CN109169293A - 一种椰枣无菌苗的培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种椰枣无菌苗的培养方法，属于无菌苗培养技术领域，所述椰枣无菌苗的培养方法，包括以下步骤：1)去掉椰枣种子的内果皮和表皮，得到去皮椰枣种子；2)将所述步骤1)得到的去皮椰枣种子的两端去掉，留下包裹胚，得到去两端的椰枣种子；所述去两端的椰枣种子的端面与发芽孔的距离为0.2～0.5cm；3)将所述步骤2)得到的去两端的椰枣种子用灭菌液进行灭菌，再经水洗涤，得到洗涤的椰枣种子；所述去两端的椰枣种子与灭菌液的体积比为1:(3～8)；4)将所述步骤3)得到的洗涤的椰枣种子置培养基上进行暗培养，得到椰枣无菌苗。利用本发明提供的方法进行椰枣无菌苗培养，发芽快、发芽率高。

Description

一种椰枣无菌苗的培养方法

技术领域

本发明属于无菌苗培养技术领域，具体涉及一种椰枣无菌苗的培养方法。

背景技术

椰枣树(Phoenix dactylifera)属于棕榈科刺葵属，果实为椰枣(英文名称：Datepalm)，又名波斯枣、番枣、伊拉克枣，《本草纲目》称无漏子。椰枣具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗菌、消炎、抗癌和提高免疫等机能，具有保肝健胃的作用。椰枣树是阿拉伯国家的重要本木粮食作物，被誉为“阿拉伯民族之树”，在中东阿拉伯国家的生态和经济建设中发挥着重要作用。

进行椰枣无菌苗培养，一方面可以为后续进行组织培养提供较好的无菌材料，另一方面可以为研究椰枣盐胁迫和根系分泌物等其它研究提供实验材料。但是不同的植物的其适合的无菌苗的培养方法也会不同。椰枣虽为是棕榈科植物，但是其种子小，胚小，采用种子直接培养无菌苗，其发芽率低；采用剥胚培养，不仅繁琐，所需时间长，还存在剥胚的过程中，破坏胚的风险。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种椰枣无菌苗的培养方法，本发明提供的方法效率高、方便操作、缩短接种操作时间、发芽率高、发芽快。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种椰枣无菌苗的培养方法，包括以下步骤：

1)去掉椰枣种子的内果皮和表皮，得到去皮椰枣种子；

2)将所述步骤1)得到的去皮椰枣种子的两端去掉，留下包裹胚，得到去两端的椰枣种子；

所述去两端的椰枣种子的端面与发芽孔的距离为0.2～0.5cm；

3)将所述步骤2)得到的去两端的椰枣种子用灭菌液进行灭菌，再经水洗涤，得到洗涤的椰枣种子；

所述去两端的椰枣种子与灭菌液的体积比为1:(3～8)；

4)将所述步骤3)得到的洗涤的椰枣种子置培养基上进行暗培养，得到椰枣无菌苗。

优选地，所述步骤3)去两端的椰枣种子与灭菌液的体积比为1:7。

优选地，所述步骤3)灭菌液的灭菌次数为2～4次。

优选地，所述步骤3)灭菌液包括NaClO溶液、乙醇溶液或氯化汞溶液。

优选地，所述步骤3)灭菌的时间为4～15min。

优选地，所述步骤3)用水洗涤的次数为2～5次。

优选地，所述步骤4)培养基以水为溶剂，每升包括：4～5g MS培养基、25～35g蔗糖、2.5～3.5g活性炭和3～4g植物凝胶。

优选地，所述步骤4)暗培养的温度为25～27℃，所述暗培养的环境湿度为65～70％。

本发明去掉椰枣种子的内果皮和表皮，缓解了种子发芽的障碍；对种子两头进行剪切，露出胚乳，有助于种子更快的吸收水分，加快种子的发芽；胚周边的胚乳多，自身供给养分多，发芽快，在全黑暗培养下，培养物鲜重大；避免了剥胚过程中对胚的损坏，有助于发芽。

