CN110604053A - 一种岗梅的离体培养快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

一种岗梅的离体培养快速繁殖方法，步骤如下：用Ca(NO₃)₂·4H₂O代替原MS培养基中的CaCl₂·2H₂O，再添加硫酸亚铁、蔗糖、琼脂，制备得到改良MS培养基，将岗梅外植体接种于添加6‑BA和IBA的改良MS培养基中诱导培养。取的岗梅不定芽接种于入以改良MS培养基为基础添加6‑BA、AD和NAA的丛芽增殖培养基中，再转至生根培养基中，以改良MS培养基为基础，先将其中的大量元素的剂量调整为原来的一半，再添加活性炭、NAA和IBA；最后岗梅幼苗室内炼苗移栽即得。组织培养技术在短期内大量提供岗梅的种苗，克服后代分离的问题，保障供应市场，提高种植和销售者的收入，促进岗梅的综合利用。

Description

一种岗梅的离体培养快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及植物组培快繁技术，具体是一种岗梅的离体培养快速繁殖方法。

背景技术

梅叶冬青(Ilex asprella)，也称岗梅，属冬青科冬青属，多以梅叶冬青根(岗梅根)、叶入药；其根性味苦、甘，性寒，归肺、肝、大肠经，无毒，能清热解毒，活血，生津，可治感冒、眩晕、头痛、咽喉肿痛、百日咳、淋病及跌打损伤等。叶性味苦、甘，性寒，归心、肺、肝经，清热解毒，可治感冒及跌打损伤等。叶还含熊果酸，对心绞痛及冠心病有治疗作用。岗梅为凉茶廿四味、感冒药的原料之一。目前岗梅的人工种植得到重视，但是生产上多以自然采摘的种子繁育，种苗参差不齐。随着生物技术的发展，特别是植物组织培养技术的日趋成熟，利用植物工厂生产花卉，果树等的种苗已经广泛应用，比如香蕉、番木瓜、蝴蝶兰、杨树、铁皮石斛等。近年来一些中药材等也已经成功建立了组织培养技术体系，有些品种开展了工厂化育苗，但是还没有工厂化生产岗梅的报道。组织培养技术能够在短期内大量提供岗梅的种苗，保证其种苗的一致性，保障种性的稳定。

目前植物组织培养快速繁殖在技术上非常成熟，只是生产成本的高低关系到应用范围。在植物快繁技术中无菌外植体的获得和增殖效率是关键。本发明通过对影响岗梅组织培养及快速繁殖的因素进行了相关探索，以期为岗梅的工厂化组培育苗提供技术方案，保障岗梅的市场供应，消毒时间的控制最为关键。消毒时间与材料的幼嫩，生理状态，表面是否有光滑等相关。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种岗梅的离体培养快速繁殖方法。

为了实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：

一种岗梅的离体培养快速繁殖方法，步骤如下：

(1)改良MS培养基的制备

根据如下配方制备改良MS培养基：用Ca(NO₃)₂·4H₂O代替原MS培养基中的CaCl₂·2H₂O、添加硫酸亚铁、添加蔗糖、添加琼脂，其他组分均无变化；其中Ca(NO₃)₂·4H₂O的浓度为90～100mg/L，硫酸亚铁的浓度为50～60mg/L，蔗糖的浓度为32～38g/L^-1、琼脂的浓度为5.0～6.0g/L^-1；

(2)外植体消毒和不定芽诱导培养

选取岗梅幼嫩的枝条作为外植体，去除叶片，清理表面灰尘；在超净工作台上，将洗净的枝条切成带有1-2个芽的茎段，将茎段置于70％酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗3次，每次1-3min；分别在消毒剂中浸泡7～9min，所述消毒剂为含有吐温的质量分数为0.1％的HgCl₂溶液，晃动烧杯，让材料充分接触消毒剂，最后将材料用无菌水洗涤3次，每次5min，得到消毒外植体备用，在配制含有吐温的质量分数为0.1％的HgCl₂溶液时，每一百毫升HgCl₂溶液中滴入一滴吐温，一滴的体积是0.05ml；消毒好的茎段切除与消毒剂有接触的两端，接种于诱导培养基中在15天后外植体上长出岗梅不定芽，统计污染率和萌芽率，诱导培养基的配方：以改良MS培养基为基础，添加0.8～1.2mg/L 6-BA和0.1～0.3mg/L IBA。

