剪过的样品在超净工作台上进行消毒和清洗处理。对椰枣幼苗或椰枣分蘖苗分离的茎尖分生组织采用市售漂白液消毒3次，共消毒25min，第一次的灭菌时间5min，后两次消毒的时间分别为10min，茎尖分生组织与灭菌液的体积比为1:5，灭菌过程中不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫，市售漂白液消毒后用灭菌纯水清洗3次，放在灭菌后的无尘擦纸吸收多余的水分。吸收水分后，茎尖分生组织切成长为2.0cm小块后接种于愈伤诱导培养基，每个培养瓶中接种1个茎尖分生组织。
4.愈伤组织诱导培养
愈伤诱导培养条件为暗培养，培养温度25℃，湿度为60％，每60天继代一次。所述的愈伤组织诱导培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，所添加物质包括100mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，20mg/L麦草畏(dicamba)，80mg/L肌醇，4g/L植物凝胶，3g/L活性炭(200目)，45mg/L维生素C，45mg/L柠檬酸，30g/L蔗糖。灭菌前培养基pH为5.7。
5.胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养，培养条件为暗培养，培养温度26℃，湿度为60％，每60天继代一次。所述胚性愈伤组织培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，包括8mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，2mg/L麦草畏(dicamba)，80mg/L肌醇，150mg/L酸水解酪蛋白，4g/L植物凝胶，3.5g/L活性炭(200目)，30g/L蔗糖，灭菌前培养基pH值为5.7。
实施例9
一种以嫩叶为外植体的愈伤组织诱导培养方法，其步骤如下：
1.椰枣分蘖苗
选取长在树龄为3～6年健康的椰枣雌株的1年以上的分蘖苗，将分蘖苗全部用消毒的刀从母株切取下来。椰枣母株切取分蘖苗后进行消毒和防护处理，喷施75％酒精后，用愈伤膏封口。椰枣分蘖苗切口喷施75％酒精后，用灭菌锡箔纸包裹伤口，带回实验室对分蘖苗整体清洗，清洗后用75％酒精进行消毒，消毒后将分蘖苗外层的老叶片剥除，切除包裹在外的叶子，将切割宽为3～12cm，长为5～15cm包含有嫩叶放在超净工作台上。
2.椰枣幼苗
选取2～3年的椰枣幼苗，将幼苗带回实验室，流动自来水将椰枣幼苗清洗干净后，清洗后用75％酒精进行消毒。将椰枣幼苗的根用消毒后的刀切取下来，剥除外层的老叶，切除包裹在外的叶子。最后将切割宽为3～12cm，长为5～15cm包含有嫩叶放在超净工作台上。
3.嫩叶的消毒和接种
将修剪过的样品在超净工作台上进行消毒和清洗处理。对椰枣幼苗或椰枣分蘖苗分离的嫩叶采用市售漂白液消毒3次，共消毒25min，第一次的灭菌时间5min，后两次消毒的时间分别为10min，嫩叶与灭菌液的体积比为1:5，灭菌过程中不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫，市售漂白液消毒后用灭菌纯水清洗3次，放在灭菌后的无尘擦纸吸收多余的水分。吸收水分后，嫩叶切成长为2.0cm小块后接种于愈伤诱导培养基，每个培养瓶中接种3个嫩叶。
4.愈伤组织诱导培养
愈伤诱导培养条件为暗培养，培养温度25℃，湿度为60％，每60天继代一次。所述的愈伤组织诱导培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，所添加物质包括100mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，20mg/L麦草畏(dicamba)，80mg/L肌醇，4g/L植物凝胶，3g/L活性炭(200目)，45mg/L维生素C，45mg/L柠檬酸，30g/L蔗糖。灭菌前培养基pH为5.7。
5.胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养，培养条件为暗培养，培养温度26℃，湿度为60％，每60天继代一次。所述胚性愈伤组织培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，包括8mg/L2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)，2mg/L麦草畏(dicamba)，80mg/L肌醇，150mg/L酸水解酪蛋白，4g/L植物凝胶，3.5g/L活性炭(200目)，30g/L蔗糖，灭菌前培养基pH值为5.7。
对比例1
1.椰枣种子合子胚
取带有果肉的成熟椰枣果，接种前一天，将果肉剥掉，先用洗洁精将粘在种子上的果肉清洗干净，再用自来水将泡沫清洗干净，晾干。用单面刀片对晾干后的包裹在种子表面的内果皮和种子表皮刮皮，将晾干后种子的表皮刮干净，用枝剪将种子的两头减掉，剪后两端分别距离发芽孔的距离为0.2cm，将含有种子棱状的那一边从中间减掉，留有包裹胚，剪后的形状为正方体。
2.外植体的消毒和切割
将修剪过的样品在超净工作台上进行消毒和清洗处理。对切割后的包含有椰枣种子合子胚样品先用流动自来水清洗1h，然后置于150mg/L抗坏血酸和200mg/L柠檬酸组成的抗氧化剂中浸泡，70％酒精1min，0.5g/L HgCl2 5min，1次，灭菌纯水清洗后，放入5.25％NaOCl(100mL添加2滴吐温20)消毒每次消毒15min，共2次，灭菌纯水清洗4次。放在灭菌后的无尘擦纸吸收多余的水分。无菌超净工作台坏境下，将吸干水分的椰枣种子用解剖刀切割，将胚完整的剥出，接种在愈伤诱导培养基上，每盒培养基接种1个外植体。
