CN112335546B - 一种体胚发生途径的椰枣组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属植物组织培养技术领域，涉及一种体胚发生途径的椰枣组织培养方法，是取椰枣材料为外植体，经愈伤组织诱导培养、体胚诱导培养、不定芽诱导培养、生根培养得到性状一致的椰枣种苗。本发明以椰枣种子合子胚、无菌苗根尖、幼苗茎尖和嫩叶等椰枣材料为外植体，通过体胚发生途径培育出完整的组培苗，可以结合椰枣性别鉴定技术规模化生产性状一致的椰枣种苗，适合工厂化育苗和规模化栽培，所得椰枣种苗能够保持原品种的优良性状，遗传性状稳定，变异小，具有操作简单、成本低、繁殖系数高等特点，同时为椰枣分子育种等研究奠定基础，对椰枣产业发展具有重要意义。

Description

一种体胚发生途径的椰枣组织培养方法
技术领域
本发明属植物组织培养技术领域，涉及一种以椰枣种子合子胚、无菌苗根尖、幼苗茎尖和嫩叶为外植体，经过体胚发生途径获得完整再生植株的方法。
背景技术
椰枣(Phoenix dactylifera L.)是世界热区尤其是北非、中东、西亚的重要经济作物和主要粮食作物，是该地区人民重要的食品来源和经济收入来源。椰枣是雌雄异株，常规情况下可以通过种子和分蘖苗繁殖，但种子繁殖的实生苗存在品种性状不一致、雌株雄株不明确等问题，分蘖苗则存在繁殖系数低、品种性状退化等问题。
组织培养具有繁殖系数高、品种性状一致等优势，不仅可以满足种苗规模化繁育的需求，也可以为遗传转化、分子育种等研究奠定基础。目前，国外主要以椰枣花序作为组织培养的外植体，作为组织培养途径之一的胚胎发生途径能够弥补利用种子和分蘖方式繁殖种苗所存在的缺点。经检索，尚无以椰枣材料为外植体利用胚胎发生途径进行种苗繁育的相关研究报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种体胚发生途径的椰枣组织培养方法，以椰枣材料为外植体，通过体胚发生途径培育出完整的椰枣组培苗，可以结合椰枣性别鉴定技术规模化生产性状一致的椰枣种苗，同时为椰枣分子育种等研究奠定基础，对椰枣产业发展具有重要意义。
本发明所采用的技术方案：
一种体胚发生途径的椰枣组织培养方法，其步骤如下：
1、外植体选取
取椰枣材料为外植体，在超净工作台上进行切割操作。所述椰枣材料是椰枣种子合子胚、无菌苗根尖、幼苗茎尖或嫩叶。
2、愈伤组织诱导培养
将切割好的外植体接种于愈伤组织诱导培养基中培养，得到愈伤组织，培养条件为暗培养，培养温度20～30℃，湿度为55％～85％，每15～70天继代一次，继代1～5次。所述愈伤组织诱导培养基是以MS、WPM或Y3为基础培养基，添加0.15～150mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、0.15～150mg/L picloram(毒莠定)、0.15～50mg/L NAA(1-萘乙酸)、0.01～10mg/L 6-BA(6-苄基嘌呤)、0.1～100mg/L硫酸腺嘌呤、3～8g/L植物凝胶、3～9g/L活性炭(200目)、20～40g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.5～6.0。
3、体胚诱导培养
将得到的愈伤组织接种于体胚诱导培养基中培养，得到成熟体胚，培养条件为暗培养，培养温度为20～30℃，湿度为55％～85％，每15～45天继代一次，继代1～5次。所述体胚诱导培养基是以MS、WPM或Y3为基础培养基，添加0.1～2mg/L 2ip(N6-异戊烯基腺嘌呤)、0.1～5mg/L 6-BA、0.01～5mg/L NAA、5～80mg/L Gln(谷氨酰胺)、10～180mg/L酸水解酪蛋白、3～8g/L植物凝胶、20～40g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.5～6.0。
4、不定芽诱导培养