(3)丛芽增殖

取诱导培养得到的岗梅不定芽，接种于入含有不同激素种类及其浓度的丛芽增殖培养基，进行继代培养21天，比较不同激素种类及其浓度对岗梅丛芽增值的效果，丛芽增殖培养基的配方：以改良MS培养基为基础，添加1.8～2.2mg/L 6-BA、0.3～0.7mg/L AD和0.08～0.12 mg/LNAA；

(4)生根诱导

将岗梅丛芽切成带有1-2不定芽的茎段，然后将生物学底端插入生根培养基中，进行生根培养15-20天，生根培养基的配方：以改良MS培养基为基础，先将其中的大量元素的剂量调整为原来的一半，再添加0.3～0.7mg/L活性炭、0.3～0.7mg/L NAA和0.5～0.7mg/LIBA；

(5)岗梅的种植

当生根培养至岗梅幼苗生的根长至1-2cm左右、苗高3cm以上后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养7天，然后洗净根部培养基，浸泡0.1％多菌灵溶液10分钟，将组培苗种植装有泥炭土的营养杯中，保持叶面湿度；

步骤(2)～(4)中培养条件均为：温度28±2℃，光照度1900-2100Lx，光照时间10～15h/d；诱导培养基、丛芽增殖培养基和生根培养基的pH值均调至5.8±0.2，经121℃高压灭菌20min。

与现有技术相比较，本发明具备的有益效果：

岗梅的幼嫩茎段在0.1％HgCl₂处理5-11分钟能获得无菌材料，在这个时间内达到一个平衡，即杀死细菌和真菌但对植物本身没有伤害。在激素方面由于植物组织培养快速繁殖技术非常成熟，有较多文献可以参考。在生产上，研究者往往结合自己的经验设置简单的梯度获得适合的体系。本发明通过设置6-BA和AD的协同作用，促进丛芽的增殖，结合增殖系数和丛芽质量得到了适合岗梅的增殖体系。NAA和IBA是常用的生根诱导激素，NAA的价格要比IBA便宜，为了节省生产成本，NAA使用更为广泛，通过两者的配合使用得到岗梅的根在数量和质量完全能够满足生产上的需求。组织培养技术和栽培技术的结合，在短期内大量提供岗梅的种苗，克服后代分离的问题，保障供应市场，提高种植和销售者的收入，促进岗梅的综合利用。

附图说明

图1为岗梅的诱导培养。

图2为岗梅的增殖。

图3为岗梅的生根诱导。

图4为岗梅的炼苗。

图5为岗梅的移栽。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步阐述。

实施例1

1材料与方法

1.1材料

2018年春季在广州生长健壮的岗梅成苗，培养在广东省农业科学院作物研究所作物遗传改良重点实验室。

1.2培养基与培养条件

本实施例所述文献1为化学工业出版社出版的邱运亮、段鹏慧主编的《植物组培快繁技术》。本实施例中所述原MS培养基的配方参考文献1的第22页表2-1MS培养基(Murashige 和Skoog，1962)；本实施例中所述原MS培养基的配制参考文献1的第27页第七节——培养基的配制。

改良MS培养基的配方：用Ca(NO₃)₂·4H₂O代替原MS培养基中的CaCl₂·2H₂O、添加硫酸亚铁、添加蔗糖、添加琼脂，其他组分均无变化；其中Ca(NO₃)₂·4H₂O的浓度为95mg/L，硫酸亚铁的浓度为55.7mg/L，蔗糖的浓度为30g/L^-1、琼脂的浓度为5.5g/L^-1。