本发明实施例的结果显示：本发明提供的椰枣无菌苗的培养方法，效率高、方便操作、缩短接种操作时间，提高了椰枣的发芽速度、发芽率。

附图说明

图1为本发明对照例和实施例的不同的接种方式；

图2为本发明对照例和实施例的不同的接种方式幼苗培养收获后的结果图。

具体实施方式

本发明提供了一种椰枣无菌苗的培养方法，包括以下步骤：

1)去掉椰枣种子的内果皮和表皮，得到去皮椰枣种子；

2)将所述步骤1)得到的去皮椰枣种子的两端去掉，留下包裹胚，得到去两端的椰枣种子；

所述去两端的椰枣种子的端面与发芽孔的距离为0.2～0.5cm；

3)将所述步骤2)得到的去两端的椰枣种子用灭菌液进行灭菌，再经水洗涤，得到洗涤的椰枣种子；

所述去两端的椰枣种子与灭菌液的体积比为1:(3～8)；

4)将所述步骤3)得到的洗涤的椰枣种子置培养基上进行暗培养，得到椰枣无菌苗。

本发明去掉椰枣种子的内果皮和表皮，得到去皮椰枣种子。

本发明对椰枣种子的来源没有特殊限定，采用常规市售产品即可。

在本发明中，所述椰枣的种子优选带有果肉的椰枣果，更优选接种前一天，剥掉果肉，用洗洁精清洗干净，再用水清洗干净，晾干的椰枣种子。

本发明将得到的去皮的椰枣种子的两端去掉，留下包裹胚，得到去两端的椰枣种子；所述去两端的椰枣种子的端面与发芽孔的距离为0.2～0.5cm。

在本发明中，所述椰枣种子去掉两端后的形状优选为圆柱体。

本发明对去两端的椰枣种子用灭菌液进行灭菌，再经水洗涤，得到洗涤的椰枣种子。

在本发明中，所述灭菌液的种类及来源没有特殊限定，采用常规市售的种子灭菌液产品即可。

在本发明中，所述灭菌液优选为NaClO溶液、乙醇溶液或氯化汞溶液。

在本发明中，所述灭菌的次数优选2～4次，更优选3次。

在本发明中，所述灭菌的时间优选4～15min，更优选5～10min。

在本发明中，所述灭菌的过程优选不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫；本发明对搅拌速度没有特殊限定，优选为140r/min。

在本发明中，所述洗涤所用的水没有特殊限定，优选为无菌蒸馏水清洗。

在本发明中，所述用水洗涤的次数优选2～5次，更优选3次。

在本发明中，所述去两端的椰枣种子与灭菌液的体积比为1:(3～8)，优选为1:7。

本发明得到的洗涤的椰枣种子置培养基上进行暗培养，得到椰枣无菌苗。

在本发明中，所述椰枣种子置培养基上进行暗培养，优选将带有棱条的一面朝下接触培养基培养。

本发明对所述培养基没有特殊限定，采用常规培养椰枣种子培养基即可。

在本发明中，所述培养基优选以水为溶剂，每升优选包括：4～5g MS培养基、25～35g蔗糖、2.5～3.5g活性炭和3～4g植物凝胶；更优选每升包括：4.43g MS培养基、30g蔗糖、3g活性炭和3.5g植物凝胶。

在本发明中，所述暗培养条件的温度优选25～27℃，更优选26℃；所述暗培养环境的湿度优选65～70％，更优选68％。

下面将结合本发明中的实施例，对本发明提供的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

1.取带有果肉的椰枣果，接种前一天，将果肉剥掉，先用洗洁精将粘在种子上的果肉清洗干净，再用自来水将泡沫清洗干净，晾干。

2.用单面刀片对晾干后的包裹在种子表面的内果皮和种子表皮刮皮，将晾干后种子的表皮刮干净，用枝剪将种子的两头减掉，剪后两端分别距离发芽孔的距离为0.3cm，留有包裹胚，剪后的椰枣种子的形状为圆柱体。

3.将上述修剪后的种子进行灭菌，共灭菌3次，2.5％NaClO依次灭菌5分钟、10分钟和10分钟，修剪后体积为0.45mL，种子与灭菌液的体积比为1:7，灭菌过程中不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫。

4.无菌蒸馏水清洗3次，放在已经灭菌后的卫生纸上，吸干水分。

5.将吸干表明水分的样品接种在培养基上，带有棱条的一面朝下接触培养基。培养基配方为4.43g/LMS培养基、30g/L蔗糖、3g/L活性炭、3.5g/L植物凝胶，培养基体积为35mL。

6.在25℃、65％RH的环境中培养，全黑暗培养。

对照例1

1.取带有果肉的椰枣果，接种前一天，将果肉剥掉，先用洗洁精将粘在种子上的果肉清洗干净，再用自来水将泡沫清洗干净，晾干。

2.将晾干后的种子进行灭菌，共灭菌3次，2.5％NaClO依次灭菌5分钟、10分钟和10分钟，种子的体积为1mL，种子与灭菌液的体积比为1:7，灭菌过程中不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫。

4.无菌蒸馏水清洗3次，放在已经灭菌后的卫生纸上，吸干水分。

5.将吸干表明水分的种子接种在培养基上，带有棱条的一面朝下，接触培养基。培养基配方为4.43g/LMS培养基、30g/L蔗糖、3g/L活性炭、3.5g/L植物凝胶，培养基体积为35mL。

6.在25℃、65％RH的环境中培养，全黑暗培养。

对照例2

1.取带有果肉的椰枣果，接种前一天，将果肉剥掉，先用洗洁精将粘在种子上的果肉清洗干净，再用自来水将泡沫清洗干净，晾干。

2.用单面刀片对晾干后的包裹在种子表面的内果皮和种子表皮刮皮，将晾干后种子的表皮刮干净。

3.将刮皮后的种子进行灭菌，共灭菌3次，2.5％NaClO依次灭菌5分钟、10分钟和10分钟，种子的体积为1mL，种子与灭菌液的体积比为1:7，灭菌过程中不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫。

