CN111869569A

CN111869569A - 用于金姜花离体培养的培养体系及其应用

Info

Publication number: CN111869569A
Application number: CN202010834330.6A
Authority: CN
Inventors: 李永泉; 胡秀; 谭嘉川
Original assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Current assignee: Zhongkai University of Agriculture and Engineering
Priority date: 2020-08-18
Filing date: 2020-08-18
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2040-08-18
Also published as: CN111869569B

Abstract

本发明公开了用于金姜花离体培养的培养体系及其应用，属于植物组织培养技术领域；所述培养体系包括小根茎诱导培养基，所述小根茎诱导培养基为含有1.0～3.0mg/L的BA、0.5～1.5mg/L的NAA、0.1～0.5mg/L的TDZ、25～30g蔗糖以及7～8g/L琼脂的无菌MS培养基；本发明通过在移栽的前一阶段诱导丛芽的基部膨大、增殖为小根茎(将无菌苗诱导为小根茎)，增加了无菌苗的营养和水分储备能力，增强了无菌苗适应性，从而提高移栽的成活率；本发明获得的无菌苗对育苗基质和空气湿度具有较强的适应能力，移栽成活率较常规无菌苗高5～10％，移栽4周后成活率可达96～100％。

Description

用于金姜花离体培养的培养体系及其应用

技术领域

本发明属于植物组织培养技术领域，涉及一种姜花离体培养的培养体系，具体涉及用于金姜花离体培养的培养体系及其应用。

背景技术

金姜花(学名：Hedychium‘Woodlanders’)为姜科姜花属多年生草本植物，是我国于上世纪90年代从国外引进的姜花属园林栽培品种。因其黄色橙黄，茎秆直立、花期长，在国内成为除本土传统栽培品种—白姜花以外最受欢迎的品种。另外，金姜花的花朵、根、茎和果实均有其特别的功效：花朵中可以提取出某些成分用作香精的调和中，芳香迷人；根茎果实等都能够入药，有温中健胃、解表、祛风散寒、温经止痛、散寒等功效。

金姜花很少结种，主要靠分株繁殖，但分蘖系数非常低，繁殖速度较慢，且易感染病毒，导致产量和品质降低，远远不能满足市场化的需要。

植物的离体培养具有成本低、速度快的特点，目前国内已经在姜科植物的多种植物中成功的建立了离体繁殖体系。姜科植物的离体繁殖主要以丛芽的方式进行，少数研究通过诱导出愈伤组织进而再生出植株。姜科植物离体无菌苗的根系诱导不是特别困难，获得完整的无菌植株技术比较成熟。然而，由于姜科植物的叶片较其他植物类群长而大，水分蒸腾作用很强，无菌苗从瓶内生长向瓶外移栽的阶段却存在着移栽成活率低的问题。在这一阶段往往需要非常精细化的土壤和空气湿度管理，对移栽的基质、温度、空气湿度和光照强度进行优化，技术难度大、所需成本高。

发明内容

针对上述问题，本发明的目的是提供一种可有效提高金姜花移栽成活率的方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：用于金姜花离体培养的培养体系，所述培养体系包括小根茎诱导培养基，所述小根茎诱导培养基为含有1.0～3.0mg/L的BA、0.5～1.5mg/L的NAA、0.1～0.5mg/L的TDZ、25～30g蔗糖以及7～8g/L琼脂的无菌MS培养基。

所述小根茎诱导培养基能够诱导丛芽基部膨大为小根茎(小根茎的定义：基部直径增大至3毫米以上、顶部叶片不多于3片。)，增加无菌苗的营养和水分储备能力，使无菌苗对育苗基质和空气湿度具有较广的适应范围，从而提高移栽成活率。影响离体小根茎诱导的因素在类群之间具有较大差异，通常认为与蔗糖、光照强度、材料的状态有关。在同属姜科的生姜和姜黄植物中，可通过提高蔗糖浓度诱导出离体小根茎。在姜花属中，尚无离体小根茎诱导的研究。另外，我们在预实验中通过提高蔗糖的浓度，并不能有效诱导离体小根茎。

