CN108260529A - 一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法 - Google Patents
一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108260529A CN108260529A CN201711451028.7A CN201711451028A CN108260529A CN 108260529 A CN108260529 A CN 108260529A CN 201711451028 A CN201711451028 A CN 201711451028A CN 108260529 A CN108260529 A CN 108260529A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- seedling
- seed
- fruit pod
- root
- culture
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/001—Culture apparatus for tissue culture
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
- A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
- A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Botany (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法，包括：外植体选择步骤；果荚消毒步骤；种子消毒步骤；播种步骤；继代培养步骤；生根培养步骤；炼苗驯化步骤；移栽步骤。该红根野蚕豆的组织培养育苗方法能够快速的用红根野蚕豆的种子培育出优质的种苗，具有发芽率高和生长周期短的特点；实现了红根野蚕豆的批量化生产，满足生产需求，缓解资源稀缺的现况。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，尤其涉及一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法。
背景技术
红根野蚕豆，植物界中被子植物门、双子叶植物纲、玄参科、胡麻草属，为红根野蚕豆的全草centranthera cochinchinensis(lour.)merr.[digitalis cochinchinensislour.]，又名大花胡麻草、化血丹、小红药、滑野蚕豆等；性温、味酸、微辛，用于散瘀止血，消肿止痛；主治咯血、咳血、吐血、妇女闭经、内伤出血、中老年风湿痹痛、筋骨疼痛、脑淤血、脑血栓、酒精肝等。红根野蚕豆是一种名贵的地方民族中药，主要分布在越南、云南靠越南边境的红河州、文山州等地，目前红根野蚕豆野生资源较少，人们采挖过度，存在种子自然繁殖能力低，移栽不易成活等问题，导致红根野蚕豆野生资源稀缺。
红根野蚕豆全株具有药用价值，在《云南思茅中草药选》和《新华本草纲，云南红河中草药手册》均有记载；由于种子细小，通过传统的方式，种子繁殖能力低，繁殖速度慢，自然条件下种子直播出苗率在20％-30％左右，第一年才能长到2-3厘米高，生长周期为3-5年，生长周期较长，满足不了用药需求。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法，该方法能够快速的用红根野蚕豆的种子培育出优质的种苗，具有发芽率高和生长周期短的特点；实现了红根野蚕豆的批量化生产，满足生产需求，缓解资源稀缺的现况。
本发明的目的采用如下技术方案实现：
一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法，包括：
外植体选择步骤：选择健康野生的红根野蚕豆植株，让其开花结果，待果荚成熟后，将果荚采摘保存，得到备用果荚；
果荚消毒步骤：取出备用果荚，剥去备用果荚的最外面一层壳，经过清洗干净后，得到第一洁净果荚；将第一洁净果荚置于烧杯中，依次经过酒精浸泡、第一次无菌水冲洗、升汞浸泡、第二次无菌水冲洗后，再采用无菌滤纸吸干第一洁净果荚的表面水分，得到第二洁净果荚；
种子消毒步骤：将第二洁净果荚中的种子掏出，在无菌环境下将种子放到带无菌滤纸的漏斗中，依次经过酒精浸泡、第一次无菌水冲洗、次氯酸钠溶液浸泡、第二次无菌水冲洗、升汞浸泡、第三次无菌水冲洗后，滤干水，得到备用种子；
播种步骤：解剖所述备用种子，将备用种子撒到培养基上转入培养室内进行培养，得到萌芽种子；
继代培养步骤：将所述萌芽种子置于培养室中继续培养，直至种苗长到2-3cm，获取一级瓶苗；将所述一级瓶苗转移至1/2MS培养基中，生长至5-6cm时，获取二级瓶苗；
生根培养步骤：将所述二级瓶苗转移至生根培养基中进行培养，获取生根瓶苗；
炼苗驯化步骤：将所述生根瓶苗置于培养室中培养，然后移到室外环境中进行驯化，获取驯化苗；
移栽步骤：将所述生根培养基的瓶盖打开，继续放置所述驯化苗3-5天，然后倒出，并用多菌灵浸泡苗根部，接着洗净阴干，移栽至基质中进行驯化。
进一步地，外植体选择步骤中，红根野蚕豆植株的植株年龄为3-4年。
