CN109302983B - 一种以顶芽为外植体的多花黄精快速繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用组织培养技术进行多花黄精种苗快速繁殖的方法。其特征在于包含了外植体选择、消毒等处理、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、愈伤组织分化及不定芽形成、不定芽根的诱导培养、炼苗和移栽等步骤的多花黄精组织培养快速繁殖体系。其显著特征是，以多花黄精顶芽作外植体，用70～75％的酒精和5～18％的NaClO组合消毒，快繁体系污染率可控制在5％以下。依据该快繁体系，6个月内，繁殖系数达80倍左右，即一个顶芽平均可产生80多棵组培苗。后期因可省却愈伤组织诱导过程，愈伤组织能持续分化，从而更利于组培苗的生产。本方法是一种高效、快捷、环境友好的繁殖技术体系，短期内可实现多花黄精良种的规模化生产。

Description

一种以顶芽为外植体的多花黄精快速繁殖方法

技术领域

本发明涉及药用植物的组织培养技术，尤其涉及多花黄精的组织培养技术，包括外植体选择、消毒等处理、愈伤组织的诱导、愈伤组织的增殖、愈伤组织分化、不定芽形成、不定芽的生根培养、炼苗和移栽等步骤。

背景技术

黄精是我国传统中药材，为百合科黄精属多年生草本植物。多花黄精是《中华人民共和国药典》2015 年版收藏的黄精属3种原生药之一，又称姜形黄精。其性味甘平，补气养阴，健脾，润肺，益肾。用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干少食，肺虚燥咳，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴等症。

多花黄精的繁殖主要有块茎繁殖和种子繁殖两种。生产上，块茎繁殖主要靠采挖野生块茎为种源进行无性繁殖，繁殖系数低，用量巨大，对自然野生资源构成巨大破坏；同时，连续多代的块茎繁殖，常造成植株内病毒富积而退化，个体生长势逐渐变弱，产量越来越低。种子繁殖时，因种子休眠期长、不易萌发、发芽率低等原因，生长速度不如块茎繁殖方法。组织培养是一种十分有效的快速繁殖手段。应用该方法，可在短期内得到大量的种苗。

迄今，已有多人对多花黄精的组织培养方法进行了研究^[1～5]，研究者多选用地下块茎和块茎之芽点为研究材料，此材料因不可避免地附带大量细菌和真菌，消毒十分困难。因此，上述研究工作无一例外地依赖高效灭菌剂—HgCl₂消毒。但HgCl₂的重金属残留往往会对植物造成伤害，废液的不当处理也会对环境造成危害。因此，这些方法均不适于规模化生产时采用。同时，上述研究结果表明，用上述组织培养方法获得的多花黄精的繁殖系数只有10左右，效率比较低下，意味着使用这些方法进行规模化生产时，成本会居高难下。

发明内容

解决的技术问题：针对现有组培技术存在的不足，本发明提供了一种简便、高效、免HgCl₂消毒的多花黄精外植体消毒方法，同时提供了一整套多花黄精的组织培养技术。

技术方案：一种以顶芽为外植体的多花黄精种苗快速繁殖方法，其特征在于包括以下7个步骤：

(1)外植体的选择；

(2)外植体的消毒；

(3)外植体的处理；

(4)愈伤组织的诱导；

(5)愈伤组织的增殖和分化；

(6)生根培养；

(7)炼苗移栽。

上述步骤(1)方法如下：选择多花黄精的顶芽为外植体，是指于3月下旬至4月上旬，从地下块茎萌动并长出地面5cm以上，干净、无明显污物、嫩叶尚未展开的直立茎尖。用利剪在茎尖以下约3cm处剪切，即得顶芽。此顶芽可进行后续处理；

上述步骤(2)方法如下：将步骤1所得顶芽进行表面消毒，具体方法是：用自来水将顶芽表面冲洗干净后，置于超净工作台之无菌器皿上，按照无菌操作规范，先用70～75％的酒精浸泡10～30s，优选15～20s；然后用无菌水冲洗一次，再用5～18％的NaClO浸泡3～10min，优选9～15％的NaClO浸泡4～8min；随后用无菌水冲洗三次备用；

上述步骤(3)方法如下：将步骤(2)中所得的顶芽用灭菌滤纸吸干表面水分，然后用灭菌手术刀切除顶芽下面约2.5cm多余茎段，再用灭菌手术刀沿顶芽纵轴方向对剖分成两份，但不限于两份，用灭菌滤纸吸干顶芽切面水分，将得到的两份1/2顶芽组织或多份顶芽组织作为外植体备用；

