CN113170728B - 一种诱导大蒜多倍体或突变体的方法 - Google Patents

一种诱导大蒜多倍体或突变体的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种诱导大蒜多倍体或突变体的方法，包括如下步骤：首先，沿着大蒜鳞茎腹部的一侧切除大蒜鳞茎至根部以上3‑8mm处，然后剔除鳞茎内侧的鳞芽，直至露出根基底部的生长点；然后将蒜瓣用诱变剂进行诱导；再将诱导后的蒜瓣直接种植在大田里，即得到大蒜多倍体或突变体；或将诱导后的蒜瓣制备成无菌苗，利用无菌苗生长点长出来的叶片和根部制取多倍体愈伤组织，即得到大蒜多倍体。本发明的方法，鳞茎切口带有鳞茎组织，自身带营养组织，在诱导突变体时可直接种在地里，存活率高；还可以将秋水仙素浸泡过的大蒜鳞茎切口制备无菌苗，利用无菌苗生长点长出来的叶片和根部可制取多倍体愈伤组织，不需要种在大田即可得到大蒜多倍体。

Description

一种诱导大蒜多倍体或突变体的方法
技术领域
本发明属于大蒜诱导技术领域，尤其涉及一种诱导大蒜多倍体或突变体的方法。
背景技术
多倍体育种(polyploid breeding)是指利用人工诱变或自然变异等，通过细胞染色体组加倍获得多倍体育种材料，用以选育符合人们需要的优良品种。自从1937年开创倍性育种先河以来，全球掀起了多倍体育种热潮。多倍体育种是近代作物育种常用方法之一，对改良无性繁殖作物的营养器官具有明显的优越性。
近年来，大蒜的多倍体育种技术取得了很大的进展。目前大蒜的多倍体育种研究，已经实现了采用大蒜茎尖、根尖、花苞等为材料经秋水仙素处理后获得染色体加倍的效果，部分研究获得了染色体加倍的再生植株。但由于剥取后的茎尖用秋水仙素处理后易坏死，污染率高，存活率极低，是限制茎尖诱导多倍体的瓶颈；而其他传统的大蒜多倍体诱导方法通常采用处理愈伤组织、注射生长点等技术，但只能无菌操作，且成活率不高，在实验室处理后还需移栽到大田处理，难以保证较高的成活率。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一种存活率高的诱导大蒜多倍体或突变体的方法。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为：
一种诱导大蒜多倍体或突变体的方法，包括如下步骤：
(1)准备蒜瓣，用小刀沿着大蒜鳞茎腹部的一侧切除大蒜鳞茎至根部以上3-8mm处，然后剔除鳞茎内侧的鳞芽，直至露出根基底部的生长点；
(2)将所述步骤(1)处理后得到的蒜瓣用诱变剂进行诱导；
(3)将所述步骤(2)处理后得到的蒜瓣直接种植在大田里，即得到大蒜多倍体或突变体；或将所述步骤(2)处理后得到的蒜瓣制备成无菌苗，利用无菌苗生长点长出来的叶片和根部制取多倍体愈伤组织，即得到大蒜多倍体。
本发明的大蒜鳞茎切口带有鳞茎组织，自身带营养组织，可直接种在地里，在保证肥量和湿度的条件下，大蒜的存活率较高；本发明从传统诱导愈伤组织到自创的鳞茎切口，可直接诱导大蒜生长点，省去诱导愈伤组织的过程。
传统诱变需要在无菌环境下操作，条件较为严格，愈伤组织的诱变处理至少需要4个月-6个月的时间才能长出新的鳞茎，且培养时间较长易染菌，还要种植在大田实验。而本发明的方法不用严格的无菌操作过程，省去无菌培养的繁琐过程，省钱省力，降低大量成本。在诱导突变体时，秋水仙素处理后的蒜瓣可以直接种植在大田里，节省了大量时间。在诱导多倍体时，只需要3-4周就可获得叶片检测是否多倍体，不需要种在大田也可得到大蒜多倍体；且秋水仙素处理后的无菌苗还可以用于无菌操作实验，制取秋水仙素愈伤组织。
上述的方法，优选的，所述步骤(1)中，切除大蒜鳞茎时从大蒜鳞茎腹部的左侧和右侧分别切开，切勿切伤根部。
优选的，所述步骤(2)中，诱变剂为秋水仙素，诱导时用秋水仙素浸泡覆盖大蒜鳞茎的切口。