将获得的成熟体胚转入到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，得到不定芽，培养条件为光培养，光照强度为1000～2100lx，前30天每日光照时间为2～4小时/天，30天后光照时间为8～14小时/天，培养温度为20～30℃，湿度为55％～85％，每15～45天继代一次，继代1～5次。所述不定芽诱导培养基是以MS、WPM或Y3为基础培养基，添加0.05～2mg/L NAA、0.01～10mg/L 6-BA、0.1～10mg/L GA3(赤霉素)、3～8g/L植物凝胶、15～30g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.5～6.0。
5、生根培养
将获得的不定芽接种到生根培养基中进行生根培养，得到组培苗。培养条件为光培养，光照强度为1000～2100lx，前30天光照时间为8～14小时/天，30天后光照时间为12～14小时/天，培养温度为20～30℃，湿度为55％～85％，每15～30天继代一次，继代1～5次。所述生根培养基是以MS、WPM或Y3为基础培养基，添加0.05～10mg/LNAA、0.1～200mg/L DA-6(己酸二乙氨基乙醇酯)、3～8g/L植物凝胶、20～35g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.5～6.0。
6、试管苗培养
待生根后的组培苗长至叶片数为1～3片、根长为1～3cm时转接到壮苗培养基中进行培养，得到试管苗，每一株苗单独接种于一个试管或培养瓶中。培养条件为光培养，光照强度为1500～2100lx，光照时间为12～14小时/天，培养温度为25～35℃，湿度为55％～85％，每15～25天继代一次，继代1～5次。所述壮苗培养基是以MS、WPM或Y3为基础培养基，添加0.05～15mg/L NAA、0.1～100mg/L DA-6、3～8g/L植物凝胶、20～35g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.5～6.0。
7、炼苗
待试管苗长至叶片数为3～5片、根长为3～5cm时移栽到带有土壤的育苗袋中，在日光温室或光照培养室中进行炼苗。培养条件为光培养，光照强度为1500～2500lx，光照时间为7～14小时/天，培养温度为25～35℃，湿度为60％～80％，炼苗30～50天后即可转移至遮光度为30～50％的室外荫棚中二次炼苗，炼苗30～90天后即可移栽至田间种植。
本发明以椰枣种子合子胚、无菌苗根尖、幼苗茎尖和嫩叶等椰枣材料为外植体，通过体胚发生途径培育出完整的组培苗，可以结合椰枣性别鉴定技术规模化生产性状一致的椰枣种苗，适合工厂化育苗和规模化栽培，所得椰枣种苗能够保持原品种的优良性状，遗传性状稳定，变异小，具有操作简单、成本低、繁殖系数高等特点，同时为椰枣分子育种等研究奠定基础，对椰枣产业发展具有重要意义。
附图说明
图1是本发明的组织培养流程图。A、外植体；B、愈伤；C、体胚和不定芽；D、不定芽；E、生根；F、试管苗。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。
本发明以椰枣外植体(种子合子胚、无菌苗根尖、幼苗茎尖或嫩叶)经脱分化获得愈伤组织、体胚，再经不定芽诱导、生根培养得到试管苗，炼苗后即可移栽至田间种植(如图1所示)。
一、椰枣组织培养育苗
实施例一：以椰枣种子合子胚为外植体
1、外植体选择、消毒及接种
选择椰枣种子合子胚为外植体，将前处理好的合子胚首先采用漂渍液浸泡2次，每次浸泡5分钟，浸泡过程中需不停的搅拌，消毒后使用灭菌纯水清洗，清洗过程中不停搅拌，直至最后一次清洗后水清澈，清洗后将样品放置于灭菌锡箔纸上，切割后备用。
2、愈伤组织诱导培养
将上述切割后的椰枣种子合子胚外植体接种于愈伤组织诱导培养基中培养，培养条件为暗培养，培养温度25℃，湿度为60％，每30天继代一次，继代2次。愈伤组织诱导培养基：MS+60mg/L 2,4-D+10mg/L picloram+0.15mg/L NAA+0.02mg/L 6-BA+1mg/L硫酸腺嘌呤+3.5g/L植物凝胶+3g/L活性炭(200目)+28g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.7。
3、体胚诱导培养
将上述得到的愈伤组织接种于体胚诱导培养基中培养，培养条件为暗培养，培养温度25℃，湿度为60％，每25天继代一次，继代3次。体胚诱导培养基：MS+2mg/L 2ip+0.1mg/L 6-BA+0.2mg/L NAA+5mg/L Gln+10mg/L酸水解酪蛋白+3.5g/L植物凝胶+28g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.7。