进一步地，果荚消毒步骤中，将剥去最外面一层壳的备用果荚用洗洁精水浸泡5-10min，然后用自来水冲洗3-5min漂洗干净，得到第一洁净果荚；将第一洁净果荚置于烧杯中，用浓度为75％的酒精浸泡1min，第一次无菌水冲洗2-3次，再用浓度0.1％的升汞浸泡5-6min，期间不停的摇动，使其消毒彻底；然后第二次用无菌水冲洗5-6次，最后采用无菌滤纸吸干第一洁净果荚的表面水分，得到第二洁净果荚。
进一步地，种子消毒步骤中，将第二洁净果荚中的种子掏出，在无菌环境下将种子放到带无菌滤纸的漏斗中，用浓度为75％的酒精浸泡30s，浸泡时不断搅拌，第一次无菌水冲洗3-4次，加入浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡1-2min，第二次无菌水冲洗3-4次，再加入浓度为0.2％的升汞浸泡5-6min，第三次无菌水冲洗5-6次，滤干水，得到备用种子。
进一步地，播种步骤中，用经过280-290℃高温消毒的解剖刀和镊子解剖所述备用种子底部1/3的地方，将备用种子撒到1/2MS培养基后，并盖上经过消毒的培养基瓶盖；所述培养室的温度为24-26℃，光照强度为2000-2500Lx，光照时间为10-12小时/天，培养20-30天；在所述1/2MS培养基中添加0.15mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0。
进一步地，播种步骤中，用经过280-290℃高温消毒的解剖刀和镊子解剖所述备用种子底部1/3的地方；将液体培养基以每瓶10-15ml的量灌装在培养瓶中，经灭菌处理后，在无菌的条件下将备用种子播种到培养瓶中，将培养瓶放在摇床上培养，在温度为24℃-26℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为10-12小时每天的条件下，振荡培养13-15天，红根野蚕豆种子开始萌发；萌发6-8天后，将幼芽转接到固体培养基进行培养19-21天；液体培养基的配制如下：将1/2MS培养基中有机物的用量减半，添加浓度为2％的蔗糖。
进一步地，继代培养步骤中，将所述萌芽种子置于光照强度为1500-2000Lx的培养室中继续培养，光照时间为10-12小时/天，生长85-95天，直至种苗长到2-3cm，获取一级瓶苗；在无菌环境下将所述一级瓶苗转移至1/2MS培养基中培养55-65天，生长至5-6cm时，获取二级瓶苗。
进一步地，继代培养步骤中，在所述1/2MS培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0。
进一步地，生根培养步骤中，在无菌环境下将所述二级瓶苗转移至生根培养基中培养55-65天，获取生根瓶苗；所述生根培养基为MS培养基，在所述MS培养基中添加2.0mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、25g/L的香蕉汁、1g/L的生根粉、0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0。
进一步地，在所述炼苗驯化步骤中，将所述生根瓶苗置于培养室中培养85-95天，然后将其移到室外环境中放置15-30天，获取驯化苗；在所述移栽步骤中，用800-1000倍的水稀释多菌灵，获取浸泡液并浸泡苗根部15-20min，然后用清水洗净并阴干。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
(1)本发明所提供的红根野蚕豆的组织培养育苗方法，能够快速的用红根野蚕豆的种子培育出优质的种苗，具有发芽率高和生长周期短的特点；实现了红根野蚕豆的批量化生产，满足生产需求，缓解资源稀缺的现况。
(2)红根野蚕豆多数为野生资源，果荚成熟期为9-10月份，由于地域气候的差异果荚成熟度不一，种子的萌发情况也不一致；红根野蚕豆的外种壳较薄，在收集种子的过程中种子易裂，导致种子污染率增加。本发明采取了不同的消毒办法，使种子消毒彻底的同时保证种子的发芽率在70％以上，提高了野生种源的可利用率。另外，本发明通过组培育苗，采用固体培养和液体培养2种方法，液体培养比固体培养提前10-15天萌发，液体培养基所用药品原料少，添加物只有蔗糖，萌芽阶段采用固体培养的方法可节约原料，加快萌发速度。
综上，组织培养提供红根野蚕豆最适宜的生长环境，让其缩短生长周期，提高种子的萌芽率，达到了种子种苗扩繁的效果。
附图说明
图1中A部分为刚采摘的红根野蚕豆的种子(带茎秆、外壳)的照片；
图1中B部分为去掉茎秆和外壳的红根野蚕豆种子的照片；
图1中C部分为去种皮的红根野蚕豆细小种子的照片；
图1中D部分为种子用0.1％升汞消毒5-6min的照片；
图2中A部分为红根野蚕豆种子消毒后播种到培养基培养的照片；
图2中B部分为红根野蚕豆种子培养20天开始萌发的照片；
图2中C部分为红根野蚕豆生长45天的照片；
图2中D部分为红根野蚕豆生长65天的照片；
图2中E部分为红根野蚕豆生长120天的照片；
图3中A部分为红根野蚕豆种子播种于液体培养基中，置于摇床上均匀摇动培养的照片；
图3中B部分为红根野蚕豆种子在液体培养基中培养15天开始萌芽的照片；
图3中C部分为萌芽20天将幼芽转接到固体培养基进行培养的照片；
图3中D部分为固体培养基中培养7天的照片；
图3中E部分为固体培养基中培养14天的照片；
图3中F部分为固体培养基中培养20天，红根野蚕豆幼芽开始直立生长的照片；
图4中A部分为红根野蚕豆种子萌发长至1-2cm，将其转接到增殖培养基进行增殖培养的照片；