上述步骤(4)方法如下：在超净工作台内，无菌条件下，将按步骤(3)所示方法处理后的外植体，切面向下平铺于诱导培养基中，培养基组分为1/2MS培养基，另外添加2～7mg/L的6-BA、0.1～0.4mg/L 的NAA、0.2～0.8mg/L的TDZ，蔗糖浓度35g/L，琼脂粉浓度6g/L，调整pH为5.8。培养温度为(23±1)℃，湿度为60％。初始2d进行暗培养，然后在光照12h(光照强度1500～2400lx)、黑暗12h的光周期条件下培养。8～14d后，嫩芽翘起，茎干伸长时，嫩芽同时展叶。将带茎嫩叶在无菌超净工作台内切段，每段带嫩叶一片，切除上述嫩叶之一部分，只留下叶基部长1cm左右。将茎段埋进诱导培养基中而叶片露出培养基表面。培养20～34d后，茎和叶的交接处即开始有愈伤组织产生；

上述步骤(5)方法如下：将按步骤(4)所示方法操作所得之愈伤组织继续培养40～60d。待其细胞分裂增殖至体积约1cm³时，在无菌超净工作台内将其切下，切成大小约为0.5cm³的小块，将切好的愈伤组织再平铺于步骤(4)中所述之培养基中，并在步骤(4)中设定的光周期、光强度、温度、湿度等培养条件下培养。约30d后愈伤组织表面长出不定芽；

上述步骤(6)方法如下：将按步骤(5)所示方法操作后所得到的不定芽，在超净工作台中用无菌手术刀切下，芽基部带部分块茎状组织。将切下的小芽转移至生根培养基中进行生根培养。该生根培养基以 1/2MS培养基为基本培养基，额外添加浓度0.2～0.8mg/L(优选浓度0.2～0.5mg/L)的NAA，浓度2～5g/L(优选浓度2～3.5g/L)的活性炭，35g/L的蔗糖以及4g/L的琼脂粉，调整pH为5.8，在温度(24±1)℃下暗培养2d后，按照步骤(4)中设定的光照培养周期、光强度、温度、湿度等培养条件培养。培养15～24d后，不定芽开始陆续长根。待根长出2条以上，平均长度1～3cm时，即可进行炼苗。

上述步骤(7)方法如下：将按步骤(6)所示方法操作所得之装有生根组培苗的容器，从培养温室中移出，置自然光和室温下(20～30℃)，培养3d，然后组培容器瓶盖打开一半培养12～24h；从所述组培容器中取出组培苗，在清水中轻轻洗掉根部沾着的培养基，将苗移栽到配置好的移栽基质中。该基质由泥炭土、蛭石、泥土、有机肥按照(8～12)：(4～6)：(2～6)：(1～3)的体积比(优选(8～10)：(4～5)：(3.5～5)： (1～2))的体积比，混合后在约100℃高温下常压灭菌15～26h。移栽苗在遮阴度40％温室大棚中，相对湿度在70％左右、每天通风3～5次的条件下培养。待单株叶片长至3～5片后，将多花黄精种苗移栽于大田或林下培养即可。

有益效果：本发明以多花黄精春季萌发的地上顶芽为外植体，获得了多花黄精从取得外植体到组培苗温室大棚下培养出可用于大田栽培容器苗的全套技术方法。该技术方法具有以下优点：

(1)省时、省力：外植体取自多花黄精地上部分，不需要采挖地下块茎。同时地上部分较干净，去污、净化手续简单便捷。

(2)简便、高效、无HgCl₂残留：外植体只需用70～75％的酒精和5～18％的NaClO进行分步消毒，最后用灭菌水稍加漂洗即可完成。不用HgCl₂消毒，因此无HgCl₂残留，也无需用大量的灭菌水来漂洗，节约了水资源，减少了对环境的潜在危害。该方法消毒效果好，可将外植体污染率控制在5％以内。