4、不定芽诱导培养
将获得的成熟体胚转入到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，培养条件为光培养，光照强度为1000lx，前30天每日光照时间为2.5小时/天，30天后光照时间为8小时/天，培养温度为25℃，湿度为60％，每30天继代一次，继代2次。不定芽诱导培养基：MS+0.05mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+0.2mg/L GA3+3.5g/L植物凝胶+20g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.7。
5、生根培养
将获得的不定芽以2株或1株为单位进行分离，接种到生根培养基中，每个培养盒接种4个单位。培养条件为光培养，光照强度为1000lx，前30天光照时间为8小时/天，30天后光照时间为12小时/天，培养温度为25℃，湿度为70％，每16天继代一次，继代4次，得到组培苗。生根培养基：MS+5mg/L NAA+0.1mg/L DA-6+3.5g/L植物凝胶+20g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.7。
6、试管苗培养
将生根后的组培苗(叶片数为1-3片，根长为1-3cm)转接到壮苗培养基中进行培养，每一株苗单独接种于一个试管或培养瓶中。培养条件为光培养，光照强度为1500lx，光照时间为12小时/天，培养温度为25℃，湿度为85％，每25天继代一次，继代3次，得到试管苗。所述壮苗培养基：MS+5mg/L NAA+0.1mg/L DA-6+3.5g/L植物凝胶+20g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.7。
7、炼苗
将上述试管苗(叶片数为3-5片，根长为3-5cm)移栽到带有土壤的育苗袋中，在日光温室中进行炼苗。培养条件为光培养，光照强度为2500lx，光照时间为10小时/天，培养温度为25℃，湿度为80％，炼苗30天后即可转移至遮光度为50％的室外荫棚中二次炼苗，炼苗90天后即可移栽至田间种植。
实施例二：以椰枣无菌苗根尖为外植体
1、外植体选择、消毒及接种
选取椰枣无菌苗根尖为外植体，无需再次消毒，在超净工作台上进行操作，直接将种子播种后30d左右获得的无菌苗(椰枣种子发芽形成的无菌苗，从种子播种到形成无菌苗的培养时间为30d-45d，全黑暗培养，其主根带有不定根的根长为0.05-0.8cm)放在已灭菌的锡箔纸上进行切割处理，其中将带有不定根根尖的主根剪成0.4-1cm的小段，备用。
2、愈伤组织诱导培养
将上述带有不定根根尖的小段外植体接种于愈伤组织诱导培养基中培养，每个培养盒接种6-25个外植体，培养条件为暗培养，培养温度25℃，湿度为60％，每60天继代一次，继代1次。愈伤组织诱导培养基：MS+40mg/L 2,4-D+40mg/L picloram+0.15mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+3.5g/L植物凝胶+5mg/L硫酸腺嘌呤+3.5g/L活性炭(200目)+30g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
3、体胚诱导培养
将得到的愈伤组织接种于体胚诱导培养基中培养，培养条件为暗培养，培养温度25℃，湿度为60％，每35天继代一次，继代1次。体胚诱导培养基：MS+2mg/L 2ip+2mg/L 6-BA+1mg/L NAA+5mg/L Gln+10mg/L酸水解酪蛋白+3.5g/L植物凝胶+3.5g/L活性炭(200目)+30g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
4、不定芽诱导培养