图4中B部分为红根野蚕豆增殖培养15天的照片；
图4中C部分为红根野蚕豆增殖培养45天，瓶苗增殖出密集的植株的照片；
图4中D部分为将增殖完成的植株转接到生根培养基进行培养的照片；
图4中E部分为红根野蚕豆生根培养20天的照片；
图4中F部分为红根野蚕豆生根培养45天，植株长到4-6cm的照片；
图5中A部分为将增殖完成的植株转接到生根培养基进行培养的照片；
图5中B部分为生根培养45天，植株长至4-6cm，开始长出根系的照片；
图5中C部分为生根培养60天，植株粗壮的照片；
图5中D部分为生根培养60天的根系的照片；
图5中E部分为生根培养90天长出粗壮植株的照片；
图5中F部分为生根培养120天粗壮的根系的照片。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法，包括：
外植体选择步骤：选择健康野生的红根野蚕豆植株，让其开花结果，待果荚成熟后，将果荚采摘保存，得到备用果荚；
果荚消毒步骤：取出备用果荚，剥去备用果荚的最外面一层壳，经过清洗干净后，得到第一洁净果荚；将第一洁净果荚置于烧杯中，依次经过酒精浸泡、第一次无菌水冲洗、升汞浸泡、第二次无菌水冲洗后，再采用无菌滤纸吸干第一洁净果荚的表面水分，得到第二洁净果荚；
种子消毒步骤：将第二洁净果荚中的种子掏出，在无菌环境下将种子放到带无菌滤纸的漏斗中，依次经过酒精浸泡、第一次无菌水冲洗、次氯酸钠溶液浸泡、第二次无菌水冲洗、升汞浸泡、第三次无菌水冲洗后，滤干水，得到备用种子；
播种步骤：解剖所述备用种子，将备用种子撒到培养基上转入培养室内进行培养，得到萌芽种子；
继代培养步骤：将所述萌芽种子置于培养室中继续培养，直至种苗长到2-3cm，获取一级瓶苗；将所述一级瓶苗转移至1/2MS培养基中，生长至5-6cm时，获取二级瓶苗；
生根培养步骤：将所述二级瓶苗转移至生根培养基中进行培养，获取生根瓶苗；
炼苗驯化步骤：将所述生根瓶苗置于培养室中培养，然后移到室外环境中进行驯化，获取驯化苗；
移栽步骤：将所述生根培养基的瓶盖打开，继续放置所述驯化苗3-5天，然后倒出，并用多菌灵浸泡苗根部，接着洗净阴干，移栽至基质中进行驯化。
作为进一步的实施方式，外植体选择步骤中，红根野蚕豆植株的植株年龄为3-4年；选取9月中下旬至10月初的成熟完好的果荚，由于果荚种壳较薄，易压裂或压碎，应谨慎收集保管。
作为进一步的实施方式，参照图1，果荚消毒步骤中，将剥去最外面一层壳的备用果荚用洗洁精水浸泡5-10min，然后用自来水冲洗3-5min漂洗干净，得到第一洁净果荚；将第一洁净果荚置于烧杯中，用浓度为75％的酒精浸泡1min，第一次无菌水冲洗2-3次，再用浓度0.1％的升汞浸泡5-6min，期间不停的摇动，使其消毒彻底；然后第二次用无菌水冲洗5-6次，最后采用无菌滤纸吸干第一洁净果荚的表面水分，得到第二洁净果荚。
作为进一步的实施方式，种子消毒步骤中，将第二洁净果荚中的种子掏出，在无菌环境下将种子放到带无菌滤纸的漏斗中，用浓度为75％的酒精浸泡30s，浸泡时不断搅拌，第一次无菌水冲洗3-4次，加入浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡1-2min，第二次无菌水冲洗3-4次，再加入浓度为0.2％的升汞浸泡5-6min，第三次无菌水冲洗5-6次，滤干水，得到备用种子。
作为进一步的实施方式，参照图2，播种步骤中，用经过280-290℃高温消毒的解剖刀和镊子解剖所述备用种子底部1/3的地方，将备用种子撒到1/2MS培养基后，并盖上经过消毒的培养基瓶盖；所述培养室的温度为24-26℃，光照强度为2000-2500Lx，光照时间为10-12小时/天，培养20-30天；在所述1/2MS培养基中添加0.15mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0。
作为进一步的实施方式，参照图3，播种步骤中，用经过280-290℃高温消毒的解剖刀和镊子解剖所述备用种子底部1/3的地方；将液体培养基以每瓶10-15ml的量灌装在培养瓶中，经灭菌处理后，在无菌的条件下将备用种子播种到培养瓶中，将培养瓶放在摇床上培养，在温度为24℃-26℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为10-12小时每天的条件下，振荡培养13-15天，红根野蚕豆种子开始萌发；萌发6-8天后，将幼芽转接到固体培养基进行培养19-21天；液体培养基的配制如下：将1/2MS培养基中有机物的用量减半，添加浓度为2％的蔗糖。
作为进一步的实施方式，参照图4，继代培养步骤中，将所述萌芽种子置于光照强度为1500-2000Lx的培养室中继续培养，光照时间为10-12小时/天，生长85-95天，直至种苗长到2-3cm，获取一级瓶苗；在无菌环境下将所述一级瓶苗转移至1/2MS培养基中培养55-65天，生长至5-6cm时，获取二级瓶苗。
作为进一步的实施方式，继代培养步骤中，在所述1/2MS培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0。
作为进一步的实施方式，参照图5，生根培养步骤中，在无菌环境下将所述二级瓶苗转移至生根培养基中培养55-65天，获取生根瓶苗；所述生根培养基为MS培养基，在所述MS培养基中添加2.0mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、25g/L的香蕉汁、1g/L的生根粉、0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0。