(3)保护多花黄精野生资源：外植体取自春季萌发多花黄精的顶芽。顶芽采收后，地下块茎可继续萌发新芽，不破坏多花黄精地下块茎营养的积累。

(4)繁殖系数高：使用本发明的成套技术方法，繁殖系数可达80倍，是现有公开结果中最高繁殖系数的8倍^[4,5]。技术优势明显。

(5)技术体系完整：提供了多花黄精组培过程中从外植体采集到组培苗温室大棚炼苗的成套技术方法，并对各个技术环节进行了充分优化，适于多花黄精种苗的规模化生产。

附图说明

图1：多花黄精地上未展叶顶芽

图2：多花黄精顶芽纵切后平铺于愈伤组织诱导培养基中

图3：多花黄精叶与茎交接处长出愈伤组织

图4：多花黄精叶与茎交接处长出的愈伤组织切块处理

图5：多花黄精愈伤组织长出不定芽

图6：多花黄精不定芽生根

图7：多花黄精组培苗大棚炼苗移栽

具体实施方式：

下列实施例中所用多花黄精材料来自湖南省林业科学院实验林场国家林下经济示范基地。2015年底将部分多花黄精转移至湖南省林业科学院实验楼埋藏于泥炭土和泥土1:1的混合基质中，方便取材；细胞分裂素6-BA、TDZ、生长素NAA购自于国药集团化学试剂有限公司。

实施例1

本实施例中的1/2MS培养基为MS培养基中大量元素减半，其余组分和MS培养基相同。培养基A用于愈伤组织的诱导、增殖及分化，为1/2MS培养基中添加3mg/L的6-BA、0.3mg/L的NAA以及0.4mg/L 的TDZ，蔗糖浓度35g/L，琼脂粉浓度6g/L，调整pH为5.8后获得；培养基B用于组培苗的生根培养，为1/2MS培养基中添加0.2mg/L的NAA，2.0g/L的活性炭，35g/L的蔗糖以及4g/L的琼脂粉，调整pH为 5.8后获得。

1.外植体的选择

采集多花黄精地上部分顶芽。多花黄精顶芽采集标准为：从地下块茎萌动并长出地面5cm以上，选取表面干净、无明显污物、嫩叶尚未展开的直立茎尖，用利剪在茎尖以下约3cm处剪切，即得顶芽(如图1)；

2.外植体的消毒

用自来水将顶芽表面冲洗干净后，置于超净工作台之无菌器皿上，按照无菌操作规范，先用75％的酒精浸泡20s；然后用无菌水冲洗一次，再用15％的NaClO浸泡5min；随后用无菌水冲洗三次备用；数据统计结果显示，外植体污染率为3％，远小于地下块茎HgCl₂消毒后近30％的污染率^[3]；

3.外植体的处理

将步骤2所得的顶芽用灭菌滤纸吸干表面水分，然后用灭菌手术刀切除顶芽下面约2.5cm多余茎段，再用手术刀沿顶芽纵轴方向对剖分成两份，用灭菌滤纸吸干顶芽切面水分，将得到的两份1/2顶芽组织作为外植体备用；

4.愈伤组织的诱导

无菌条件下，将步骤3中处理后的外植体，切面向下平铺于培养基A中，在组培室中培养，温度为(23±1)℃，湿度为60％(如图2)。初始2d进行暗培养，然后在光照12h(光照强度1500～2400lx)、黑暗 12h的光周期条件下培养。8d后，嫩芽翘起，茎干伸长时，嫩芽同时展叶。将带茎嫩叶在无菌超净工作台内切段，每段带嫩叶一片，切除上述嫩叶之一部分，只留下叶基部长1cm左右。将茎段埋进诱导培养基中而叶片露出培养基表面。培养20d后，茎和叶的交接处即开始有愈伤组织产生。60d后愈伤组织产生率为 74.1％(如图3)；

5.愈伤组织的增殖和分化

将步骤4中愈伤组织继续培养，培养46d。此时细胞分裂增殖，体积约1cm³，在无菌超净工作台内将其切下，并将该组织块切成大小约0.5cm³的小块，将此小块愈伤组织再平铺于培养基A中(如图4)，直接在步骤4设定的光周期、光强度、温度、湿度等培养条件下培养。约30d后愈伤组织表面长出不定芽，平均每块可产生6个不定芽(如图5)；

6.生根培养

将步骤5中所述方法操作后所得到的不定芽，在超净工作台中用无菌手术刀切下，芽基部带部分块茎状组织。将切下的小芽转移至生根培养基B中进行生根培养，在温度(24±1)℃下暗培养2d后，按照步骤4中设定的光照培养周期、光强度、温度、湿度等培养条件培养。培养15d后，不定芽开始陆续长根，根长出3条，平均长度1cm时，即开始炼苗。组培苗培养50d后的生根率可达到100％(如图6)；