将获得的成熟体胚转入到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，培养条件为光培养，光照强度为1000lx，前30天每日光照时间为3小时/天，30天后光照时间为9小时/天，培养温度为25℃，湿度为60％，每25天继代一次，继代2次。不定芽诱导培养基：MS+2mg/LNAA+10mg/L 6-BA+1mg/L GA3+3.5g/L植物凝胶+23g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
5、生根培养
将获得的不定芽以1株为单位进行分离，接种到生根培养基中，每个培养盒接种4个单位。培养条件为光培养，光照强度为1000lx，前30天光照时间为9小时/天，30天后光照时间为12.5小时/天，培养温度为25℃，湿度为85％，每22天继代一次，继代3次，得到组培苗。生根培养基：MS+6mg/L NAA+10mg/L DA-6+3.5g/L植物凝胶+23g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
6、试管苗培养
将生根后的组培苗(叶片数为1-3片；根长为1-3cm)转接到壮苗培养基中进行培养，每一株苗单独接种于一个试管或培养瓶中。培养条件为光培养，光照强度为1500lx，光照时间为12.5小时/天，培养温度为25℃，湿度为85％，每22天继代一次，继代3次，得到试管苗。壮苗培养基：MS+5mg/L NAA+10mg/L DA-6+3.5g/L植物凝胶+23g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
7、炼苗
将上述试管苗(叶片数为3-5片；根长为3-5cm)移栽到带有土壤的育苗袋中，在光照培养室中进行炼苗。培养条件为光培养，光照强度为1800lx，光照时间为12小时/天，培养温度为30℃，湿度为80％，炼苗35-40天后即可转移至室外荫棚(遮光度50％)中二次炼苗，炼苗70-90天后即可移栽至田间种植。
实施例三：以椰枣幼苗茎尖为外植体
1、外植体选择、消毒及接种
选择椰枣幼苗茎尖为外植体，首先采用市售漂渍液浸泡3次，每次浸泡8分钟，浸泡过程中需不停的搅拌，消毒后使用灭菌纯水清洗3-7遍，清洗过程中不停搅拌，直至最后一次清洗后水清澈，清洗后将样品放置于灭菌锡箔纸上，切割后备用。
2、愈伤组织诱导培养
将上述切割后的茎尖外植体接种于愈伤组织诱导培养基中培养，培养条件为暗培养，培养温度25℃，湿度为60％，每35天继代一次，继代3次。愈伤组织诱导培养基：WPM+5mg/L 2,4-D+45mg/L picloram+20mg/L NAA+10mg/L6-BA+10mg/L硫酸腺嘌呤+4g/L植物凝胶+4g/L活性炭(200目)+32g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.8。
3、体胚诱导培养
将得到的愈伤组织接种于体胚诱导培养基中培养，培养条件为暗培养，培养温度25℃，湿度为60％，每40天继代一次，继代1次。体胚诱导培养基：WPM+0.2mg/L 2ip+5mg/L6-BA+5mg/L NAA+50mg/L Gln+100mg/L酸水解酪蛋白+4g/L植物凝胶+32g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.8。
4、不定芽诱导培养
将获得的成熟体胚转入到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，培养条件为光培养，光照强度为1000lx，前30天每日光照时间为4小时/天，30天后光照时间为8小时/天，培养温度为25℃，湿度为60％，每40天继代一次，继代2次。不定芽诱导培养基：WPM+2mg/L NAA+10mg/L 6-BA+10mg/L GA3+4g/L植物凝胶+25g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.8。
5、生根培养
将获得的不定芽以1株为单位进行分离，接种到生根培养基中，每个培养盒接种4个单位。培养条件为光培养，光照强度为1000lx，前30天光照时间为10小时/天，30天后光照时间为13小时/天，培养温度为30℃，湿度为85％，每25天继代一次，继代3次，得到组培苗。生根培养基：WPM+5mg/L NAA+50mg/L DA-6+4g/L植物凝胶+25g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.8。