作为进一步的实施方式，在所述炼苗驯化步骤中，将所述生根瓶苗置于培养室中培养85-95天，然后将其移到室外环境中放置15-30天，获取驯化苗。
作为进一步的实施方式，在所述移栽步骤中，用800-1000倍的水稀释多菌灵，获取浸泡液并浸泡苗根部15-20min，然后用清水洗净并阴干。
实施例1：
一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法，包括：
外植体选择步骤：选择健康野生的红根野蚕豆植株，让其开花结果，待果荚成熟后，将果荚采摘保存，得到备用果荚；红根野蚕豆植株的植株年龄为3年；选取9月中下旬至10月初的成熟完好的果荚，由于果荚种壳较薄，易压裂或压碎，应谨慎收集保管。
果荚消毒步骤：取出备用果荚，剥去备用果荚的最外面一层壳，将剥去最外面一层壳的备用果荚用洗洁精水浸泡5min，然后用自来水冲洗3min漂洗干净，得到第一洁净果荚；将第一洁净果荚置于烧杯中，用浓度为75％的酒精浸泡1min，第一次无菌水冲洗2次，再用浓度0.1％的升汞浸泡5min，期间不停的摇动，使其消毒彻底；然后第二次用无菌水冲洗5次，最后采用无菌滤纸吸干第一洁净果荚的表面水分，得到第二洁净果荚。
种子消毒步骤：将第二洁净果荚中的种子掏出，在无菌环境下将种子放到带无菌滤纸的漏斗中，用浓度为75％的酒精浸泡30s，浸泡时不断搅拌，第一次无菌水冲洗3次，加入浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡1min，第二次无菌水冲洗3次，再加入浓度为0.2％的升汞浸泡5min，第三次无菌水冲洗5次，滤干水，得到备用种子。
播种步骤：用经过280℃高温消毒的解剖刀和镊子解剖所述备用种子底部1/3的地方，将备用种子撒到1/2MS培养基后，并盖上经过消毒的培养基瓶盖；所述培养室的温度为24℃，光照强度为2000Lx，光照时间为10小时/天，培养20天；在所述1/2MS培养基中添加0.15mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉，并将培养基的pH调至5.8。
继代培养步骤：将所述萌芽种子置于光照强度为1500Lx的培养室中继续培养，光照时间为10小时/天，生长85天，直至种苗长到2cm，获取一级瓶苗；在无菌环境下将所述一级瓶苗转移至1/2MS培养基中培养55天，生长至5cm时，获取二级瓶苗。在所述1/2MS培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至5.8。
生根培养步骤：将所述二级瓶苗转移至生根培养基中进行培养，获取生根瓶苗；在无菌环境下将所述二级瓶苗转移至生根培养基中培养55天，获取生根瓶苗；所述生根培养基为MS培养基，在所述MS培养基中添加2.0mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、25g/L的香蕉汁、1g/L的生根粉、0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至5.8；
炼苗驯化步骤：将所述生根瓶苗置于培养室中培养85天，然后将其移到室外环境中放置15天，获取驯化苗；
移栽步骤：将所述生根培养基的瓶盖打开，继续放置所述驯化苗3天，然后倒出，用800倍的水稀释多菌灵，获取浸泡液并浸泡苗根部15min，然后用清水洗净并阴干，移栽至基质中进行驯化。
实施例1的试验结果：在播种步骤中，红根野蚕豆种子育苗的种子发芽率82.5％，继代培养增殖系数5.25，生根培养生根率91％，并且，红根野蚕豆在果荚发芽时(见图2)，以及在继代培养(见图4)、生根培养(见图5)、炼苗驯化和移栽时，红根野蚕豆的长势均良好。
实施例2：
一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法，包括：
外植体选择步骤：选择健康野生的红根野蚕豆植株，让其开花结果，待果荚成熟后，将果荚采摘保存，得到备用果荚；红根野蚕豆植株的植株年龄为3-4年；选取9月中下旬至10月初的成熟完好的果荚，由于果荚种壳较薄，易压裂或压碎，应谨慎收集保管。
果荚消毒步骤：取出备用果荚，剥去备用果荚的最外面一层壳，将剥去最外面一层壳的备用果荚用洗洁精水浸泡10min，然后用自来水冲洗5min漂洗干净，得到第一洁净果荚；将第一洁净果荚置于烧杯中，用浓度为75％的酒精浸泡1min，第一次无菌水冲洗3次，再用浓度0.1％的升汞浸泡6min，期间不停的摇动，使其消毒彻底；然后第二次用无菌水冲洗6次，最后采用无菌滤纸吸干第一洁净果荚的表面水分，得到第二洁净果荚。
种子消毒步骤：将第二洁净果荚中的种子掏出，在无菌环境下将种子放到带无菌滤纸的漏斗中，用浓度为75％的酒精浸泡30s，浸泡时不断搅拌，第一次无菌水冲洗4次，加入浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡2min，第二次无菌水冲洗4次，再加入浓度为0.2％的升汞浸泡6min，第三次无菌水冲洗6次，滤干水，得到备用种子。