7.炼苗移栽

将步骤6中所得之装有组培苗的容器，从培养温室中移出，置自然光和室温下(20～30℃)，培养3d，然后将组培容器瓶盖打开一半培养12h；取出组培苗，在清水中轻轻洗掉根部沾着的培养基，将苗移栽到配置好的移栽基质中。该基质由泥炭土、蛭石、泥土、有机肥按照9：5：4：2的体积比，混合后在约100℃高温常压下灭菌20h。移栽苗在遮阴度40％温室大棚中，相对湿度70％，每天通风3次的条件下培养。移栽一月后叶片硬化率为94％，待叶片硬化，单株叶片长至3～5片后，将多花黄精种苗移栽于大田(如图7)。

实施例2

本实施例中的1/2MS培养基为MS培养基中大量元素减半，其余组分和MS培养基相同。培养基A用于愈伤组织的诱导、增殖及分化，为1/2MS培养基中添加2mg/L的6-BA、0.2mg/L的NAA、0.5mg/L的 TDZ，蔗糖浓度35g/L，琼脂粉浓度6g/L，调整pH为5.8后获得；培养基B用于组培苗的生根培养，为 1/2MS培养基中添加0.3mg/L的NAA，3.0g/L的活性炭，35g/L的蔗糖以及4g/L的琼脂粉，调整pH为5.8 后获得。

1.外植体的选择

取多花黄精地上部分顶芽。多花黄精顶芽采取标准为：从地下块茎萌动并长出地面5cm以上，选取表面干净、无明显污物、嫩叶尚未展开的直立茎尖，用利剪在茎尖以下约3cm处剪切，即得顶芽，用于后续处理；

2.外植体的消毒

用自来水将顶芽表面冲洗干净后，置于超净工作台之无菌器皿上，按照无菌操作规范，先用70％的酒精浸泡30s；然后用无菌水冲洗一次，再用10％的NaClO浸泡5min；随后用无菌水冲洗三次备用；数据统计结果显示，外植体污染率为4.2％；

3.外植体的处理

将步骤2所得的顶芽用灭菌滤纸吸干表面水分，然后用灭菌手术刀切除顶芽下面约2.5cm多余茎段，再用手术刀沿顶芽纵轴方向对剖分成两份，用灭菌滤纸吸干顶芽切面水分，将得到的两份1/2顶芽组织作为外植体备用；

4.愈伤组织的诱导

无菌条件下，将步骤3中处理后的外植体，切面向下平铺于培养基A中，在组培室中培养，温度为 (23±1)℃，湿度为60％。初始2d进行暗培养，然后在光照12h(光照强度1500～2400lx)、黑暗12h的光周期条件下培养。10～14d后，嫩芽翘起，茎干伸长时，嫩芽同时展叶。将带茎嫩叶在无菌超净工作台内切段，每段带嫩叶一片，切除上述嫩叶之一部分，只留下叶基部长0.8cm左右。将茎段埋进诱导培养基中而叶片露出培养基表面。培养30d后，茎和叶的交接处即开始有愈伤组织产生。60d后，愈伤组织产生率为72.8％；

5.愈伤组织的增殖和分化

将步骤4中愈伤组织继续培养，培养55d。此时细胞分裂增殖，体积大约1cm³，在无菌超净工作台内将其切下，然后将其分切成大小约为0.5cm³的小块，并再次平铺于培养基A中，直接在步骤4设定的光周期、光强度、温度、湿度等培养条件下培养。约30d后愈伤组织表面长出不定芽，平均每块可产生6.2 个不定芽；

6.生根培养

将按步骤5所述方法操作后所得不定芽，在超净工作台中用无菌手术刀切下，芽基部带部分块茎状组织。将切下的小芽转移至生根培养基B中进行生根培养，在温度(24±1)℃下暗培养2d后，按照步骤4 中设定的光照培养周期、光强度、温度、湿度等、光强等培养条件培养。培养15d后，不定芽长出2条根，平均长度1.2cm，此时开始炼苗。组培苗培养50d后的生根率为96％；