本发明通过对接种培养基中的激素浓度和配比进行优化，从而有效诱导出小根茎，以提高金姜花无菌苗的移栽成活率。

作为本发明的优选实施方式，所述培养体系还包括丛芽诱导培养基、丛芽增殖培养基和生根培养基。

更优选地，所述丛芽诱导培养基为含有2.0～4.0mg/L的BA、0.05～0.1mg/L的NAA、0.1～0.2mg/L的TDZ、25～30g蔗糖以及7～8g/L琼脂的无菌MS培养基；所述丛芽增殖培养基为含有2.0～4.0mg/L BA、0.01～0.02mg/L的NAA、0.01～0.02mg/L的TDZ、25～30g蔗糖以及7～8g/L琼脂的无菌MS培养基；所述生根培养基为含有2.0mg/L的BA、1.0～2.0mg/L的NAA、25～30g蔗糖以及7～8g/L琼脂的无菌MS培养基。

在上述激素成分配比下，能够有效诱导、促进愈伤组织发芽、生根，植株相对更健壮，后续移栽成功率较高。

作为本发明的优选实施方式，所述培养体系还包括移栽育苗基质。

更优选地，所述移栽育苗基质为含有泥炭、园土、珍珠岩的育苗基质，按质量比，所述泥炭：园土：珍珠岩＝1：3：1。

所述育苗基质可以使土壤既保持较好的透气性，满足金姜花常规无菌苗移栽的需要。

本发明还要求保护所述培养体系在金姜花离体培养中的用途。

本发明还提供了一种金姜花离体培养方法，包括以下步骤：

1)挑选健壮、污染少的新鲜根茎为外植体，并在无菌条件下，对所述外植体进行消毒；

2)用消毒好的镊子和刀片剖去包裹在嫩茎上的叶鞘，把嫩茎切为带一个芽的薄片，接种到丛芽诱导培养基中，诱导出丛芽；

3)将步骤2)获得的丛生芽以1～2个为单位进行切分，转接至丛芽增殖培养基中使丛芽增殖；

4)将步骤3)获得的丛生芽以1～2个为单位进行切分，转接至所述小根茎诱导培养基，诱导丛芽基部膨大为小根茎并增殖；

5)将步骤4)获得的小根茎转入生根培养基，诱导生根，获得带3～4片叶、基部膨大、根系发达的完整植株。

所述方法简单、方便，可快速、有效获得足够数量的金姜花无菌苗，所述无菌苗对环境的适应性更佳，移植存活率更高。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤1)中的消毒方法为：于超净工作台上用75％酒精溶液消毒30～60秒，再用0.1％升汞溶液浸泡10～15分钟，无菌水冲洗6次。

通过上述方法进行消毒，能有效降低后续培养中的污染率。

作为本发明的优选实施方式，所述步骤2)的丛芽诱导培养基为含有2.0～4.0mg/L的BA、0.05～0.1mg/L的NAA、0.1～0.2mg/L的TDZ、25～30g蔗糖以及7～8g/L琼脂的无菌MS培养基；

所述步骤3)的丛芽增殖培养基为含有2.0～4.0mg/L BA、0.01～0.02mg/L的NAA、0.01～0.02mg/L的TDZ、25～30g蔗糖以及7～8g/L琼脂的无菌MS培养基；

所述步骤5)的生根培养基为含有2.0mg/L的BA、1.0～2.0mg/L的NAA、25～30g蔗糖以及7～8g/L琼脂的无菌MS培养基。

更优选地，所述步骤2)～5)中的培养条件为：温度24～26℃、光照12h/天、光照强度2500lx；步骤2)、3)培养50±3天，步骤4)培养120±3天，步骤5)培养40±3天。

上述培养条件下，能够提供为金姜花离体培养提供良好的培养条件，植株生长更快。

一般地，在所述丛芽诱导培养基培养50天左右诱导出丛芽，在丛芽增殖培养基继续培养50天左右可获得足够数量的丛芽，在小根茎诱导培养基培养120天左右可诱导丛芽基部膨大为小根茎并增殖，在生根培养基继续培养40天左右，可获得健壮而完整的植株；实验人员可根据经验和实际情况进行调整。