播种步骤：用经过290℃高温消毒的解剖刀和镊子解剖所述备用种子底部1/3的地方，将备用种子撒到1/2MS培养基后，并盖上经过消毒的培养基瓶盖；所述培养室的温度为26℃，光照强度为2500Lx，光照时间为12小时/天，培养30天；在所述1/2MS培养基中添加0.15mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉，并将培养基的pH调至6.0。
继代培养步骤：将所述萌芽种子置于光照强度为2000Lx的培养室中继续培养，光照时间为12小时/天，生长95天，直至种苗长到3cm，获取一级瓶苗；在无菌环境下将所述一级瓶苗转移至1/2MS培养基中培养65天，生长至6cm时，获取二级瓶苗。在所述1/2MS培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至6.0。
生根培养步骤：将所述二级瓶苗转移至生根培养基中进行培养，获取生根瓶苗；在无菌环境下将所述二级瓶苗转移至生根培养基中培养65天，获取生根瓶苗；所述生根培养基为MS培养基，在所述MS培养基中添加2.0mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、25g/L的香蕉汁、1g/L的生根粉、0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至6.0；
炼苗驯化步骤：将所述生根瓶苗置于培养室中培养95天，然后将其移到室外环境中放置30天，获取驯化苗；
移栽步骤：将所述生根培养基的瓶盖打开，继续放置所述驯化苗5天，然后倒出，用1000倍的水稀释多菌灵，获取浸泡液并浸泡苗根部20min，然后用清水洗净并阴干，移栽至基质中进行驯化。
实施例2的试验结果：在播种步骤中，红根野蚕豆种子育苗的种子发芽率84％，继代培养增殖系数4.9，生根培养生根率93％，并且，红根野蚕豆在果荚发芽时，以及在继代培养、生根培养、炼苗驯化和移栽时，红根野蚕豆的长势均良好，每一个生长阶段的示意图与实施例1相似，在此不再赘述。
实施例3：
一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法，包括：
外植体选择步骤：选择健康野生的红根野蚕豆植株，让其开花结果，待果荚成熟后，将果荚采摘保存，得到备用果荚；红根野蚕豆植株的植株年龄为3-4年；选取9月中下旬至10月初的成熟完好的果荚，由于果荚种壳较薄，易压裂或压碎，应谨慎收集保管。
果荚消毒步骤：取出备用果荚，剥去备用果荚的最外面一层壳，将剥去最外面一层壳的备用果荚用洗洁精水浸泡10min，然后用自来水冲洗5min漂洗干净，得到第一洁净果荚；将第一洁净果荚置于烧杯中，用浓度为75％的酒精浸泡1min，第一次无菌水冲洗3次，再用浓度0.1％的升汞浸泡6min，期间不停的摇动，使其消毒彻底；然后第二次用无菌水冲洗6次，最后采用无菌滤纸吸干第一洁净果荚的表面水分，得到第二洁净果荚。
种子消毒步骤：将第二洁净果荚中的种子掏出，在无菌环境下将种子放到带无菌滤纸的漏斗中，用浓度为75％的酒精浸泡30s，浸泡时不断搅拌，第一次无菌水冲洗4次，加入浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡2min，第二次无菌水冲洗4次，再加入浓度为0.2％的升汞浸泡6min，第三次无菌水冲洗6次，滤干水，得到备用种子。
播种步骤：用经过286℃高温消毒的解剖刀和镊子解剖所述备用种子底部1/3的地方，将备用种子撒到1/2MS培养基后，并盖上经过消毒的培养基瓶盖；所述培养室的温度为26℃，光照强度为2500Lx，光照时间为12小时/天，培养30天；在所述1/2MS培养基中添加0.15mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉，并将培养基的pH调至6.0。
继代培养步骤：将所述萌芽种子置于光照强度为2000Lx的培养室中继续培养，光照时间为12小时/天，生长95天，直至种苗长到3cm，获取一级瓶苗；在无菌环境下将所述一级瓶苗转移至1/2MS培养基中培养60天，生长至6cm时，获取二级瓶苗。在所述1/2MS培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至6.0。
生根培养步骤：将所述二级瓶苗转移至生根培养基中进行培养，获取生根瓶苗；在无菌环境下将所述二级瓶苗转移至生根培养基中培养60天，获取生根瓶苗；所述生根培养基为MS培养基，在所述MS培养基中添加2.0mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、25g/L的香蕉汁、1g/L的生根粉、0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至6.0；
炼苗驯化步骤：将所述生根瓶苗置于培养室中培养90天，然后将其移到室外环境中放置30天，获取驯化苗；
移栽步骤：将所述生根培养基的瓶盖打开，继续放置所述驯化苗5天，然后倒出，用1000倍的水稀释多菌灵，获取浸泡液并浸泡苗根部20min，然后用清水洗净并阴干，移栽至基质中进行驯化。
实施例3的试验结果：在播种步骤中，红根野蚕豆种子育苗的种子发芽率83％，继代培养增殖系数5，生根培养生根率89.7％，并且，红根野蚕豆在果荚发芽时，以及在继代培养、生根培养、炼苗驯化和移栽时，红根野蚕豆的长势均良好，每一个生长阶段的示意图与实施例1相似，在此不再赘述。
实施例4：
一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法，包括：