优选的，所述秋水仙素的质量浓度为0.05-0.1％，诱导时间为4-6h；更优选的，所述秋水仙素的质量浓度为0.05％，诱导时间为4h。在合适的浓度时间处理下，种植在大田中可以保证70％-90％的成活率)。
优选的，所述步骤(3)中，将蒜瓣直接种植在大田里的具体操作包括如下步骤：将所述步骤(2)处理后得到的蒜瓣背面朝向地面，生长点处朝上，根部插进土里0.8-1.2cm进行种植，即得到大蒜多倍体或突变体。
优选的，在种植蒜瓣之前，先用灭菌药浇灌条播带，浇灌量为2-4kg/m2；在种植蒜瓣之后，用灭菌药对蒜瓣进行喷洒，喷洒量为80-160kg/亩；每次喷洒灭菌药后盖遮阳网，保证条播带湿润；每隔3-5天，根据条播带湿润情况和发霉情况，喷洒一次灭菌药，喷洒量为30-60kg/亩；在种植蒜瓣之后，待大蒜苗高至4-5cm时，于下午掀开遮阳网，并覆土盖住蒜瓣。
优选的，所述灭菌药为甲基托布津或百菌清稀释500-800倍后得到的溶液。
优选的，所述步骤(3)中，将蒜瓣制备成无菌苗，利用无菌苗生长点长出来的叶片和根部制取多倍体愈伤组织的具体操作包括如下步骤：将所述步骤(2)处理后得到的蒜瓣接种于MS培养基中，然后将无菌苗生长点长出来的叶片和根部分别接种于叶片诱导培养基和根部愈伤培养基中，得到的愈伤组织转移到分化培养基诱导不定芽，得到的大蒜苗转移到MS培养基中进行生根诱导培养，待鳞茎成熟后转移到消毒土的盆栽中进行培养，经过倍性测定后，即得到诱导大蒜多倍体。
更优选的，所述叶片诱导培养基为：MS培养基，终浓度为1mg/L的2,4-D，终浓度为0.1mg/L的IAA，终浓度为1mg/L的Kinetin；
所述根部愈伤培养基为：MS培养基，终浓度为1mg/L的2,4-D，终浓度为0.1mg/L的IAA；
所述分化培养基为：MS培养基，终浓度为5mg/L的Kinetin，终浓度为1mg/L的NAA。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
1、本发明的方法，鳞茎切口带有鳞茎组织，自身带营养组织，在诱导突变体时可直接种在地里，存活率高；还可以将秋水仙素浸泡过的大蒜鳞茎切口制备无菌苗，利用无菌苗生长点长出来的叶片和根部可制取多倍体愈伤组织，不需要种在大田即可得到大蒜多倍体；对培育出植株高大或者产生新型性状的大蒜新品种具有重要的现实意义。
2、本发明的方法，无需将生长点剥出，可直接诱导，只需要3-4周就可获得叶片检测是否多倍体，操作简单，无需无菌操作，节省了大量时间。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是大蒜正常蒜瓣；
图2是切除腹部后的蒜瓣；
图3是切除茎芽露出大蒜生长点后的蒜瓣；
图4是普通大蒜叶片流式细胞仪检测图；
图5是多倍体大蒜叶片流式细胞仪检测图一；
图6是多倍体大蒜叶片流式细胞仪检测图二。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
一种诱导大蒜多倍体或突变体的方法，包括如下步骤：
1、生长点暴露的切割技术
1.1、准备实验材料：无菌手套、实验室小刀、普通镊子若干把(钝头尖头均可)、处于休眠期的大蒜鳞茎(见图1)、卫生纸一卷、灭菌水、烧杯。
1.2、外植体处理：取饱满新鲜白净的大蒜瓣，剥去外皮后流水冲洗10-20min，用无菌水清洗蒜瓣3-5次，置无菌操作台中用体积浓度为75％的乙醇中浸泡10-30s，无菌水清洗两遍后，于体积浓度为0.2％的氯化汞溶液中消毒8-10min，无菌水清洗5-8次。用实验室小刀切开大蒜生长点时候应该减少大蒜鳞茎的损失，方法如下：带好手套，手持小刀沿着大蒜鳞茎腹部的一侧切至根部以上3-8mm处，随后同样手法切开另一侧，切勿切伤根部，此时可直接用手拿掉切除的鳞茎(见图2)；用镊子轻轻扒开鳞茎内侧的鳞芽，剔除，直到露出根基底部的生长点(见图3)。