7.炼苗移栽

将步骤6中所得之装有组培苗的容器，从培养温室中移出，置自然光和室温下(20～30℃)，培养3d，然后将组培容器瓶盖打开一半，培养24h；从培养瓶中取出组培苗，在清水中轻轻洗掉根部沾着的培养基，将苗移栽到配置好的移栽基质中。该基质由泥炭土、蛭石、泥土、有机肥按照9：4.5：4.5：2的体积比，混合后在约100℃高温常压下灭菌15h。移栽苗在相对湿度在70％左右，遮阴度40％温室大棚中，相对湿度在70％左右，每天通风4次的条件下培养。移栽一月后叶片硬化率为94.5％，待叶片硬化，单株叶片长至4片后，将多花黄精种苗移栽于林下培养。

实施例3

本实施例中的1/2MS培养基为MS培养基中大量元素减半，其余组分和MS培养基相同。培养基A用于愈伤组织的诱导、增殖及分化，为1/2MS培养基中添加5mg/L的6-BA、0.2mg/L的NAA、0.8mg/L的 TDZ，蔗糖浓度35g/L，琼脂粉浓度6g/L，调整pH为5.8后获得；培养基B用于组培苗的生根培养，为 1/2MS培养基中添加0.4mg/L的NAA，2.0g/L的活性炭，35g/L的蔗糖以及4g/L的琼脂粉，调整pH为5.8 后获得。

1.外植体的选择

采集多花黄精地上部分顶芽。多花黄精顶芽采集标准为：从地下块茎萌动并长出地面5cm以上，选取表面干净、无明显污物、嫩叶尚未展开的直立茎尖，用利剪在茎尖以下约3cm处剪切，即得顶芽；

2.外植体的消毒

用自来水将顶芽表面冲洗干净后，置于超净工作台之无菌器皿上，按照无菌操作规范，先用75％的酒精浸泡15s；然后用无菌水冲洗一次，再用15％的NaClO浸泡3min；随后用无菌水冲洗三次备用；数据统计结果显示，外植体污染率为3.2％；

3.外植体的处理

将步骤2所得的顶芽用灭菌滤纸吸干表面水分，然后用灭菌手术刀切除顶芽下面约2.5cm多余茎段，再用手术刀沿顶芽纵轴方向对剖分成两份，用灭菌滤纸吸干顶芽切面水分，将得到的两份1/2顶芽组织作为外植体备用；

4.愈伤组织的诱导

无菌条件下，将步骤3中处理后的外植体，切面向下平铺于培养基A中，在组培室中培养，温度为 (23±1)℃，湿度为60％。初始2d进行暗培养，然后在光照12h(光照强度1500～2400lx)、黑暗12h的光周期条件下培养。10d后，嫩芽翘起，茎干伸长时，嫩芽同时展叶。将带茎嫩叶在无菌超净工作台内切段，每段带嫩叶一片，切除上述嫩叶之一部分，只留下叶基部长1cm左右。将茎段埋进诱导培养基中而叶片露出培养基表面。培养25d后，茎和叶的交接处即开始有愈伤组织产生。60d后，愈伤组织产生率为73.8％；

5.愈伤组织的增殖和分化

将步骤4中愈伤组织继续培养，培养50d。此时细胞分裂增体积约1cm³，在无菌超净工作台内将其切下，并将该组织切成大小约0.5cm³的小块，将小块愈伤组织再平铺于培养基A中，直接在步骤4设定的光周期、光强度、温度、湿度等培养条件下培养。约30d后愈伤组织表面长出不定芽，平均每块可产生5.5 个不定芽；

6.生根培养

将按步骤5所述方法操作后所得不定芽，在超净工作台中用无菌手术刀切下，芽基部带部分块茎组织。将切下的小芽转移至生根培养基B中进行生根培养，在温度(24±1)℃下暗培养2d后，按照步骤4中设定的光照培养周期、光强度、温度、湿度等、光强等培养条件培养。培养20d，不定芽开始陆续长根，根长出2条，平均长度2cm，此时开始炼苗，组培苗培养50d后的生根率为98％；

7.炼苗移栽

将步骤6中所得之装有组培苗的容器，从培养温室中移出，置自然光和室温下(20～30℃)，培养3d，然后将组培容器瓶盖打开一半培养20h；取出组培苗，在清水中轻轻洗掉根部沾着的培养基，将苗移栽到配置好的移栽基质中。该基质由泥炭土、蛭石、泥土、有机肥按照9：5：4：2的体积比，混合后在约100℃高温常压下灭菌20h。移栽苗在遮阴度40％温室大棚中，相对湿度在70％左右，每天通风3～5次的条件下培养。移栽一月后叶片硬化率为95％，待叶片硬化，单株叶片长至3～5片后，将多花黄精种苗移栽于大田。