诱导培养基的配方：以改良MS培养基为基础，添加6-BA和IBA。

丛芽增殖培养基的配方：以改良MS培养基为基础，添加6-BA、AD和NAA。

生根培养基的配方：以改良MS培养基为基础，将其中的大量元素的剂量调整为原来的一半，再添加活性炭、NAA和IBA。所述改良MS培养基中的大量元素为硝酸钾、硝酸铵、七水合硫酸镁、磷酸二氢钾和二水合氯化钙(参见文献1第28页表2-17MS培养基母液的配制)。

诱导培养基、丛芽增殖培养基和生根培养基的pH值均调至5.8±0.2，经121℃高压灭菌 20min。

培养条件：温度25±3℃，湿度为65-80％，光照度800lx，光照时间10h/d。

1.3外植体消毒

选取岗梅幼嫩的枝条作为外植体，去除叶片，清理表面灰尘。在超净工作台上，将洗净的枝条切成带有1-2个芽的茎段，将茎段置于70％酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗3次，每次1-3min；分别在消毒剂中浸泡5、7、9、11min，如表1，所述消毒剂为含有吐温的质量分数为0.1％的HgCl₂溶液，晃动烧杯，让材料充分接触消毒剂，最后将材料用无菌水洗涤3次，每次5min，得到消毒外植体备用。

在配制含有吐温的质量分数为0.1％的HgCl₂溶液时，每一百毫升HgCl₂溶液中滴入一滴吐温，一滴的体积是0.05ml。

表1外植体消毒时间

1.4诱导培养试验方法

按照表2中每个编号对应的成分和剂量制备9种培养基。消毒好的茎段切除与消毒剂有接触的两端，接种于诱导培养基中，每个编号对应的培养基中处理15个茎段。在15天后外植体上长出岗梅不定芽，统计污染率和萌芽率。

表2不定芽诱导激素表

1.5丛芽增殖试验方法

取诱导培养得到的岗梅不定芽，接种于入含有不同激素种类及其浓度的丛芽增殖培养基，丛芽增殖培养基中激素的种类和浓度如表3所示，进行继代培养21天，比较不同激素种类及其浓度对岗梅丛芽增值的效果，统计20个芽的增殖情况。

表3不定芽诱导激素表

1.6生根诱导试验方法

将岗梅丛芽切成带有1-2不定芽的茎段，然后将生物学底端插入生根培养基中。生根培养基中激素种类及其浓度如表4。进行生根培养15-20天，统计20株再生植株根的数量和长度。

表4根诱导激素表

1.7岗梅的种植

当岗梅幼苗生的根长至1-2cm左右、苗高3cm以上后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养7天，然后洗净根部培养基，浸泡0.1％多菌灵溶液10分钟，将组培种植装有泥炭土的营养杯中，保持叶面湿度。

2结果与分析

2.1外植体消毒试验结果与分析

按消毒方法对岗梅外植体进行消毒，作4种不同时间的处理，对其污染率、萌芽率、死亡率和成功率进行统计，结果如表5。

岗梅外植体污染主要为真菌污染，可能是腋芽内部存在真菌而没有被消毒彻底。外植体的污染率与消毒处理时间的长短负相关，随着处理时间的延长，消毒剂对外植体的伤害增加，污染率逐渐下降，消毒11分钟的污染率比消毒5分钟的降低了53.33％，而外植体的萌芽率也逐渐降低，在消毒11分钟时，萌芽率仅为20％，比处理7分钟的要低66.67％；外植体的死亡率不断上升，处理4的死亡率最高，高达60.00％，而处理1仅为13.33％。处理1-4均能得少量的无菌外植体，通过结合萌芽率和污染率等综合因素分析，消毒处理7-9分钟较为合适开展岗梅外植体的消毒。