已发芽大蒜的如何切割生长点：已经发芽的大蒜使用此技术也可以进行诱变处理，方法同上，除剔除鳞芽时候需要多切割一些。
注意：不要一刀切开鳞茎内部，对鳞茎组织损失较大，应该从左侧右侧分别切开。切除过程中镊子应保持干净，用无菌水清洗浸泡。
2、用诱变剂进行诱导
2.1、配置无菌秋水仙素：配制质量浓度为0.02％-0.5％的秋水仙素溶液，于无菌操作台中用0.22um微孔滤膜过滤除菌黑暗环境密封保存。
2.2、诱变剂的处理浓度、时间及效果：将步骤1.2处理得到的鳞茎切口用无菌秋水仙素诱变剂进行浸泡诱导，诱变剂的质量浓度为0.02％-0.5％，诱导时间为4-6h。
经过大量的实验室前期工作，种植了大约10000颗鳞茎切口于大田中，筛选出最适宜大蒜生长以及诱导效果较佳的秋水仙素浓度和诱导时间。如表1所示是采用浓度为0.02％-0.5％的秋水仙素诱导处理4-6h的实验结果。
表1：采用浓度为0.05％-0.1％的秋水仙素诱导处理4-6h的实验结果
Figure BDA0003063021600000041
Figure BDA0003063021600000051
成活率＝成活株数÷种植株树×100％；
株型变异率＝变异株树÷成活株树×100％；
可见，本发明中秋水仙素的适宜质量浓度为0.05％-0.1％，适宜诱导时间为4-6h；其中，取0.05％浓度处理4h大蒜鳞茎切口种植到大田中成活率达到60％，为最佳浓度和诱导时间参数。
3、大田种植相关技术
切除了部分鳞茎，露出生长点的大蒜种植在地里容易感染，采取以下相关措施可达到一定的防治效果：
3.1、大田处理：播种前条播带杀菌处理。用稀释500-800倍甲基托布津或百菌清溶液浇水播种条播带，浇水量为2-4kg/m2。
3.2、鳞茎蒜瓣的种植：保持各个蒜瓣的背面朝向地面，生长点处朝上，根部稍微插进土里1cm即可，利于诱导处发芽，这样发芽后叶片生长方向也基本一致。
3.3、播种后处理：鳞茎蒜瓣喷洒灭菌药，稀释500-800倍甲基托布津或百菌清溶液，打药量为80-160kg/亩。打药后盖遮阳网，保证条播带湿润，避免太阳暴晒引起的不必要死亡。每隔3-5天，根据条播带湿润情况和发霉情况，喷洒一次灭菌药，30-60kg/亩。大蒜苗高4-5cm时候，下午掀开遮阳网，并覆土盖住蒜瓣。
3.4、筛选多倍体或突变体：根据所需要的性状，在种植得到的蒜苗中筛选多倍体或突变体。
4、制备多倍体无菌苗
4.1、接种：将步骤2.2经过诱导处理的鳞茎切口随机接种于MS培养基中，接种时，按照大蒜原本生长方向放置，即根部与培养基接触生长，便于大蒜生根发芽。
4.2愈伤组织诱导：将步骤4.1中处理的大蒜鳞茎切口无菌苗长出来的根从根尖往上切2-3cm，接种于愈伤组织诱导培养基中，根部愈伤培养基为：MS+2,4-D(1mg/L)+IAA(0.1mg/L)；将步骤4.1中处理的大蒜鳞茎切口无菌苗长出来的嫩叶切1-2cm，用小刀划几刀后接种于愈伤组织诱导培养基中，叶片诱导培养基为：MS+2,4-D(1mg/L)+IAA(0.1mg/L)+Kinetin(1mg/L)。
4.3诱导不定芽：将步骤4.2中诱导的愈伤组织转移到分化培养基诱导不定芽，分化培养基为：MS+Kinetin(5mg/L)+NAA(1mg/L)。
4.4培养瓶鳞茎诱导：将步骤4.3中诱导的长约5-8cm的大蒜苗转移到生根诱导培养基，生根诱导培养基为MS培养基，鳞茎成熟后，从培养瓶取出，转移到消毒土的盆栽中进行培养。
4.5倍性测定：取步骤4.4中的诱导苗根部和叶片分别采用流式细胞仪检测幼叶和根尖压片染色体计数相结合的方法进行染色体倍性鉴定。
图4代表的是普通二倍体大蒜叶片流式细胞仪检测结果，可以清晰的看见出现了一个峰，且横坐标峰值处于102左右；图5和图6代表的是利用本发明方法处理的2个鳞茎切口诱导的多倍体大蒜叶片流式细胞仪检测结果，流式细胞仪的结果图看出其与普通大蒜不同，存在两个峰值，且横坐标峰值处于102和104，它们之间存在着两倍的关系，说明该植株是多倍体。