实施例4

本实施例中的1/2MS培养基为MS培养基中大量元素减半，其余组分和MS培养基相同。培养基A用于愈伤组织的诱导、增殖及分化，为1/2MS培养基中添加1mg/L的6-BA、0.4mg/L的NAA、0.8mg/L的 TDZ，蔗糖浓度35g/L，琼脂粉浓度6g/L，调整pH为5.8后获得；培养基B用于组培苗的生根培养，为 1/2MS培养基中添加0.8mg/L的NAA，2.0g/L的活性炭，35g/L的蔗糖以及4g/L的琼脂粉，调整pH为5.8 后获得。

1.外植体的选择

采集多花黄精地上部分顶芽。多花黄精顶芽采集标准为：从地下块茎萌动并长出地面5cm以上，选取表面干净、无明显污物、嫩叶尚未展开的直立茎尖，用利剪在茎尖以下约3cm处剪切，即得顶芽，用于后续处理；

2.外植体的消毒

用自来水将顶芽表面冲洗干净后，置于超净工作台之无菌器皿上，按照无菌操作规范，先用75％的酒精浸泡10s；然后用无菌水冲洗一次，再用18％的NaClO浸泡3min；随后用无菌水冲洗三次备用；数据统计结果显示，外植体污染率为5％；

3.外植体的处理

将步骤2所得的顶芽用灭菌滤纸吸干表面水分，然后用灭菌手术刀切除顶芽下面约2.5cm多余茎段，再用手术刀沿顶芽纵轴方向对剖分成两份，用灭菌滤纸吸干顶芽切面水分，将得到的两份1/2顶芽组织作为外植体备用；

4.愈伤组织的诱导

无菌条件下，将步骤3中处理后的外植体，切面向下平铺于培养基A中，在组培室中培养，温度为 (23±1)℃，湿度为60％。初始2d进行暗培养，然后在光照12h(光照强度1500～2400lx)、黑暗12h的光周期条件下培养。14d后，嫩芽翘起，茎干伸长时，嫩芽同时展叶。将带茎嫩叶在无菌超净工作台内切段，每段带嫩叶一片，切除上述嫩叶之一部分，只留下叶基部长0.9cm左右。将茎段埋进诱导培养基中但使叶片露出培养基表面。培养34d后，茎和叶的交接处即开始有愈伤组织产生。60d后，愈伤组织产生率为70.5％；

5.愈伤组织的增殖和分化

将步骤4中愈伤组织继续培养，培养60d。此时细胞分裂增殖，体积约1cm³，在无菌超净工作台内将其切下，然后将其切成大小约为0.5cm³的小块，并再次平铺于培养基A中，直接在步骤4设定的光周期、光强度、温度、湿度等培养条件下培养。约30d后愈伤组织表面长出不定芽，平均每块可产生5.4个不定芽；

6.生根培养

将按步骤5所述方法操作后所得到的不定芽，在超净工作台中用无菌手术刀切下，芽基部带部分块茎状组织。将切下的小芽转移至生根培养基B中进行生根培养，在温度(24±1)℃下暗培养2d后，按照步骤4中设定的光照培养周期、光强度、温度、湿度等、光强等培养条件培养。培养24d，不定芽开始陆续长根，待根长出2条以上，平均长度1.3cm，此时开始炼苗，组培苗培养50d后的生根率为93％；

7.炼苗移栽

将步骤6中所得之装有组培苗的容器，从培养温室中移出，置自然光和室温下(20～30℃)，培养3d，然后将组织培养瓶盖打开一半培养15h；从培养瓶中取出组培苗，在清水中轻轻洗掉根部沾着的培养基，将苗移栽到配置好的移栽基质中。该基质由泥炭土、蛭石、泥土、有机肥按照10：4：5：1的体积比，混合后在约100℃高温常压下灭菌20h。移栽苗在遮阴度40％温室大棚中，相对湿度在70％左右，每天通风 5次的条件下培养。移栽一月后叶片硬化率为95％，待叶片硬化，单株叶片长至3～5片后，将多花黄精种苗移栽于大田。

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[5]福建柘参种业有限公司.一种多花黄精高产优质的规模化栽培新方法:中国,CN105532471A[P]. 2016.05.04 。

Claims (6)