外植体选择步骤：选择健康野生的红根野蚕豆植株，让其开花结果，待果荚成熟后，将果荚采摘保存，得到备用果荚；红根野蚕豆植株的植株年龄为3-4年；选取9月中下旬至10月初的成熟完好的果荚，由于果荚种壳较薄，易压裂或压碎，应谨慎收集保管。
果荚消毒步骤：取出备用果荚，剥去备用果荚的最外面一层壳，将剥去最外面一层壳的备用果荚用洗洁精水浸泡10min，然后用自来水冲洗5min漂洗干净，得到第一洁净果荚；将第一洁净果荚置于烧杯中，用浓度为75％的酒精浸泡1min，第一次无菌水冲洗3次，再用浓度0.1％的升汞浸泡6min，期间不停的摇动，使其消毒彻底；然后第二次用无菌水冲洗6次，最后采用无菌滤纸吸干第一洁净果荚的表面水分，得到第二洁净果荚。
种子消毒步骤：将第二洁净果荚中的种子掏出，在无菌环境下将种子放到带无菌滤纸的漏斗中，用浓度为75％的酒精浸泡30s，浸泡时不断搅拌，第一次无菌水冲洗4次，加入浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡2min，第二次无菌水冲洗4次，再加入浓度为0.2％的升汞浸泡6min，第三次无菌水冲洗6次，滤干水，得到备用种子。
播种步骤：用经过290℃高温消毒的解剖刀和镊子解剖所述备用种子底部1/3的地方；将液体培养基以每瓶15ml的量灌装在培养瓶中，经灭菌处理后，在无菌的条件下将备用种子播种到培养瓶中，将培养瓶放在摇床上培养，在温度为25℃，光照强度为2500lx，光照时间为11小时每天的条件下，振荡培养15天，红根野蚕豆种子开始萌发；萌发7天后，将幼芽转接到固体培养基进行培养20天；液体培养基的配制如下：将1/2MS培养基中有机物的用量减半，添加浓度为2％的蔗糖。
继代培养步骤：将所述萌芽种子置于光照强度为2000Lx的培养室中继续培养，光照时间为12小时/天，生长95天，直至种苗长到3cm，获取一级瓶苗；在无菌环境下将所述一级瓶苗转移至1/2MS培养基中培养60天，生长至6cm时，获取二级瓶苗。在所述1/2MS培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至6.0。
生根培养步骤：将所述二级瓶苗转移至生根培养基中进行培养，获取生根瓶苗；在无菌环境下将所述二级瓶苗转移至生根培养基中培养60天，获取生根瓶苗；所述生根培养基为MS培养基，在所述MS培养基中添加2.0mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤(6-BA)、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、25g/L的香蕉汁、1g/L的生根粉、0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至6.0；
炼苗驯化步骤：将所述生根瓶苗置于培养室中培养90天，然后将其移到室外环境中放置30天，获取驯化苗；
移栽步骤：将所述生根培养基的瓶盖打开，继续放置所述驯化苗5天，然后倒出，用1000倍的水稀释多菌灵，获取浸泡液并浸泡苗根部20min，然后用清水洗净并阴干，移栽至基质中进行驯化。
实施例4的试验结果：在播种步骤中，红根野蚕豆种子育苗的种子发芽率83％，继代培养增殖系数5.3，生根培养生根率91％，并且，参照图3，红根野蚕豆在果荚发芽时，以及在继代培养、生根培养、炼苗驯化和移栽时，红根野蚕豆的长势均良好，其它每一个生长阶段的示意图与实施例1相似，在此不再赘述。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法，包括：
外植体选择步骤：选择健康野生的红根野蚕豆植株，让其开花结果，待果荚成熟后，将果荚采摘保存，得到备用果荚；
果荚消毒步骤：取出备用果荚，剥去备用果荚的最外面一层壳，经过清洗干净后，得到第一洁净果荚；将第一洁净果荚置于烧杯中，依次经过酒精浸泡、第一次无菌水冲洗、升汞浸泡、第二次无菌水冲洗后，再采用无菌滤纸吸干第一洁净果荚的表面水分，得到第二洁净果荚；
种子消毒步骤：将第二洁净果荚中的种子掏出，在无菌环境下将种子放到带无菌滤纸的漏斗中，依次经过酒精浸泡、第一次无菌水冲洗、次氯酸钠溶液浸泡、第二次无菌水冲洗、升汞浸泡、第三次无菌水冲洗后，滤干水，得到备用种子；
播种步骤：解剖所述备用种子，将备用种子撒到培养基上转入培养室内进行培养，得到萌芽种子；
继代培养步骤：将所述萌芽种子置于培养室中继续培养，直至种苗长到2-3cm，获取一级瓶苗；将所述一级瓶苗转移至1/2MS培养基中，生长至5-6cm时，获取二级瓶苗；
生根培养步骤：将所述二级瓶苗转移至生根培养基中进行培养，获取生根瓶苗；
炼苗驯化步骤：将所述生根瓶苗置于培养室中培养，然后移到室外环境中进行驯化，获取驯化苗；
移栽步骤：将所述生根培养基的瓶盖打开，继续放置所述驯化苗3-5天，然后倒出，并用多菌灵浸泡苗根部，接着洗净阴干，移栽至基质中进行驯化。
2.如权利要求1所述的红根野蚕豆的组织培养育苗方法，其特征在于，外植体选择步骤中，红根野蚕豆植株的植株年龄为3-4年。
3.如权利要求1所述的红根野蚕豆的组织培养育苗方法，其特征在于，果荚消毒步骤中，将剥去最外面一层壳的备用果荚用洗洁精水浸泡5-10min，然后用自来水冲洗3-5min漂洗干净，得到第一洁净果荚；将第一洁净果荚置于烧杯中，用浓度为75％的酒精浸泡1min，第一次无菌水冲洗2-3次，再用浓度0.1％的升汞浸泡5-6min，期间不停的摇动，使其消毒彻底；然后第二次用无菌水冲洗5-6次，最后采用无菌滤纸吸干第一洁净果荚的表面水分，得到第二洁净果荚。