经过消毒处理后的外植体在诱导培养基上，14-21d腋芽开始萌动(图1)。

表5不同方法对外植体消毒的效果

2.2诱导培养试验结果与分析

岗梅茎段外植体在各个诱导培养基上15d后，腋芽逐渐开始恢复、出现萌动，对于各个编号培养基中岗梅不定芽诱导的萌芽率和成功率的统计如表6所示，从表6可以看出，编号为2的培养基中，萌芽率和成功率都高于其他各组，第1、4、7组中，没有添加IBA，萌芽率较低，而第3、6、9组中，添加了较高浓度的IBA萌芽率也相较于第2、5、8组的萌芽率要低，所以IBA在不定芽诱导过程中，不可或缺，但是浓度也不能太高，因此，推荐IBA的浓度为0.2mg/L左右比较合适。6-BA的浓度对成功率的影响较大，综合分析后，编号为2的激素及其浓度水平获得的综合效果最优，即为以改良MS培养基为基础，添加6-BA1.0 mg/L 和IBA0.2mg/L。

表6不同激素及其浓度对走马胎不定芽诱导的影响

2.3丛芽增殖试验结果与分析

从表7可以看出：6-BA浓度在1-3mg/L内均能诱导不定芽的增殖，增殖效率和浓度正相关。随着浓度的升高，不定芽的增殖效率增，在6-BA浓度3mg/L时增殖系数达到5。但是仅用6-BA诱导芽过密集，节间短，苗较弱，不便于进行第二次增殖操作。在培养基中加入0.5-1mg/L的KT均能促进苗的均匀，缓解6-BA浓度过高导致丛生芽的矮小，并且增殖系数为4左右，和原来增殖系数相当，但改善了苗的均匀性。从节约生产成本的角度考虑， AD的浓度建议为0.5mg/L。综合分析后，推荐丛芽增殖培养基的配方为：以改良MS培养基为基础，添加6-BA 2.0mg/L、AD 0.5mg/L和0.1NAAmg/L。

丛生芽通过不断继代增殖培养，在短期内可以得到大量的无菌苗(图2)。

表7不同激素和浓度对不定芽增殖的效果

2.4生根培养试验结果与分析

将带芽的茎段接入生根培养基，培养50d，统计生根率、根长和根质量。

表8中的结果表明：IBA和NAA都能诱导岗梅的生根，单独使用NAA，得到的根相对较细，在移栽过程中容易断，在1mg/L处理下根的数量在3条左右，要比0.5mg/L的处理多。添加IBA能显著提高根直径，得到较为粗壮，完全能够满足后期的移栽，保证成活率(图3)。综合分析后，推荐生根培养基的配方为：以改良MS培养基为基础，先将其中的大量元素的剂量调整为原来的一半，再添加活性炭0.5mg/L、NAA 0.5mg/L和IBA 0.5mg/L。

表8不同激素对岗梅根诱导的效果

2.5炼苗及移栽

生根诱导培养50d左右，岗梅幼苗的根一般达到长1cm，株高4cm左右。在开盖炼苗期间，生长变慢，叶片变厚。在移栽5-7天后，植株叶片转绿，有新根长出，成活率在95％以上(图4)，

2.6结论

通过2.1～2.5的单因素试验及其结果分析，得到如下关键控制参数：

在消毒剂中的浸泡时间优选为7～9min。

诱导培养基的配方：以改良MS培养基为基础，添加6-BA1.0 mg/L和IBA0.2 mg/L。

丛芽增殖培养基的配方：以改良MS培养基为基础，添加6-BA 2.0mg/L、AD 0.5mg/L和0.1NAAmg/L。

生根培养基的配方：以改良MS培养基为基础，先将其中的大量元素的剂量调整为原来的一半，再添加活性炭0.5mg/L、NAA 0.5mg/L和IBA0.5mg/L。

实施例2

一种岗梅的离体培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤如下：

(1)改良MS培养基的制备

根据如下改良MS培养基的配方制备改良MS培养基：用Ca(NO₃)₂·4H₂O代替原MS 培养基中的CaCl₂·2H₂O、添加硫酸亚铁、添加蔗糖、添加琼脂，其他组分均无变化；其中 Ca(NO₃)₂·4H₂O的浓度为100mg/L，硫酸亚铁的浓度为60mg/L，蔗糖的浓度为32g/L^-1、琼脂的浓度为6.0g/L^-1；