作为本发明的优选实施方式，所述培养方法还包括步骤6)：将步骤5)获得的植株移栽至移栽育苗基质，移栽成活。

更优选地，所述步骤6)中的培养条件：温度24～26℃、遮荫度为80％，空气湿度为80～90％。

上述培养条件下，能够有效提高金姜花无菌苗移栽成活率。

本发明在移栽的前一阶段诱导丛芽的基部膨大、增殖为小根茎(将无菌苗诱导为小根茎)，增加了无菌苗的营养和水分储备能力，增强了无菌苗适应性，从而提高移栽的成活率；本发明获得的无菌苗对育苗基质和空气湿度具有较强的适应能力，移栽成活率较常规无菌苗高5～10％，移栽4周后成活率可达96～100％。

附图说明

图1为本发明通过小根茎诱导培养基培养后的植株情况，白色箭头指示微根茎。

具体实施方式

为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。

本发明所提到的：BA是6-苄氨基嘌呤、NAA是萘乙酸、KT是激动素、IAA是吲哚-3-乙酸、2,4-D是2,4-二氯苯氧乙酸。

MS培养基：本发明中的MS培养基组成成分如表1所示。

表1 MS培养基的组成成分

配制1LMS培养基：准确称取表1中所述的各种化合物，加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，用NaOH调节pH值至6.0，最后定容到1L。

实施例1

本发明一种金姜花离体培养方法的实施例，包括如下步骤：

1)挑选健壮、污染少的新鲜根茎为外植体，在无菌条件下，于超净工作台上用75％酒精溶液消毒30秒，再用0.1％升汞溶液浸泡15分钟，无菌水冲洗6次；

2)用消毒好的镊子和刀片剖去包裹在嫩茎上的叶鞘，把嫩茎切为带一个芽的薄片，接种到丛芽诱导培养基，培养50天左右诱导出丛芽；所述丛芽诱导培养基为含有2.0mg/L的BA、0.1mg/L的NAA、0.2mg/L的TDZ、25g蔗糖以及8g/L琼脂的无菌MS培养基；

3)将步骤2)获得的丛生芽以1～2个为单位进行切分，转接至丛芽增殖培养基，培养50天左右使丛芽增殖；所述丛芽增殖培养基为含有4.0mg/L BA、0.01mg/L的NAA、0.01mg/L的TDZ、25g蔗糖以及7g/L琼脂的无菌MS培养基；

4)将步骤3)获得的丛生芽以1～2个为单位进行切分，转接至小根茎诱导培养基，培养120天左右诱导丛芽基部膨大为小根茎并增殖；所述小根茎诱导培养基为含有3.0mg/L的BA、0.5mg/L的NAA、0.1mg/L的TDZ、30g蔗糖以及7g/L琼脂的无菌MS培养基；

5)将步骤4)获得的小根茎转入生根培养基，诱导生根，培养40天左右获得带3～4片叶、基部膨大、根系发达的完整植株；所述生根培养基为含有2.0mg/L的BA、1.0mg/L的NAA、30g蔗糖以及7g/L琼脂的无菌MS培养基；

6)将步骤5)获得的植株移栽至移栽育苗基质，移栽成活；所述移栽育苗基质为含有泥炭、园土、珍珠岩的育苗基质，按质量比，所述泥炭：园土：珍珠岩＝3：2：1。

所述步骤2)～5)中的培养条件为：温度24～26℃、光照12h/天、光照强度2500lx；所述步骤6)中的培养条件：温度24～26℃、遮荫度为80％，空气湿度为80～90％。

小根茎的定义：基部直径增大至3毫米以上、顶部叶片不多于2片(下同)。

实施例2

本发明一种金姜花离体培养方法的实施例，包括如下步骤：

1)挑选健壮、污染少的新鲜根茎为外植体，在无菌条件下，于超净工作台上用75％酒精溶液消毒60秒，再用0.1％升汞溶液浸泡10分钟，无菌水冲洗6次；

2)用消毒好的镊子和刀片剖去包裹在嫩茎上的叶鞘，把嫩茎切为带一个芽的薄片，接种到丛芽诱导培养基，培养50天左右诱导出丛芽；所述丛芽诱导培养基为含有4.0mg/L的BA、0.05mg/L的NAA、0.1mg/L的TDZ、30g蔗糖以及7g/L琼脂的无菌MS培养基；