6、试管苗培养
将生根后的组培苗(叶片数为1-3片；根长为1-3cm)转接到壮苗培养基中进行培养，每一株苗单独接种于一个试管或培养瓶中。培养条件为光培养，光照强度为1500lx，光照时间为13小时/天，培养温度为30℃，湿度为85％，每20天继代一次，继代3次，得到试管苗。壮苗培养基：WPM+5mg/L NAA+10mg/L DA-6+4g/L植物凝胶+25g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.8。
7、炼苗
将上述试管苗(叶片数为3-5片；根长为3-5cm)移栽到带有土壤的育苗袋中，在光照培养室中进行炼苗。培养条件为光培养，光照强度为1800lx，光照时间为13小时/天，培养温度为30℃，湿度为80％，炼苗45天后即可转移至室外荫棚(遮光度40％)中二次炼苗，炼苗60天后即可移栽至田间种植。
实施例四：以椰枣幼苗嫩叶为外植体
1、外植体选择、消毒及接种
选择椰枣种幼苗嫩叶为外植体，首先采用市售漂渍液浸泡4次，每次浸泡10分钟，浸泡过程中需不停的搅拌，消毒后使用灭菌纯水清洗7遍，清洗过程中不停搅拌，直至最后一次清洗后水清澈，清洗后将样品放置于灭菌锡箔纸上，切割后备用。
2、愈伤组织诱导培养
将上述切割后的嫩叶外植体接种于愈伤组织诱导培养基中培养，培养条件为暗培养，培养温度25℃，湿度为60％，每25天继代一次，继代5次。愈伤组织诱导培养基：Y3+70mg/L 2,4-D+30mg/L picloram+50mg/L NAA+10mg/L 6-BA+50mg/L硫酸腺嘌呤+4.5g/L植物凝胶+4.5g/L活性炭(200目)+35g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.85。
3、体胚诱导培养
将得到的愈伤组织接种于体胚诱导培养基中培养，培养条件为暗培养，培养温度为25℃，湿度为60％，每30天继代一次，继代2次。体胚诱导培养基：Y3+2mg/L 2ip+5mg/L 6-BA+5mg/L NAA+80mg/L Gln+180mg/L酸水解酪蛋白+4.5g/L植物凝胶+35g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.85。
4、不定芽诱导培养
将获得的成熟体胚转入到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，培养条件为光培养，光照强度为2100lx，前30天每日光照时间为4小时/天，30天后光照时间为14小时/天，培养温度为30℃，湿度为85％，每30天继代一次，继代3次。不定芽诱导培养基：Y3+2mg/LNAA+10mg/L 6-BA+10mg/L GA3+4.5g/L植物凝胶+30g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.85。
5、生根培养
将获得的不定芽以1株为单位进行分离，接种到生根培养基中，每个培养盒接种9个单位。培养条件为光培养，光照强度2100lx，前30天光照时间为8小时/天，30天后光照时间为14小时/天，培养温度为30℃，湿度为85％，每15天继代一次，继代5次，得到组培苗。生根培养基：Y3+5mg/L NAA+100mg/L DA-6+4.5g/L植物凝胶+30g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.85。
6、试管苗培养
将生根后的组培苗(叶片数为1-3片；根长为1-3cm)转接到壮苗培养基中进行培养，每一株苗单独接种于一个试管或培养瓶中。培养条件为光培养，光照强度为2100lx，光照时间为14小时/天，培养温度为30℃，湿度为85％，每15天继代一次，继代5次，得到试管苗。壮苗培养基：Y3+5mg/L NAA+100mg/L DA-6+4.5g/L植物凝胶+30g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.85。
7、炼苗
将上述试管苗(叶片数为3-5片；根长为3-5cm)移栽到带有土壤的育苗袋中，在光照培养室中进行炼苗。培养条件为光培养，光照强度为2300lx，光照时间为14小时/天，培养温度为30℃，湿度为80％，炼苗50天后即可转移至室外荫棚(遮光度30％)中二次炼苗，炼苗60天后即可移栽至田间种植。