4.无菌蒸馏水清洗3次，放在已经灭菌后的卫生纸上，吸干水分。

5.将吸干表明水分的种子接种在培养基上，带有棱条的一面朝下，接触培养基。培养基配方为4.43g/L MS培养基、30g/L蔗糖、3g/L活性炭、3.5g/L植物凝胶，培养基体积为35mL。

6.在25℃、65％RH的环境中培养，全黑暗培养。

对照例3

1.取带有果肉的椰枣果，接种前一天，将果肉剥掉，先用洗洁精将粘在种子上的果肉清洗干净，再用自来水将泡沫清洗干净，晾干。

2.用单面刀片对晾干后的包裹在种子表面的内果皮和种子表皮刮皮，将晾干后种子的表皮刮干净，用枝剪将种子的两头减掉，剪后两端分别距离发芽孔的距离为0.3cm，将含有种子棱状的那一边从中间减掉，留有包裹胚，剪后的椰枣种子的形状为正方体。

3.将上述修剪过的种子进行灭菌，共灭菌3次，2.5％NaClO依次灭菌5分钟、10分钟和10分钟，修剪后的体积为0.3mL，种子与灭菌液的体积比为1:7，灭菌过程中不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫。

4.无菌蒸馏水清洗3次，放在已经灭菌后的卫生纸上，吸干水分。

5.将修剪后的种子平放，切口处接触培养基。培养基配方为4.43g/L MS培养基，30g/L蔗糖、3g/L活性炭、3.5g/L植物凝胶，培养基体积为35mL。

6.在25℃、65％RH的环境中培养，全黑暗培养。

对照例4

1.取带有果肉的椰枣果，接种前一天，将果肉剥掉，先用洗洁精将粘在种子上的果肉清洗干净，再用自来水将泡沫清洗干净，晾干。

2.用单面刀片对晾干后的包裹在种子表面的内果皮和种子表皮刮皮，将晾干后种子的表皮刮干净，用枝剪将种子的两头减掉，剪后两端分别距离发芽孔的距离为0.3cm，将含有种子棱状的那一边从中间减掉，留有包裹胚，剪后的形状为正方体。

3.将上述修剪后的种子进行灭菌，共灭菌3次，2.5％NaClO依次灭菌5分钟、10分钟和10分钟，剪后的体积为0.3mL，种子与灭菌液的体积比为1:7，灭菌过程中不停的搅拌，使其产生丰富的泡沫。

4.无菌蒸馏水清洗3次，放在已经灭菌后的卫生纸上，吸干水分。

5.无菌超净工作台坏境下，将吸干水分的上述种子用解剖刀切割，将胚完整的剥出，接种。培养基配方为4.43g/LMS培养基、30g/L蔗糖、3g/L活性炭、3.5g/L植物凝胶，培养基体积为35mL。

6.在25℃、65％RH的环境中培养，全黑暗培养。

对实施例1和对照例1～4测定发芽率、单植株生物量、单株株型、蛋白浓度和可溶性糖含量，结果分别见表1-4。

表1对照例和实施例接种后5d至14d的发芽率

表2对照例和实施例接种收获后单株生物量

表3对照例和实施例接种收获后单株株型

表4对照例和实施例接种收获后样品的蛋白浓度和可溶性糖含量

由以上表1的实验结果可知，本发明的发芽率快，在第5d时开始发芽，实施例相对于对照1提早4d，相对于对照2提早2d，相对于对照3提早1d，在播种后10d的时候，本发明的发芽率达到100％，是对照例1的2.5倍，是对照例2的1.89倍。

由以上表2～4的实验结果可知，本发明提供的方法能够加快椰枣的发芽速度，提高椰枣的发芽率，根鲜重、地上部鲜重、根干重、地上部干重、根长、地上部长、可溶糖含量性能参数。

由以上实施例可以看出，本发明提供的椰枣无菌苗的培养方法发芽快、发芽率高。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种椰枣无菌苗的培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)去掉椰枣种子的内果皮和表皮，得到去皮椰枣种子；

2)将所述步骤1)得到的去皮椰枣种子的两端去掉，留下包裹胚，得到去两端的椰枣种子；

所述去两端的椰枣种子的端面与发芽孔的距离为0.2～0.5cm；

3)将所述步骤2)得到的去两端的椰枣种子用灭菌液进行灭菌，再经水洗涤，得到洗涤的椰枣种子；

所述去两端的椰枣种子与灭菌液的体积比为1:(3～8)；

4)将所述步骤3)得到的洗涤的椰枣种子置培养基上进行暗培养，得到椰枣无菌苗。

2.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤3)去两端的椰枣种子与灭菌液的体积比为1:7。

3.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤3)灭菌液的灭菌次数为2～4次。

4.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤3)灭菌液包括NaClO溶液、乙醇溶液或氯化汞溶液。

5.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤3)灭菌的时间为4～15min。

6.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤3)用水洗涤的次数为2～5次。

7.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤4)培养基以水为溶剂，每升包括：4～5g MS培养基、25～35g蔗糖、2.5～3.5g活性炭和3～4g植物凝胶。

8.根据权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述步骤4)暗培养的温度为25～27℃，所述暗培养的环境湿度为65～70％。