3)将步骤2)获得的丛生芽以1～2个为单位进行切分，转接至丛芽增殖培养基，培养50天左右使丛芽增殖；所述丛芽增殖培养基为含有2.0mg/L BA、0.02mg/L的NAA、0.02mg/L的TDZ、30g蔗糖以及8g/L琼脂的无菌MS培养基；

4)将步骤3)获得的丛生芽以1～2个为单位进行切分，转接至小根茎诱导培养基，培养120天左右诱导丛芽基部膨大为小根茎并增殖；所述小根茎诱导培养基为含有1.0mg/L的BA、1.5mg/L的NAA、0.3mg/L的TDZ、25g蔗糖以及8g/L琼脂的无菌MS培养基；

5)将步骤4)获得的小根茎转入生根培养基，培养40天左右诱导生根，获得带3～4片叶、基部膨大、根系发达的完整植株；所述生根培养基为含有2.0mg/L的BA、2.0mg/L的NAA、25g蔗糖以及8g/L琼脂的无菌MS培养基；

实施例3

本发明一种金姜花离体培养方法的实施例，包括如下步骤：

1)挑选健壮、污染少的新鲜根茎为外植体，在无菌条件下，于超净工作台上用75％酒精溶液消毒45秒，再用0.1％升汞溶液浸泡12分钟，无菌水冲洗6次；

2)用消毒好的镊子和刀片剖去包裹在嫩茎上的叶鞘，把嫩茎切为带一个芽的薄片，接种到丛芽诱导培养基，培养50天左右诱导出丛芽；所述丛芽诱导培养基为含有3.0mg/L的BA、0.7mg/L的NAA、0.15mg/L的TDZ、28g蔗糖以及7.5g/L琼脂的无菌MS培养基；

3)将步骤2)获得的丛生芽以1～2个为单位进行切分，转接至丛芽增殖培养基，培养50天左右使丛芽增殖；所述丛芽增殖培养基为含有3mg/L BA、0.015mg/L的NAA、0.015mg/L的TDZ、28g蔗糖以及7.5g/L琼脂的无菌MS培养基；

4)将步骤3)获得的丛生芽以1～2个为单位进行切分，转接至小根茎诱导培养基，培养120天左右诱导丛芽基部膨大为小根茎并增殖；所述小根茎诱导培养基为含有2.0mg/L的BA、1.0mg/L的NAA、0.5mg/L的TDZ、28g蔗糖以及7.5g/L琼脂的无菌MS培养基；

5)将步骤4)获得的小根茎转入生根培养基，培养40天左右诱导生根，获得带3～4片叶、基部膨大、根系发达的完整植株；所述生根培养基为含有2.0mg/L的BA、1.5mg/L的NAA、28g蔗糖以及7.5g/L琼脂的无菌MS培养基；

通过实施例1～3的方法，一般在丛芽诱导培养基培养50天左右诱导出丛芽，在丛芽增殖培养基继续培养50天左右可获得足够数量的丛芽，在小根茎诱导培养基培养120天左右可诱导丛芽基部膨大为小根茎并增殖(参考图1以无菌苗为接种材料，在添加NAA1.0mg/L+BA 2.0mg/L+TDZ 0.5mg/L的无菌MS培养基上培养120天，微根茎增殖情况，白色箭头指示微根茎)，在生根培养基继续培养40天左右，可获得健壮而完整的植株。本发明方法进行金姜花离体培养，移栽4周后成活率为95～98％。

实施例4不同浓度的NAA对金姜花小根茎诱导结果的影响

按照实施例3步骤1)～3)的方法获得金姜花丛生芽，将获得的丛生芽以1～2个为单位进行切分，分别转接至含有不同NAA浓度的小根茎诱导培养基(所述小根茎诱导培养基为还含有2.0mg/L的BA、0.5mg/L的TDZ、28g蔗糖以及7.5g/L琼脂的无菌MS培养基，各组NAA浓度如表1)，继续以温度为24～26℃、光照12h/天、光照强度2500lx的条件培养120天，结果如表2。

表2不同浓度的NAA对金姜花小根茎诱导的影响

注：同列不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，参考SPSS单因素方差分析的结果分析，LSD法。