对照例一：以椰枣无菌苗主根为外植体
1、外植体选择、消毒及接种
选取椰枣无菌苗主根为外植体，无需再次消毒，在超净工作台上进行操作，直接将种子播种后30d左右(每个培养盒接种6-25个外植体，全黑暗培养)获得的无菌苗放在已灭菌的锡箔纸上进行切割处理，其中将没有长出不定根的主根剪成0.4-1cm。
2、愈伤组织诱导培养
将上述切割后的主根外植体接种于愈伤组织诱导培养基中培养，培养条件为暗培养，培养温度25℃，湿度为60％，每60天继代一次，继代1次。愈伤组织诱导培养基：MS+40mg/L 2,4-D+40mg/L picloram+0.15mg/L NAA+0.2mg/L6-BA+3.5g/L植物凝胶+5mg/L硫酸腺嘌呤+3.5g/L活性炭(200目)+30g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
3、体胚诱导培养
将得到的愈伤组织接种于体胚诱导培养基中培养，培养条件为暗培养，培养温度25℃，湿度为60％，每35天继代一次，继代1次。体胚诱导培养基：MS+2mg/L 2ip+2mg/L 6-BA+1mg/L NAA+5mg/L Gln+10mg/L酸水解酪蛋白+3.5g/L植物凝胶+3.5g/L活性炭(200目)+30g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
4、不定芽诱导培养
将获得的成熟体胚转入到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，培养条件为光培养，光照强度为1000lx，前30天每日光照时间为3小时/天，30天后光照时间为9小时/天，培养温度为25℃，湿度为60％，每25天继代一次，继代2次。不定芽诱导培养基：MS+2mg/LNAA+10mg/L 6-BA+1mg/L GA3+3.5g/L植物凝胶+23g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
5、生根培养
将获得的不定芽以1株为单位进行分离，接种到生根培养基中，每个培养盒接种4个单位。培养条件为光培养，光照强度为1000lx，前30天光照时间为9小时/天，30天后光照时间为12.5小时/天，培养温度为25℃，湿度为85％，每22天继代一次，继代3次，得到组培苗。生根培养基：MS+6mg/L NAA+3.5g/L植物凝胶+23g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
6、试管苗培养
将生根后的组培苗(叶片数为1-3片；根长为1-3cm)转接到壮苗培养基中进行培养，每一株苗单独接种于一个试管或培养瓶中。培养条件为光培养，光照强度为1500lx，光照时间为12.5小时/天，培养温度为25℃，湿度为85％，每22天继代一次，继代3次，得到试管苗。壮苗培养基：MS+5mg/L NAA+3.5g/L植物凝胶+23g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
7、炼苗
将上述试管苗(叶片数为3-5片；根长为3-5cm)移栽到带有土壤的育苗袋中，在光照培养室中进行炼苗。培养条件为光培养，光照强度为1800lx，光照时间为12小时/天，培养温度为30℃，湿度为80％，炼苗35-40天后即可转移至室外荫棚(遮光度50％)中二次炼苗，炼苗70-90天后即可移栽至田间种植。
对照例二：以椰枣无菌苗胚轴为外植体
1、外植体选择、消毒及接种
选取椰枣无菌苗胚轴为外植体，无需再次消毒，在超净工作台上进行操作，直接将种子播种后30d左右(每个培养盒接种6-25个外植体，全黑暗培养)获得的无菌苗放在已灭菌的锡箔纸上进行切割处理,其中将无菌苗的胚轴剪成0.4-1cm。
2、愈伤组织诱导培养
将上述切割后的胚轴外植体接种于愈伤组织诱导培养基中培养，培养条件为暗培养，培养温度25℃，湿度为60％，每60天继代一次，继代1次。愈伤组织诱导培养基：MS+40mg/L 2,4-D+40mg/L picloram+0.15mg/L NAA+0.2mg/L 6-BA+3.5g/L植物凝胶+5mg/L硫酸腺嘌呤+3.5g/L活性炭(200目)+30g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