(2)外植体消毒和不定芽诱导培养

选取岗梅幼嫩的枝条作为外植体，去除叶片，清理表面灰尘；在超净工作台上，将洗净的枝条切成带有1-2个芽的茎段，将茎段置于70％酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗3次，每次1-3min；分别在消毒剂中浸泡7min，所述消毒剂为含有吐温的质量分数为0.1％的HgCl₂溶液，晃动烧杯，让材料充分接触消毒剂，最后将材料用无菌水洗涤3次，每次5min，得到消毒外植体备用，在配制含有吐温的质量分数为0.1％的HgCl₂溶液时，每一百毫升HgCl₂溶液中滴入一滴吐温，一滴的体积是0.05ml；消毒好的茎段切除与消毒剂有接触的两端，接种于诱导培养基中在15天后外植体上长出岗梅不定芽，统计污染率和萌芽率，诱导培养基的配方：以改良MS培养基为基础，添加1.2mg/L 6-BA和0.3mg/L IBA。

(3)丛芽增殖

取诱导培养得到的岗梅不定芽，接种于入含有不同激素种类及其浓度的丛芽增殖培养基，进行继代培养21天，比较不同激素种类及其浓度对岗梅丛芽增值的效果，丛芽增殖培养基的配方：以改良MS培养基为基础，添加2.2mg/L 6-BA、0.7mg/L AD和0.12mg/LNAA；

(4)生根诱导

将岗梅丛芽切成带有1-2不定芽的茎段，然后将生物学底端插入生根培养基中，进行生根培养15-20天，生根培养基的配方：以改良MS培养基为基础，先将其中的大量元素的剂量调整为原来的一半，再添加0.7mg/L活性炭、0.7mg/L NAA和0.7mg/L IBA；

(5)岗梅的种植

当生根培养至岗梅幼苗生的根长至1-2cm左右、苗高3cm以上后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养7天，然后洗净根部培养基，浸泡0.1％多菌灵溶液10分钟，将组培种植装有泥炭土的营养杯中，保持叶面湿度；

步骤(2)～(4)中培养条件均为：温度26℃，光照度1900Lx，光照时间10h/d；诱导培养基、丛芽增殖培养基和生根培养基的pH值均调至5.6，经121℃高压灭菌20min。

实施例3

一种岗梅的离体培养快速繁殖方法，步骤如下：

(1)改良MS培养基的制备

根据如下改良MS培养基的配方制备改良MS培养基：用Ca(NO₃)₂·4H₂O代替原MS 培养基中的CaCl₂·2H₂O、添加硫酸亚铁、添加蔗糖、添加琼脂，其他组分均无变化；其中 Ca(NO₃)₂·4H₂O的浓度为90mg/L，硫酸亚铁的浓度为50mg/L，蔗糖的浓度为38g/L^-1、琼脂的浓度为5.0g/L^-1；

(2)外植体消毒和不定芽诱导培养

选取岗梅幼嫩的枝条作为外植体，去除叶片，清理表面灰尘；在超净工作台上，将洗净的枝条切成带有1-2个芽的茎段，将茎段置于70％酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗3次，每次1-3min；分别在消毒剂中浸泡9min，所述消毒剂为含有吐温的质量分数为0.1％的HgCl₂溶液，晃动烧杯，让材料充分接触消毒剂，最后将材料用无菌水洗涤3次，每次5min，得到消毒外植体备用，在配制含有吐温的质量分数为0.1％的HgCl₂溶液时，每一百毫升HgCl₂溶液中滴入一滴吐温，一滴的体积是0.05ml；消毒好的茎段切除与消毒剂有接触的两端，接种于诱导培养基中在15天后外植体上长出岗梅不定芽，统计污染率和萌芽率，诱导培养基的配方：以改良MS培养基为基础，添加1.2mg/L 6-BA和0.3mg/L IBA。

(3)丛芽增殖

取诱导培养得到的岗梅不定芽，接种于入含有不同激素种类及其浓度的丛芽增殖培养基，进行继代培养21天，比较不同激素种类及其浓度对岗梅丛芽增值的效果，丛芽增殖培养基的配方：以改良MS培养基为基础，添加2.2mg/L 6-BA、0.7mg/L AD和0.12mg/LNAA；