由实验结果可得，当BA(2.0mg/L)和TDZ(0.5mg/L)保持不变时，NAA为的浓度0～0.1mg/L时，诱导出的是直径低于3mm的带叶丛生芽，不能诱导出小根茎。NAA的浓度为0.5～1.0mg/L范围内，随着NAA浓度的增加，平均每个外植体诱导出的小根茎数量不断增多，但当NAA达到1.5时出现下降；小根茎平均直径在0.5～1.5范围内逐渐增加，平均每丛的叶茎数不断减少，平均高度不断降低。综合起来，NAA在0.5～1.5范围内可诱导出小根茎，且以1.0为佳。

实施例5不同浓度的BA对金姜花小根茎诱导结果的影响

按照实施例3步骤1)～3)的方法获得金姜花丛生芽，将获得的丛生芽以1～2个为单位进行切分，分别转接至含有不同TDZ浓度的小根茎诱导培养基(所述小根茎诱导培养基为还含有0.5mg/L的TDZ、1mg/L的NAA、28g蔗糖以及7.5g/L琼脂的无菌MS培养基，各组NAA浓度如表1)，继续以温度为24～26℃、光照12h/天、光照强度2500lx的条件培养120天，结果如表3。

表3不同浓度的BA对金姜花小根茎诱导的影响

由实验结果可得，当NAA(1.0mg/L)和TDZ(0.5mg/L)保持不变时，随着BA浓度升高，平均每株小根茎诱导数逐渐增加；小根茎平均直径逐渐降低，叶茎数量逐渐增加，但叶茎的高度逐渐降低。各观测性状在BA浓度为1.0～3.0mg/L范围内差异不显著，均可诱导小根茎增殖，但与BA为0时差异显著。BA浓度为2.0mg/L时平均每株小根茎诱导数较BA浓度为3.0mg/L时低，但差异不显著，且下根茎平均直径较大，因此BA浓度为2.0mg/L较为适宜。

实施例6不同浓度的TDZ对金姜花小根茎诱导结果的影响

按照实施例3步骤1)～3)的方法获得金姜花丛生芽，将获得的丛生芽以1～2个为单位进行切分，分别转接至含有不同TDZ浓度的小根茎诱导培养基(所述小根茎诱导培养基为还含有2.0mg/L的BA、1mg/L的NAA、28g蔗糖以及7.5g/L琼脂的无菌MS培养基，各组NAA浓度如表1)，继续以温度为24～26℃、光照12h/天、光照强度2500lx的条件培养120天，结果如表4。

表4不同浓度的TDZ对金姜花小根茎诱导的影响

由实验结果可得，当NAA(1.0mg/L)和BA(2.0mg/L)保持不变时，在0.1～0.5mg/L范围内，随着TDZ的浓度升高，平均每株小根茎的诱导数增加，小根茎平均直径降低，叶茎的数量增加，叶茎的高度降低。当TDZ浓度为1.0～1.5mg/L时诱导出的是丛生芽，直径低于3mm,不计为小根茎。在此范围内，随着TDZ的浓度增加，叶茎数量增加，但叶茎高度降低。因此适宜的TDZ浓度为0.1～0.5mg/L，且以0.5mg/L为宜。

实施例7不同无菌苗的移栽成活率比较

本实施例对本发明实施例3方法获得的带小根茎的无菌苗和常规的丛生无菌苗在不同土壤湿度和空气湿度下的移栽成活率进行对比试验。

本发明无菌苗：根据本发明实施例3步骤1)～5)方法获得带小根茎的无菌苗。

常规的丛生无菌苗：根据本发明实施例3步骤1)～3)、5)方法获得不带小根茎的无菌苗。

由于培养瓶内湿度高达100％，金姜花的无菌苗长时间培养在这一环境下，叶片含水量极高，移栽至瓶外时导致死亡的最主要原因时叶片失水。因此，移栽成活的关键是保持较高的空气湿度。本试验将无菌苗分处理移栽至闷养箱内，通过调节气孔开口的大小，调节箱内湿度分别为70％、80％、90％，对对两种类型的无菌苗的移栽成活率进行测试。