3、体胚诱导培养
将得到的愈伤组织接种于体胚诱导培养基中培养，培养条件为暗培养，培养温度25℃，湿度为60％，每35天继代一次，继代1次。体胚诱导培养基：MS+2mg/L 2ip+2mg/L 6-BA+1mg/L NAA+5mg/L Gln+10mg/L酸水解酪蛋白+3.5g/L植物凝胶+3.5g/L活性炭(200目)+30g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
4、不定芽诱导培养
将获得的成熟体胚转入到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，培养条件为光培养，光照强度为1000lx，前30天每日光照时间为3小时/天，30天后光照时间为9小时/天，培养温度为25℃，湿度为60％，每25天继代一次，继代2次。不定芽诱导培养基：MS+2mg/LNAA+10mg/L 6-BA+1mg/L GA3+3.5g/L植物凝胶+23g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
5、生根培养
将获得的不定芽以1株为单位进行分离，接种到生根培养基中，每个培养盒接种4个单位。培养条件为光培养，光照强度为1000lx，前30天光照时间为9小时/天，30天后光照时间为12.5小时/天，培养温度为25℃，湿度为85％，每22天继代一次，继代3次，得到组培苗。生根培养基：MS+6mg/L NAA+3.5g/L植物凝胶+23g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
6、试管苗培养
将生根后的组培苗(叶片数为1-3片；根长为1-3cm)转接到壮苗培养基中进行培养，每一株苗单独接种于一个试管或培养瓶中。培养条件为光培养，光照强度为1500lx，光照时间为12.5小时/天，培养温度为25℃，湿度为85％，每22天继代一次，继代3次，得到试管苗。壮苗培养基：MS+5mg/L NAA+3.5g/L植物凝胶+23g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.75。
7、炼苗
将上述试管苗(叶片数为3-5片；根长为3-5cm)移栽到带有土壤的育苗袋中，在光照培养室中进行炼苗。培养条件为光培养，光照强度为1800lx，光照时间为12小时/天，培养温度为30℃，湿度为80％，炼苗35-40天后即可转移至室外荫棚(遮光度50％)中二次炼苗，炼苗70-90天后即可移栽至田间种植。
二、椰枣组织培养效果鉴定
1.愈伤组织诱导效果鉴定：
为考察椰枣愈伤组织的诱导情况，对上述实施例以及对照例中外植体的接种数、愈伤组织的诱导数进行观测与统计，计算诱导率。结果见表1。
表1椰枣愈伤组织诱导情况
项目 外植体 接种数(个) 愈伤组织数(块) 诱导率(％)
实施例一 种子合子胚 3000 2604 86.8
实施例二 无菌苗根尖 3000 2445 81.5
实施例三 幼苗茎尖 3000 2505 83.5
实施例四 幼苗嫩叶 3000 2385 79.5
对照例一 无菌苗主根 3000 1356 45.2
对照例二 无菌苗胚轴 3000 1053 35.1
2.体胚诱导培养鉴定：
为考察体胚诱导效果，对上述实施例以及对照例的体胚发生情况进行观察，统计接种数、体胚数，计算体胚诱导率，结果见表2。
表2椰枣体胚发生情况
项目 愈伤接种数(个) 体胚数(个) 诱导率(％)
实施例一 1000 619 61.9
实施例二 1000 495 49.5
实施例三 1000 425 42.5
实施例四 1000 368 36.8
对照例一 1000 231 23.1
对照例二 1000 209 20.9
3.体胚诱导培养鉴定：
为考察不定芽诱导效果，对上述实施例以及对照例的不定芽诱导情况进行观察，统计接种数、不定芽数，计算不定芽诱导率，结果见表3。
表3椰枣不定芽诱导情况
Figure BDA0002767403650000131
Figure BDA0002767403650000141
4.体胚诱导培养鉴定：
为考察椰枣组织培养的生根诱导效果，对上述实施例以及对照例的组培苗生根诱导情况进行观察，统计接种数、生根株数，计算生根诱导率，结果见表4。