(4)生根诱导

将岗梅丛芽切成带有1-2不定芽的茎段，然后将生物学底端插入生根培养基中，进行生根培养15-20天，生根培养基的配方：以改良MS培养基为基础，先将其中的大量元素的剂量调整为原来的一半，再添加0.7mg/L活性炭、0.7mg/L NAA和0.7mg/L IBA；

(5)岗梅的种植

当生根培养至岗梅幼苗生的根长至1-2cm左右、苗高3cm以上后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养7天，然后洗净根部培养基，浸泡0.1％多菌灵溶液10分钟，将组培种植装有泥炭土的营养杯中，保持叶面湿度；

步骤(2)～(4)中培养条件均为：温度30℃，光照度2100Lx，光照时间15h/d；诱导培养基、丛芽增殖培养基和生根培养基的pH值均调至6.0，经121℃高压灭菌20min。

Claims (1)

1.一种岗梅的离体培养快速繁殖方法，其特征在于，步骤如下：

(1)改良MS培养基的制备

根据如下配方制备改良MS培养基：用Ca(NO₃)₂·4H₂O代替原MS培养基中的CaCl₂·2H₂O、添加硫酸亚铁、添加蔗糖、添加琼脂，其他组分均无变化；其中Ca(NO₃)₂·4H₂O的浓度为90～100mg/L，硫酸亚铁的浓度为50～60mg/L，蔗糖的浓度为32～38g/L^-1、琼脂的浓度为5.0～6.0g/L^-1；

(2)外植体消毒和不定芽诱导培养

选取岗梅幼嫩的枝条作为外植体，去除叶片，清理表面灰尘；在超净工作台上，将洗净的枝条切成带有1-2个芽的茎段，将茎段置于70％酒精中浸泡30s，用无菌水冲洗3次，每次1-3min；分别在消毒剂中浸泡7～9min，所述消毒剂为含有吐温的质量分数为0.1％的HgCl₂溶液，晃动烧杯，让材料充分接触消毒剂，最后将材料用无菌水洗涤3次，每次5min，得到消毒外植体备用，在配制含有吐温的质量分数为0.1％的HgCl₂溶液时，每一百毫升HgCl₂溶液中滴入一滴吐温，一滴的体积是0.05ml；消毒好的茎段切除与消毒剂有接触的两端，接种于诱导培养基中在15天后外植体上长出岗梅不定芽，统计污染率和萌芽率，诱导培养基的配方：以改良MS培养基为基础，添加0.8～1.2mg/L 6-BA和0.1～0.3mg/L IBA。

(3)丛芽增殖

取诱导培养得到的岗梅不定芽，接种于入含有不同激素种类及其浓度的丛芽增殖培养基，进行继代培养21天，比较不同激素种类及其浓度对岗梅丛芽增值的效果，丛芽增殖培养基的配方：以改良MS培养基为基础，添加1.8～2.2mg/L 6-BA、0.3～0.7mg/L AD和0.08～0.12mg/LNAA；

(4)生根诱导

将岗梅丛芽切成带有1-2不定芽的茎段，然后将生物学底端插入生根培养基中，进行生根培养15-20天，生根培养基的配方：以改良MS培养基为基础，先将其中的大量元素的剂量调整为原来的一半，再添加0.3～0.7mg/L活性炭、0.3～0.7mg/L NAA和0.5～0.7mg/L IBA；

(5)岗梅的种植

当生根培养至岗梅幼苗生的根长至1-2cm左右、苗高3cm以上后，将培养瓶瓶盖打开，室内炼苗培养7天，然后洗净根部培养基，浸泡0.1％多菌灵溶液10分钟，将组培苗种植装有泥炭土的营养杯中，保持叶面湿度；

步骤(2)～(4)中培养条件均为：温度28±2℃，光照度1900-2100Lx，光照时间10～15h/d；诱导培养基、丛芽增殖培养基和生根培养基的pH值均调至5.8±0.2，经121℃高压灭菌20min。