另外，金姜花的须根很发达，但纤细、容易损伤，通常在移栽后全部死亡，必须在新的环境中发出新根以维持植株的营养吸收。因此，金姜花的无菌苗对土壤基质的透气性也具有很高的要求。移栽基质不同组分的配比对土壤湿度和透气性具有重要的影响：泥炭的特点使保水、透气性强，园土的特点是保水性好，珍珠岩的特点是透水、透气性强。将三者以不同比例混合在一起，决定了土壤具有不同的湿度。按泥炭：园土：珍珠岩＝3：2：1(体积比)为育苗基质，可以使土壤既保持较好的透气性，满足金姜花常规无菌苗移栽的需要。为测试带小根茎的无菌苗对土壤环境的适应性，我们调整泥炭：园土：珍珠岩的比例为1：3：1(体积比)，降低基质的透气性，对两种类型的无菌苗的移栽成活率进行测试。

试验设计及结果见表5。

表5移栽成活率比较

注：遮荫度为80％，环境温度24～26℃

结果分析：从表4可以看出，当空气湿度和土壤透气性均较为适宜时(泥炭：园土：珍珠岩＝3：2：1)，不带小根茎的无菌苗可以获得较为理想的移栽成活率。但随着空气湿度的降低，移栽成活率迅速下降，土壤基质透气性的下降加剧了这种下降的幅度。而空气湿度和土壤透气性对本发明带小根茎的无菌苗的移栽成活率的影响却不大，说明本发明获得的带小根茎的无菌苗具有较强的适应性，在大规模的种苗生产中更具有实用性。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.用于金姜花离体培养的培养体系，其特征在于，包括小根茎诱导培养基，所述小根茎诱导培养基为含有1.0～3.0mg/L的BA、0.5～1.5mg/L的NAA、0.1～0.5mg/L的TDZ、25～30g蔗糖以及7～8g/L琼脂的无菌MS培养基。

2.如权利要求1所述的培养体系，其特征在于，还包括丛芽诱导培养基、丛芽增殖培养基和生根培养基。

3.如权利要求2所述的培养体系，其特征在于，所述丛芽诱导培养基为含有2.0～4.0mg/L的BA、0.05～0.1mg/L的NAA、0.1～0.2mg/L的TDZ、25～30g蔗糖以及7～8g/L琼脂的无菌MS培养基；所述丛芽增殖培养基为含有2.0～4.0mg/L BA、0.01～0.02mg/L的NAA、0.01～0.02mg/L的TDZ、25～30g蔗糖以及7～8g/L琼脂的无菌MS培养基；所述生根培养基为含有2.0mg/L的BA、1.0～2.0mg/L的NAA、25～30g蔗糖以及7～8g/L琼脂的无菌MS培养基。

4.如权利要求2所述的培养体系，其特征在于，还包括移栽育苗基质。

5.如权利要求4所述培养体系，其特征在于，所述移栽育苗基质为含有泥炭、园土、珍珠岩的育苗基质，按质量比，所述泥炭：园土：珍珠岩＝1：3：1。

6.如权利要求1～5任一项所述培养体系在金姜花离体培养中的用途。

7.一种金姜花离体培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

2)用消毒好的镊子和刀片剖去包裹在嫩茎上的叶鞘，把嫩茎切为带一个芽的薄片，接种到丛芽诱导培养基，诱导出丛芽；

3)将步骤2)获得的丛生芽以1～2个为单位进行切分，转接至丛芽增殖培养基中，使丛芽增殖；

4)将步骤3)获得的丛生芽以1～2个为单位进行切分，转接至如权利要求1所述的小根茎诱导培养基，诱导丛芽基部膨大为小根茎并增殖；

8.如权利要求7所述方法，其特征在于，所述步骤2)～5)中的培养条件为：温度24～26℃、光照12h/天、光照强度2500lx；步骤2)、3)培养50±3天，步骤4)培养120±3天，步骤5)培养40±3天。

9.如权利要求7或8所述方法，其特征在于，还包括步骤6)：将步骤5)获得的植株移栽至移栽育苗基质，移栽成活。

10.如权利要求9所述方法，其特征在于，所述步骤6)中的培养条件：温度24～26℃、遮荫度为80％，空气湿度为80～90％。