表4椰枣组培苗生根诱导情况
项目 不定芽接种数(个) 生根数(个) 诱导率(％)
实施例一 100 91 91
实施例二 100 95 95
实施例三 100 93 93
实施例四 100 89 89
对照例一 100 70 70
对照例二 100 79 79
上述结果表明，本发明以椰枣种子合子胚、无菌苗根尖、幼苗茎尖和嫩叶等椰枣材料为外植体，通过体胚发生途径培育出完整的组培苗，无论是愈伤组织、体胚、不定芽生根等都具有较高的诱导率，可以结合椰枣性别鉴定技术规模化生产性状一致的椰枣种苗，适合工厂化育苗和规模化栽培，对椰枣产业发展具有重要意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种体胚发生途径的椰枣组织培养方法，其特征在于，其步骤如下：
1)、外植体选取
取椰枣材料为外植体，在超净工作台上进行切割操作；所述椰枣材料是种子合子胚、无菌苗根尖；
2)、愈伤组织诱导培养
将切割好的外植体接种于愈伤组织诱导培养基中培养，得到愈伤组织；培养条件为暗培养，培养温度20～30℃，湿度为55％～85％；所述愈伤组织诱导培养基为MS+40～70mg/L2,4-D+10～50mg/L picloram+0.15mg/L NAA+0.02～0.2mg/L 6-BA+1～5mg/L硫酸腺嘌呤+3～8g/L植物凝胶+3～9g/L活性炭+20～40g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.5～6.0；
3)、体胚诱导培养
将得到的愈伤组织接种于体胚诱导培养基中培养，得到成熟体胚；培养条件为暗培养，培养温度为20～30℃，湿度为55％～85％；所述体胚诱导培养基为MS+0.2～2mg/L 2ip+0.1～5mg/L 6-BA+0.2～5mg/L NAA+5mg/L Gln+10mg/L酸水解酪蛋白+3～8g/L植物凝胶+20～40g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.5～6.0；
4)、不定芽诱导培养
将获得的成熟体胚转入到不定芽诱导培养基中进行不定芽诱导培养，得到不定芽；培养条件为光培养，光照强度为1000～2100lx，前30天每日光照时间为2～4小时/天，30天后光照时间为8～14小时/天，培养温度为20～30℃，湿度为55％～85％；所述不定芽诱导培养基为MS+0.05～2mg/L NAA+0.2～10mg/L 6-BA+0.1～1.0mg/L GA3+3～8g/L植物凝胶+15～30g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.5～6.0；
5)、生根培养
将获得的不定芽接种到生根培养基中进行生根培养，得到组培苗；培养条件为光培养，光照强度为1000～2100lx，前30天光照时间为8～14小时/天，30天后光照时间为12～14小时/天，培养温度为20～30℃，湿度为55％～85％；所述生根培养基为MS+4～7mg/LNAA+0.1～10mg/L DA-6+3～8g/L植物凝胶+20～35g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.5～6.0；
6)、试管苗培养
待生根后的组培苗长至叶片数为1～3片、根长为1～3cm时转接到壮苗培养基中进行培养，得到试管苗；培养条件为光培养，光照强度为1500～2100lx，光照时间为12～14小时/天，培养温度为25～35℃，湿度为55％～85％；所述壮苗培养基为MS+5～10mg/L NAA+0.1～10mg/L DA-6+3～8g/L植物凝胶+20～35g/L蔗糖，灭菌前培养基pH为5.5～6.0；
7)、炼苗
待试管苗长至叶片数为3～5片、根长为3～5cm时移栽到带有土壤的育苗袋中，在日光温室或光照培养室中进行炼苗；培养条件为光培养，光照强度为1500～2500lx，光照时间为7～14小时/天，培养温度为25～35℃，湿度为60％～80％，炼苗30～50天后即可转移至遮光度为30～50％的室外荫棚中二次炼苗，炼苗30～90天后即可移栽至田间种植。
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