1.一种以顶芽为外植体的多花黄精快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）顶芽进行表面消毒：用自来水将多花黄精顶芽表面冲洗干净后，置于超净工作台之无菌器皿上，按照无菌操作规范，先用70～75％的酒精浸泡10～30s，然后用无菌水冲洗一次，再用5～18％的NaClO浸泡3～10min，随后用无菌水冲洗三次备用；

（2）用灭菌滤纸吸干表面水分，然后用灭菌手术刀切除顶芽下面2.5cm多余茎段，再用手术刀沿顶芽纵轴方向对剖分成两份，但不限于两份，用灭菌滤纸吸干顶芽切面水分，将得到的两份1/2顶芽组织或多份顶芽组织作为外植体备用；

（3）无菌条件下，将处理后的外植体，切面向下平铺于诱导培养基中，诱导培养基组分为1/2MS培养基，另外添加2～7mg/L的6-BA、0.1～0.4mg/L的NAA、0.2～0.8mg/L的TDZ，蔗糖浓度35g/L，琼脂粉浓度6g/L，调整pH为5.8，培养温度为23±1℃，湿度为60％；初始2d进行暗培养，然后在光照强度1500～2400lx，光照12h、黑暗12h的光周期条件下培养，8～14d后，嫩芽翘起，茎干伸长时，嫩芽同时展叶，将带叶嫩茎在无菌超净工作台内切段，每段带嫩叶一片，切除上述嫩叶之一部分，只留下叶基部长1cm，将茎段埋进诱导培养基中而叶片露出培养基表面，培养20～34d后，茎和叶的交接处即开始有愈伤组织产生；

（4）步骤（3）得到的愈伤组织继续培养40～60d，待其细胞分裂增殖至体积1cm³时，在无菌超净工作台内将其切下，并切成大小为0.5cm³的小块，将小块的愈伤组织再平铺于步骤（3）采用的诱导培养基中，并在温度为23±1℃，湿度为60％，光照强度1500～2400lx，光照12h、黑暗12h的光周期条件下培养30d后愈伤组织表面长出不定芽；

（5）步骤（4）得到的不定芽在超净工作台中用无菌手术刀切下，芽基部带部分块状茎组织，将切下的小芽转移至生根培养基中进行生根培养，该生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，额外添加浓度0.2～0.8mg/L的NAA，浓度2～5g/L的活性炭，35g/L的蔗糖以及4g/L的琼脂粉，调整pH为5.8，温度24±1℃下暗培养2d后，再在温度为23±1℃，湿度为60％，光照强度1500～2400lx，光照12h、黑暗12h光周期条件下培养，培养15～24d后，不定芽开始陆续长根，待根长出2条以上，平均长度1～3cm时，即进行炼苗；

（6）炼苗移栽。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的顶芽，是指于3月下旬至4月上旬，从地下块茎萌动并长出地面5cm以上，干净、无明显污物、嫩叶尚未展开的直立茎尖，在茎尖以下3cm处剪切，即得顶芽。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中置于超净工作台之无菌器皿上，按照无菌操作规范，先用70～75％的酒精浸泡15～20s；然后用无菌水冲洗一次，再用9～15％的NaClO浸泡4～8min；随后用无菌水冲洗三次备用。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中将步骤（4）得到的不定芽在超净工作台中用无菌手术刀切下，芽基部带部分块状茎组织，将切下的小芽转移至生根培养基中进行生根培养，该生根培养基以1/2MS培养基为基本培养基，额外添加浓度0.2～0.5mg/L的NAA，浓度2～3.5g/L的活性炭，35g/L的蔗糖以及4g/L的琼脂粉。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（6）所述的炼苗移栽是指将步骤（5）得到的装有生根组培苗的容器，从培养温室中移出，置自然光和20～30℃，培养3d，然后将组培容器瓶盖打开一半培养12～24h；取出组培苗，在清水中轻轻洗掉根部沾着的培养基，将苗移栽到配置好的移栽基质中，该基质由泥炭土、蛭石、泥土、有机肥按照(8～12)：(4～6)：(2～6)：(1～3)的体积比混合后在100℃高温下常压灭菌15～26h，移栽苗在遮阴度40％温室大棚中，相对湿度在70％、每天通风3～5次的条件下培养，待单株叶片长至3～5片后，将多花黄精种苗移栽于大田或林下培养。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，泥炭土、蛭石、泥土、有机肥体积比为(8～10)：(4～5)：(3.5～5)：(1～2)。

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