Claims (10)

1.一种诱导大蒜多倍体或突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)准备蒜瓣，用小刀沿着大蒜鳞茎腹部的一侧切除大蒜鳞茎至根部以上3-8mm处，然后剔除鳞茎内侧的鳞芽，直至露出根基底部的生长点；
(2)将所述步骤(1)处理后得到的蒜瓣用诱变剂进行诱导；
(3)将所述步骤(2)处理后得到的蒜瓣直接种植在大田里，即得到大蒜多倍体或突变体；或将所述步骤(2)处理后得到的蒜瓣制备成无菌苗，利用无菌苗生长点长出来的叶片和根部制取多倍体愈伤组织，即得到大蒜多倍体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，切除大蒜鳞茎时从大蒜鳞茎腹部的左侧和右侧分别切开，切勿切伤根部。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，诱变剂为秋水仙素，诱导时用秋水仙素浸泡覆盖大蒜鳞茎的切口。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述秋水仙素的质量浓度为0.05％-0.1％，诱导时间为4-6h。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述秋水仙素的质量浓度为0.05％，诱导时间为4h。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将蒜瓣直接种植在大田里的具体操作包括如下步骤：将所述步骤(2)处理后得到的蒜瓣背面朝向地面，生长点处朝上，根部插进土里0.8-1.2cm进行种植，即得到大蒜多倍体或突变体。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，在种植蒜瓣之前，先用灭菌药浇灌条播带，浇灌量为2-4kg/m2；在种植蒜瓣之后，用灭菌药对蒜瓣进行喷洒，喷洒量为80-160kg/亩；每次喷洒灭菌药后盖遮阳网，保证条播带湿润，每隔3-5天，根据条播带湿润情况和发霉情况，喷洒一次灭菌药，喷洒量为30-60kg/亩；在种植蒜瓣之后，待大蒜苗高至4-5cm时，于下午掀开遮阳网，并覆土盖住蒜瓣。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述灭菌药为甲基托布津或百菌清稀释500-800倍后得到的溶液。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，将蒜瓣制备成无菌苗，利用无菌苗生长点长出来的叶片和根部制取多倍体愈伤组织的具体操作包括如下步骤：将所述步骤(2)处理后得到的蒜瓣接种于MS培养基中，然后将无菌苗生长点长出来的叶片和根部分别接种于叶片诱导培养基和根部愈伤培养基中，得到的愈伤组织转移到分化培养基诱导不定芽，得到的大蒜苗转移到MS培养基中进行生根诱导培养，待鳞茎成熟后转移到消毒土的盆栽中进行培养，经过倍性测定后，即得到诱导大蒜多倍体。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述叶片诱导培养基为：MS培养基，终浓度为1mg/L的2,4-D，终浓度为0.1mg/L的IAA，终浓度为1mg/L的Kinetin；
所述根部愈伤培养基为：MS培养基，终浓度为1mg/L的2,4-D，终浓度为0.1mg/L的IAA；
所述分化培养基为：MS培养基，终浓度为5mg/L的Kinetin，终浓度为1mg/L的NAA。
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