4.如权利要求1所述的红根野蚕豆的组织培养育苗方法，其特征在于，种子消毒步骤中，将第二洁净果荚中的种子掏出，在无菌环境下将种子放到带无菌滤纸的漏斗中，用浓度为75％的酒精浸泡30s，浸泡时不断搅拌，第一次无菌水冲洗3-4次，加入浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡1-2min，第二次无菌水冲洗3-4次，再加入浓度为0.2％的升汞浸泡5-6min，第三次无菌水冲洗5-6次，滤干水，得到备用种子。
5.如权利要求1所述的红根野蚕豆的组织培养育苗方法，其特征在于，播种步骤中，用经过280-290℃高温消毒的解剖刀和镊子解剖所述备用种子底部1/3的地方，将备用种子撒到1/2MS培养基后，并盖上经过消毒的培养基瓶盖；所述培养室的温度为24-26℃，光照强度为2000-2500Lx，光照时间为10-12小时/天，培养20-30天；在所述1/2MS培养基中添加0.15mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0。
6.如权利要求5所述的红根野蚕豆的组织培养育苗方法，其特征在于，播种步骤中，用经过280-290℃高温消毒的解剖刀和镊子解剖所述备用种子底部1/3的地方；将液体培养基以每瓶10-15ml的量灌装在培养瓶中，经灭菌处理后，在无菌的条件下将备用种子播种到培养瓶中，将培养瓶放在摇床上培养，在温度为24℃-26℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为10-12小时每天的条件下，振荡培养13-15天，红根野蚕豆种子开始萌发；萌发6-8天后，将幼芽转接到固体培养基进行培养19-21天；液体培养基的配制如下：将1/2MS培养基中有机物的用量减半，添加浓度为2％的蔗糖。
7.如权利要求1所述的红根野蚕豆的组织培养育苗方法，其特征在于，继代培养步骤中，将所述萌芽种子置于光照强度为1500-2000Lx的培养室中继续培养，光照时间为10-12小时/天，生长85-95天，直至种苗长到2-3cm，获取一级瓶苗；在无菌环境下将所述一级瓶苗转移至1/2MS培养基中培养55-65天，生长至5-6cm时，获取二级瓶苗。
8.如权利要求7所述的红根野蚕豆的组织培养育苗方法，其特征在于，继代培养步骤中，在所述1/2MS培养基中添加0.5mg/L的萘乙酸、1.0mg/L的6-苄基腺嘌呤、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0。
9.如权利要求1所述的红根野蚕豆的组织培养育苗方法，其特征在于，生根培养步骤中，在无菌环境下将所述二级瓶苗转移至生根培养基中培养55-65天，获取生根瓶苗；所述生根培养基为MS培养基，在所述MS培养基中添加2.0mg/L的萘乙酸、0.5mg/L的6-苄基腺嘌呤、浓度为2％的蔗糖、4.8g/L的琼脂粉、35g/L的土豆汁、25g/L的香蕉汁、1g/L的生根粉、0.3g/L的活性碳粉，并将培养基的pH调至5.8-6.0。
10.如权利要求1所述的红根野蚕豆的组织培养育苗方法，其特征在于，在所述炼苗驯化步骤中，将所述生根瓶苗置于培养室中培养85-95天，然后将其移到室外环境中放置15-30天，获取驯化苗；在所述移栽步骤中，用800-1000倍的水稀释多菌灵，获取浸泡液并浸泡苗根部15-20min，然后用清水洗净并阴干。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711451028.7A CN108260529A (zh) | 2017-12-27 | 2017-12-27 | 一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711451028.7A CN108260529A (zh) | 2017-12-27 | 2017-12-27 | 一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108260529A true CN108260529A (zh) | 2018-07-10 |
Family
ID=62772827
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711451028.7A Pending CN108260529A (zh) | 2017-12-27 | 2017-12-27 | 一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108260529A (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112544445A (zh) * | 2020-12-03 | 2021-03-26 | 许冬月 | 一种红根野蚕豆组织培养方法 |
| CN116158346A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-05-26 | 甘肃农业大学 | 一种蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104705187A (zh) * | 2015-03-19 | 2015-06-17 | 马关壮达农业科技有限公司 | 一种红根野蚕豆组织培养方法 |