3.愈伤组织诱导培养
愈伤诱导培养条件为暗培养，培养温度26℃，湿度为60％，每30天继代一次。所述的愈伤组织诱导培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加170mg/L NaH2PO4、125mg/L肌醇、200mg/L谷胺酰胺、1mg/L盐酸硫胺素、1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆醇、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、100mg/L 2,4-D、3mg/L 2ip，3g/L活性炭。灭菌前培养基pH值为5.7。
4.胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养，培养条件为暗培养，培养温度26℃，湿度为60％，每30天继代一次。所述胚性愈伤组织培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，170mg/LNaH2PO4、125mg/L肌醇、200mg/L谷胺酰胺、1mg/L盐酸硫胺素、1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆醇、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、100mg/L 2,4-D、3mg/L 2ip，3g/L活性炭，灭菌前培养基pH值为5.7。
对比例2
1.茎尖分生组织：选取长在树龄为3-4年生健康的椰枣雌株的1年以上的分蘖苗，将分蘖苗全部用消毒的刀从母株切取下来。椰枣母株切取分蘖苗后进行消毒和防护处理，喷施75％酒精后，用愈伤膏封口。椰枣分蘖苗切口喷施75％酒精后，用灭菌锡箔纸包裹伤口，带回实验室对分蘖苗整体清洗，清洗后用75％酒精进行消毒，消毒后将分蘖苗外层的老叶片剥除，切除包裹在外的叶子，将切割宽为3～12cm，长为5～15cm包含有茎尖放在超净工作台上。
2.外植体的消毒和切割
将修剪过的样品在超净工作台上进行消毒和清洗处理。对切割后的包含有茎尖分生组织样品先用流动自来水清洗1h，然后置于150mg/L抗坏血酸和200mg/L柠檬酸组成的抗氧化剂中浸泡，70％酒精1min，0.5g/L HgCl25min，1次，灭菌纯水清洗后，放入5.25％NaOCl(100mL添加2滴吐温20)消毒每次消毒15min，共2次，灭菌纯水清洗4次。放在灭菌后的无尘擦纸吸收多余的水分。无菌超净工作台坏境下，吸收水分后将茎尖切成小块，切割后的茎尖分生组织接种在愈伤诱导培养基上，每盒培养基接种1个外植体。
3.愈伤组织诱导培养
愈伤诱导培养条件为暗培养，培养温度26℃，湿度为60％，每30天继代一次。所述的愈伤组织诱导培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，170mg/L NaH2PO4、125mg/L肌醇、200mg/L谷胺酰胺、1mg/L盐酸硫胺素、1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆醇、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、100mg/L 2,4-D、3mg/L 2ip，3g/L活性炭。灭菌前培养基pH值为5.7。
4.胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养，培养条件为暗培养，培养温度26℃，湿度为60％，每30天继代一次。所述胚性愈伤组织培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519为基础培养基，再添加其他物质，170mg/LNaH2PO4、125mg/L肌醇、200mg/L谷胺酰胺、1mg/L盐酸硫胺素、1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆醇、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、100mg/L 2,4-D、3mg/L 2ip，3g/L活性炭，灭菌前培养基pH值为5.7。
对比例3
1嫩叶：选取长在树龄为3～4年生健康的椰枣雌株的1年以上的分蘖苗，将分蘖苗全部用消毒的刀从母株切取下来。椰枣母株切取分蘖苗后进行消毒和防护处理，喷施75％酒精后，用愈伤膏封口。椰枣分蘖苗切口喷施75％酒精后，用灭菌锡箔纸包裹伤口，带回实验室对分蘖苗整体清洗，清洗后用75％酒精进行消毒，消毒后将分蘖苗外层的老叶片剥除，切除包裹在外的叶子，将切割宽为3～12cm，长为5～15cm包含有嫩叶放在超净工作台上。
2.外植体的消毒和切割
将修剪过的样品在超净工作台上进行消毒和清洗处理。对切割后的包含有嫩叶样品先用流动自来水清洗1h，然后置于150mg/L抗坏血酸和200mg/L柠檬酸组成的抗氧化剂中浸泡，70％酒精1min，0.5g/L HgCl2 5min，1次，灭菌纯水清洗后，放入5.25％NaOCl(100mL添加2滴吐温20)消毒每次消毒15min，共2次，灭菌纯水清洗4次。放在灭菌后的无尘擦纸吸收多余的水分。无菌超净工作台坏境下，吸收水分后将嫩叶切成小块，切割后的嫩叶接种在愈伤诱导培养基上，每盒培养基接种1个外植体。
3.愈伤组织诱导培养
愈伤诱导培养条件为暗培养，培养温度26℃，湿度为60％，每30天继代一次。所述的愈伤组织诱导培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519，再添加其他物质，170mg/L NaH2PO4、125mg/L肌醇、200mg/L谷胺酰胺、1mg/L盐酸硫胺素、1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆醇、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、100mg/L 2,4-D、3mg/L 2ip，3g/L活性炭。灭菌前培养基pH值为5.7。
4.胚性愈伤组织的培养
将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养，培养条件为暗培养，培养温度26℃，湿度为60％，每30天继代一次。所述胚性愈伤组织培养基是以4.43g/L市售PhytoTechnology公司生产的M519，再添加其他物质，170mg/L NaH2PO4、125mg/L肌醇、200mg/L谷胺酰胺、1mg/L盐酸硫胺素、1mg/L烟酸、1mg/L盐酸吡哆醇、30g/L蔗糖、7g/L琼脂、100mg/L 2,4-D、3mg/L 2ip，3g/L活性炭，灭菌前培养基pH值为5.7。
统计实施例1～9及对比例1～3所述培养方法获得的愈伤组织数量，得到污染率、开始出现愈伤组织时间和愈伤诱导率。结果见表1。
表1实施例1～9及对比例1～3所述培养方法污染率与愈伤诱导率
Figure BDA0002295337940000221
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种椰枣的愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将消毒后的椰枣外植体接种至愈伤组织诱导培养基上进行愈伤组织诱导培养；
所述愈伤组织诱导培养的条件为暗培养，培养温度24～29℃，湿度为55％～68％，每50～70天继代一次；
所述愈伤组织诱导培养基由4.43g/L复合维生素的MS培养基、80～110mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、10～40mg/L麦草畏、60～100mg/L肌醇、3～5g/L植物凝胶、2.5～4g/L活性炭、40～50mg/L维生素C、40～50mg/L柠檬酸和25～35g/L蔗糖组成，其中2,4-二氯苯氧乙酸和麦草畏的总浓度为120mg/L；灭菌前的愈伤组织诱导培养基的pH值为5.65～5.8；
2)将得到的愈伤组织转接到胚性愈伤组织培养基中进行胚性愈伤组织培养；所述胚性愈伤组织培养的条件为暗培养，培养温度24～29℃，湿度为55％～68％，每50～70天继代一次；
所述胚性愈伤组织培养基是由4.43g/L复合维生素的MS培养基、8～9mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸、1～2mg/L麦草畏、60～100mg/L肌醇、100～200mg/L酸水解酪蛋白、3～5g/L植物凝胶、2.5～4.5g/L活性炭和25～35g/L蔗糖组成，其中2,4-二氯苯氧乙酸和麦草畏的总浓度为10mg/L；灭菌前培养基pH值为5.65～5.8；
所述椰枣外植体包括椰枣种子合子胚、椰枣分蘖苗或椰枣幼苗的茎尖分生组织和嫩叶。
2.根据权利要求1所述的愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，所述椰枣种子合子胚在消毒前进行切割处理，所述切割的方法包括以下步骤：成熟椰枣果去除果肉，清洗，晾干，去除包裹在种子表面的内果皮和种子表皮，得到的椰枣种子剪掉两端，剪后两端分别距离发芽孔的距离为0.15～0.25cm，将含有种子棱状的一边从中间剪掉，留有包裹胚，剪后椰枣种子的形状为正方体，得到椰枣种子合子胚。
3.根据权利要求1所述的愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，所述椰枣种子合子胚、椰枣分蘖苗或椰枣幼苗的消毒方法包括以下步骤：
采用漂白液对所述椰枣种子合子胚消毒3次，第一次消毒时间为5～6min，第二次和第三消毒的时间分别为10～15min，共消毒25～35min，椰枣种子合子胚与漂白液的体积比为1:5，消毒过程中伴随搅拌，消毒后用灭菌纯水清洗3～5次。
4.根据权利要求2所述的愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，在所述消毒前，所述椰枣分蘖苗还包括预消毒和切割；
所述预消毒和切割的方法包括以下步骤：
将1年以上的分蘖苗从椰枣母株切下，在切口喷施体积浓度75％酒精后用灭菌锡箔纸包裹伤口，对分蘖苗整体清洗后用体积浓度75％酒精进行预消毒，预消毒后切取宽3～12cm、长5～15cm的茎尖或嫩叶作为椰枣分蘖苗的外植体。
5.根据权利要求2所述的愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，在所述消毒前，所述椰枣幼苗还包括预消毒和切割；
所述预消毒和切割的方法包括以下步骤：
将2～3年的椰枣幼苗清洗后用体积浓度75％酒精进行预消毒，切取宽为3～12cm、长为5～15cm的茎尖或嫩叶作为椰枣幼苗的外植体。
6.根据权利要求1～5任意一项所述的愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，所述椰枣种子合子胚、椰枣幼苗的外植体的嫩叶或椰枣分蘖苗的外植体的嫩叶的接种量为2～4个/培养瓶。
7.根据权利要求1～5任意一项所述的愈伤组织诱导培养方法，其特征在于，椰枣幼苗的外植体的茎尖或椰枣分蘖苗的外植体的茎尖的接种量为1～2个/培养瓶。
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