-
2017
- 2017-12-27 CN CN201711451028.7A patent/CN108260529A/zh active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104705187A (zh) * | 2015-03-19 | 2015-06-17 | 马关壮达农业科技有限公司 | 一种红根野蚕豆组织培养方法 |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN112544445A (zh) * | 2020-12-03 | 2021-03-26 | 许冬月 | 一种红根野蚕豆组织培养方法 |
| CN116158346A (zh) * | 2022-12-06 | 2023-05-26 | 甘肃农业大学 | 一种蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法 |
| CN116158346B (zh) * | 2022-12-06 | 2024-05-14 | 甘肃农业大学 | 一种蚕豆外植体防褐化的愈伤组织培养方法 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN104904597A (zh) | 一种白及的快速繁殖及阳光壮苗方法 | |
| CN101595824B (zh) | 用檀香树种子胚离体快速育苗的方法 | |
| CN108617511A (zh) | 铁皮石斛的种子组培快速繁殖方法 | |
| CN104041412A (zh) | 一种贵州半蒴苣苔的组织培养快速繁殖方法 | |
| CN109220790B (zh) | 一种红果参离体外繁方法 | |
| CN104106468A (zh) | 一种五指毛桃的组织培养快速繁殖方法 | |
| CN104012401A (zh) | 一种霍山石斛的快速繁殖方法 | |
| CN105265320B (zh) | 一种绵毛马兜铃的组织培养繁殖方法 | |
| CN100512631C (zh) | 一种卡瓦胡椒的组织培养方法 | |
| CN105104206B (zh) | 见血青的离体保存方法 | |
| CN108260529A (zh) | 一种红根野蚕豆的组织培养育苗方法 | |
| CN109479718A (zh) | 一种文冠果组培苗的生根方法 | |
| CN109042342A (zh) | 一种春兰的组织培养方法 | |
| CN105900564B (zh) | 一种促使珍稀濒危植物甜菜树种子高效萌发的方法 | |
| CN108243959A (zh) | 一种以黄粱木茎段为外植体的高效再生方法 | |
| CN104938088B (zh) | 一种促进青风藤种子萌发的方法 | |
| CN102138527B (zh) | 土茯苓组培苗的培养方法 | |
| CN108142281A (zh) | 一种杜仲组织培养方法 | |
| CN106857258A (zh) | 一种带叶兜兰的组织培养快速繁殖方法 | |
| CN109511551A (zh) | 一种油橄榄体细胞胚胎发生及植株再生方法 | |
| CN110024688A (zh) | 一种锦鸡儿芽增殖与植株再生的方法及其培养基 | |
| CN109984035A (zh) | 一种建立金钗石斛再生体系的方法 | |
| CN108207624A (zh) | 一种红根野蚕豆茎段组织培养育苗方法 | |
| CN104255498A (zh) | 一种楤木的种苗快速繁殖的方法 | |
| CN107593462A (zh) | 一种狗脊贯众组织培养技术 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20190403 Address after: 650000 6th Floor, Block A, Sunshine Building, 999 Kegao Road, Wuhua District, Kunming City, Yunnan Province Applicant after: Kangmei Pharmaceutical (Kunming) Germplasm Resources Co., Ltd. Address before: 663099 Wenshan Zhong and Miao Autonomous Prefecture Wenshan City, Yunnan Province, Kaihua South Road Wenshan Biovalley of Chinese Traditional Medicine 4-21 Applicant before: Kangmei Pharmaceutical (Wenshan) medicinal material planting Management Co., Ltd. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180710 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |