CN115250915B - 一种藏南石斛茎段诱导原球茎及植株再生的高效繁殖方法 - Google Patents

一种藏南石斛茎段诱导原球茎及植株再生的高效繁殖方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种藏南石斛茎段诱导原球茎及植株再生的高效繁殖方法，包括以下步骤：(1)获取外植体并建立无菌体系；(2)将步骤1的茎段接入A培养基中进行原球茎诱导培养；(3)取步骤2中的原球茎转放新鲜A培养基中进行增殖、发育培养；(4)把步骤3中由原球茎发育而来的幼苗按每2‑3株为一丛转入B培养基中进行复壮和生根培养；(6)炼苗和移栽。本发明对藏南石斛的人工快速繁殖进行了优化调整，原球茎诱导、增殖和发育成幼苗在一个培养基中完成，而复壮和生根也在同一培养基中完成，整个培养过程只需两种培养基即可完成，简化了人工快繁过程，繁殖效率高，成本低、时间短，不仅提高了试管苗炼苗的成活率，且大大缩短了育苗周期。

Description

一种藏南石斛茎段诱导原球茎及植株再生的高效繁殖方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种藏南石斛茎段诱导原球茎及植株再生的高效繁殖方法。
背景技术
藏南石斛(Dendrobium monticolaP.F.Hunt et Summerh)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium)草叶组多年生草本植物，产于广西西南(那坡)、西藏南部(聂拉木、吉隆)。生于海拔1750-2200m的山谷岩石上，从印度西北部经尼泊尔到锡金和泰国也有分布。藏南石斛对生长环境要求苛刻，分布范围极其狭窄，自然生境遭到人为破坏严重；且在自然条件下结实率及种子萌发率低等问题导致野生资源已濒临灭绝，现已被列入中国《国家一级保护植物名录》；《华盛顿公约》(CITES)—附录Ⅱ，《世界自然保护联盟濒危物种红色名录》(IUCN)—易危品种。
石斛属是兰科开花植物中最大的属之一，大多为附生植物生长在亚洲的热带、亚热带和澳大利亚东部。近年来，国内外有关石斛属植物如铁皮石斛(D.officinaleKimuraetMigo)、霍山石斛(D.huoshanense C.Z.Tanget S.J.Cheng)、金钗石斛(D.nobileLindl.)、梳唇石斛(D.strongylanthum Rchb.F.)等的报道越来越多，但尚未见藏南石斛的相关报道。我国学者对石斛属植物的研究大多缘于其在中国传统医学或全球园艺贸易经济中的重要性。在中国传统医学中，石斛属植物为常用贵重药材，药用历史悠久，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳等功效，用于热病伤津、口干烦渴、病后虚热等多种病症。石斛属植物对生长环境要求苛刻，不能在土壤中生长，多附生于树干上或石壁石缝间，独特的代谢过程-景天酸代谢(CAM)，使石斛属植物不同于普通C3植物，光合作用在夜间进行且依靠内生菌制造养分和气生根吸收空气中的水分和养料，光合强度低，生长周期长。石斛属植物传统繁殖方式为分株和种子繁殖，分株繁殖尽管能保持母本性状，但效率低，增殖倍数只有1-3倍，且周期较长，难以满足工厂化生产的需要；而该属植物种子细小且缺乏子叶和胚乳，胚发育不完全，在自然条件下需与相关共生菌共同作用萌发，导致萌发时间长和萌发率低(仅为5％)、成苗率则更低；从种子萌发到能进行性状鉴定的开花植株一般需要4-5年，甚至更久。石斛属已有的组织培养报道很多，主要通过种子无菌萌发或原球茎、茎尖、茎段等外植体进行。种子无菌播种比茎段扦插获得试管苗的效率高数万倍，但存在成苗慢、再生植株羸弱、直接栽培成活率极低等缺点。
目前，藏南石斛全部依赖于野生资源的采挖；其后果直接导致野生种群数量急剧减少和生境片断化，加大了遗传漂变和近交的概率，加之有性生殖存在的障碍，致使其野生种群一经破坏便极难得以恢复。人工栽培中的分株繁殖周期长、效率低，育种进程缓慢，极度限制了藏南石斛的种植规模。为了保护濒危野生兰科种质资源、生物多样性、医学、病理等各方面研究提供资源保障，急需寻求一种新的成本低、时间短、质量和成活率高，且能将优良性状固定下来的无性繁殖方法来扩大藏南石斛种苗的繁殖量。进行藏南石斛高品质种苗的工厂化生产，已成为其种质资源保护和可持续利用的必然选择。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种藏南石斛茎段诱导原球茎及植株再生的高效繁殖方法，以解决藏南石斛野生资源匮乏，人工栽培中的分株繁殖周期长、效率低，育种进程缓慢，种植规模极度受限等问题。
为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案：
一种藏南石斛茎段诱导原球茎及植株再生的高效繁殖方法，包括的步骤有：将消毒灭菌后的茎段剪切成适当大小，进行原球茎诱导及初步增殖培养，原球茎增殖和发育为幼苗培养，复壮生根培养，炼苗移栽。
进一步地，一种藏南石斛茎段诱导原球茎及植株再生的高效繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的获取：选择表型性状优良的藏南石斛植株，取其茎段作为外植体；
(2)将步骤(1)的茎段先用自来水清洗表面灰尘，再用洗衣粉溶液浸泡并震荡搅动后流水冲洗，置于工作台；接着用乙醇溶液处理，再经升汞水溶液消毒，最后冲洗，得到消毒灭菌好的茎段材料；
(3)原球茎的诱导：将经过步骤(2)消毒灭菌好的茎段按节数用手术刀切割茎段，放入A培养基中进行培养；
所述A培养基，包括以下组分：
1/2MS基本培养液
香蕉泥
土豆泥
萘乙酸(NAA)
6-苄胺基嘌呤(6-BA)
激动素(KT)
活性炭(AC)
蔗糖
琼脂粉
控制光照度、温度、光照时间的条件下进行原球茎诱导和初步增殖；
(4)原球茎增殖和发育培养：取步骤(3)中的原球茎转接至步骤(3)中的新鲜A培养基进行培养；
控制光照度、温度、光照时间的条件下同步进行原球茎增殖和发育培养；
(5)复壮和生根培养：将步骤(4)中继代增殖培养后原球茎发育来的幼苗，按2-3株为一丛接种于B培养基中进行培养；
所述B培养基，包括以下组分：
1/2MS基本培养液
香蕉泥
土豆泥
萘乙酸(NAA)
6-苄胺基嘌呤(6-BA)
多效唑(PP333)
活性炭(AC)
蔗糖
琼脂粉
控制光照度、温度、光照时间的条件下进行原球茎增殖和幼苗的发育；
(6)炼苗和移栽：取步骤(5)中的生根瓶置于室温下炼苗3d，再打开瓶盖炼苗2d；从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中浸泡后移栽至经消毒后的碎松树皮中保温保湿培养，得移栽苗。
进一步地，步骤(2)中所述茎段消毒处理方法为：将步骤(2)的带5-6个节长约6-8cm茎段，用自来水清洗表面灰尘和杂物，再用质量浓度为10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗20min，置于超净工作台上用体积比为70％的酒精消毒10s，再用质量百分比为0.1％的升汞(HgCl2)消毒10min，最后无菌水冲洗4-5次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。最后剪切至带1-2个节，长约1.5-2.0cm大小。
进一步地，步骤(3)中所述A培养基，包括以下原料：
1/2MS基本培养液
Figure BDA0003795849790000041
进一步地，所述A培养基的pH值为5.4-5.6。
进一步地，将步骤(3)中的原球茎收集起来，转接入新鲜A培养基中，进行增殖与发育成幼苗。
进一步地，将步骤(4)中由原球茎发育而来的小苗按每2-3株为1丛，转接入步骤(5)中的B培养基中，所述B培养基，包括以下原料：
1/2MS基本培养液
Figure BDA0003795849790000042
Figure BDA0003795849790000051
进一步地，所述B培养基的pH值为5.4-5.6。
进一步地，步骤(6)中所述多菌灵溶液的质量浓度为0.1-0.5％。
进一步地，步骤(6)中所述碎松树皮大小为1.5×1.5cm、消毒方法为沸水蒸煮2-3h。
进一步地，步骤(6)中所述的温度为(25±2)℃，湿度60-80％。
本发明具有以下有益效果：
1、本发明用组织培养技术在培养室内可实现周年生产，既节约了土地资源，又提高了经济效益，克服了传统繁殖方式无法周年进行生产的难点。
2、本发明解决了石斛属植物利用种子非共生性萌发所带来的母本性状分离、周期长、再生苗赢弱、不易成活等难题，通过本发明，可在短时间内获得数量极大的种苗，且成本低、周期短，易于标准化、工厂化操作，有效地提高了种苗质量，解决了藏南石斛种质资源保护，且为其大面积推广种植提供统一标准的优良种苗。
3、本发明把藏南石斛的体外快繁程序进行了大幅优化，源于茎分生结节处的原球茎诱导、增殖、成苗一体化培养，一个增殖成苗培养周期仅需30d左右，增殖系数达20.0以上，大大降低了培养周期；而通过复壮生根后的再生植株健壮、根系发达，特别易于驯化成活。
4、本发明通过原球茎诱导、增殖、成苗一体化培养，缩减了转接次数，解决了石斛属植物无菌实生苗随着转接次数和增殖代数的增加，最终失去繁殖能力和无菌实生苗基因型参差不齐的问题。本发明可使所有种苗保持同一基因型背景，易于标准化、工厂化操作，有效地提高了种苗质量，可为种质资源保存提供统一标准的优良种苗，解决了石斛属植物由于长期人工分株繁殖造成病毒积累多，性状不稳定以及种植规模受限的问题。
5、本发明只需两种培养基就解决了增殖、复壮和生根的问题，利用安排生产计划。
6、本发明由于试管苗来源于体细胞胚，即原球茎，加之复壮效果好，再生植株苗壮根粗，炼苗和移栽成活率可达100％。
附图说明
图1为原球茎的诱导图，标尺＝1.5cm；
其中图1-A为茎段伤口处发生的分生结节图；图1-B、C为分生结节伤口处产生的原球茎聚合体图；图1-C为原球茎脱落在培养基表面后开始初步增殖图。
图2为原球茎增殖和丛芽发生图，标尺＝1.5cm。
其中图2-A为刚转接的原球茎图；图2-B为10d后原球茎开始增殖图；图2-C为15d后原球茎增殖明显图；图2-D为30d后增殖的原球茎已长满整个培养基表面图；图2-E为重新转接10d后原球茎开始增殖图；图2-F为15d后原球茎一边增殖，一边开始发育为幼苗图；图2-G为25d后丛生芽覆盖整个培养基表面，其下的原球茎继续增殖图；图2-H为30d后丛芽长逐渐长大，可见明显的真叶图。
图3为藏南石斛体细胞胚切片及成苗过程图，标尺＝1.0mm；
其中图3-A、B为心形胚时期的原球茎图；图3-C、D为从心形胚向鱼雷形胚过渡的原球茎图；图3-E为发育完整的原球茎丛图；图3-F为有叶原基产生的原球茎图；图3-G、H为由原球茎发育而来的丛生幼芽图。
图4为复壮生根培养图，标尺＝1.5cm；
其中图4-A为附加PP333(2.0-2.5mg/L)的培养基中培养60d后的植株生长情况图；图4-B为附加PP333(3.0mg/L)的培养基中培养60d后的植株生长情况图；图4-C为附加PP333(4.0mg/L)的培养基中培养60d后的植株生长情况图；图4-D为附加PP333(5.0mg/L)的培养基中培养60d后的植株生长情况图；图4-E、F为无PP3333培养基中的丛生芽30d后的植株生长情况图；图4-G、H为附加PP333(2.0-2.5mg/L)的培养基培养丛生芽60d后的生长情况图。
图5为试管苗炼苗移栽图，标尺＝3.0cm；
其中图5-A、B为30d后试管苗开始有生长迹象图；图5-C为60d后试管苗生长旺盛，可见明显膨大的肉质茎图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种藏南石斛茎段诱导原球茎及植株再生的高效繁殖方法，包括以下步骤：
1、外植体的获取：选择表型性状优良的藏南石斛植株，取其茎段作为外植体。
2、将步骤1的的带5-6个节长约6-8cm茎段，用自来水清洗表面灰尘和杂物，再用质量浓度为10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗20min，置于超净工作台上用体积比为70％的酒精消毒10s，再用质量百分比为0.1％的升汞(HgCl2)消毒10min，最后无菌水冲洗4-5次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。最后剪切至带1-2个节，长约1.5-2.0cm大小。
3、原球茎诱导、增殖、成苗一体化培养：将经过步骤2消毒灭菌好的茎段按一节用手术刀切割为1.5cm大小，接入下列A培养基中进行培养。
A培养基：
1/2MS基本培养液
Figure BDA0003795849790000071
培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22±1℃的条件下培养20天左右，无不定芽发生的茎节伤口处可见瘤状结构发生，发生率约37％左右；该结构在后续的培养中其表面有颗粒状原球茎聚合体发生。原球茎聚合体发生10d后，整个茎段顶端充满原球茎；随着原球茎的增加，部分原球茎脱落在培养基表面继续大量增殖。将原球茎收集后接入新鲜的A培养基培养，原球茎增殖效率非常高，周期短，仅30d左右原球茎就能覆盖整个培养基表面，此时增殖系数可达21.15。
4、复壮生根培养：取步骤3中培养60d后由原球茎发育来的幼苗按2-3株为1丛转接入下列B培养基中进行培养。
B培养基：
1/2MS基本培养液
Figure BDA0003795849790000081
培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22±1℃的条件下培养60d后可见具明显肉质茎的植株，同时不定根多且粗壮，丛芽基部被发达的根系缠绕。
5、炼苗和移栽：取步骤4中植株5.0cm高的生根瓶置于室温下炼苗3d，打开瓶盖炼苗2d后，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.1％的多菌灵溶液中消毒3min，后移栽至经沸水煮2h的碎松树皮(约1.5×1.5cm)为基质的花盆中保温(25℃)保湿(70％)培养60d后，即得移栽苗，成活率为100％。
实施例2
一种藏南石斛茎段诱导原球茎及植株再生的高效繁殖方法，包括以下步骤：
1、外植体的获取：选择表型性状优良的藏南石斛植株，取其茎段作为外植体。
2、将步骤1的的带5-6个节长约6-8cm茎段，用自来水清洗表面灰尘和杂物，再用质量浓度为10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗20min，置于超净工作台上用体积比为70％的酒精消毒10s，再用质量百分比为0.1％的升汞(HgCl2)消毒10min，最后无菌水冲洗4-5次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。最后剪切至带1-2个节，长约1.5-2.0cm大小。
3、原球茎诱导、增殖、成苗一体化培养：将经过步骤2消毒灭菌好的茎段按两节用手术刀切割为2.0cm大小，接入下列A培养基中进行培养。
A培养基：
1/2MS基本培养液
Figure BDA0003795849790000091
培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22±1℃的条件下培养20天左右，无不定芽发生的茎节伤口处可见瘤状结构发生，发生率约39％左右；该结构在后续的培养中其表面有颗粒状原球茎聚合体发生。原球茎聚合体发生10d后，整个茎段顶端充满原球茎；随着原球茎的增加，部分原球茎脱落在培养基表面继续大量增殖。将原球茎收集后接入新鲜的A培养基培养，原球茎增殖效率非常高，周期短，仅30d左右原球茎就能覆盖整个培养基表面，此时增殖系数可达20.96。
4、复壮生根培养：取步骤3中培养60d后由原球茎发育来的幼苗按2-3株为1丛转接入下列B培养基中进行培养。
B培养基：
1/2MS基本培养液
Figure BDA0003795849790000092
Figure BDA0003795849790000101
培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22±1℃的条件下培养60d后可见具明显肉质茎的植株，同时不定根多且粗壮，丛芽基部被发达的根系缠绕。
5、炼苗和移栽：取步骤4中植株6.0cm高的生根瓶置于室温下炼苗3d，打开瓶盖炼苗2d后，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.5％的多菌灵溶液中消毒3min，后移栽至经沸水煮2.5h的碎松树皮(约1.5×1.5cm)为基质的花盆中保温(24℃)保湿(60％)培养60d后，即得移栽苗，成活率为100％。
实施例3
一种藏南石斛茎段诱导原球茎及植株再生的高效繁殖方法，包括以下步骤：
1、外植体的获取：选择表型性状优良的藏南石斛植株，取其茎段作为外植体。
2、将步骤1的的带5-6个节长约6-8cm茎段，用自来水清洗表面灰尘和杂物，再用质量浓度为10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗20min，置于超净工作台上用体积比为70％的酒精消毒10s，再用质量百分比为0.1％的升汞(HgCl2)消毒10min，最后无菌水冲洗4-5次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。最后剪切至带1-2个节，长约1.5-2.0cm大小。
3、原球茎诱导、增殖、成苗一体化培养：将经过步骤2消毒灭菌好的茎段按两节用手术刀切割为1.8cm大小，接入下列A培养基中进行培养。
A培养基：
1/2MS基本培养液
Figure BDA0003795849790000102
Figure BDA0003795849790000111
培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22±1℃的条件下培养20天左右，无不定芽发生的茎节伤口处可见瘤状结构发生，发生率约35％左右；该结构在后续的培养中其表面有颗粒状原球茎聚合体发生。原球茎聚合体发生10d后，整个茎段顶端充满原球茎；随着原球茎的增加，部分原球茎脱落在培养基表面继续大量增殖。将原球茎收集后接入新鲜的A培养基培养，原球茎增殖效率非常高，周期短，仅30d左右原球茎就能覆盖整个培养基表面，此时增殖系数可达21.03。
4、复壮生根培养：取步骤3中培养60d后由原球茎发育来的幼苗按2-3株为1丛转接入下列B培养基中进行培养。
B培养基：
1/2MS基本培养液
Figure BDA0003795849790000112
培养条件：在光照度1800-2500lx，光照时间10h/d，温度控制在22±1℃的条件下培养60d后可见具明显肉质茎的植株，同时不定根多且粗壮，丛芽基部被发达的根系缠绕。
5、炼苗和移栽：取步骤4中植株7.0cm高的生根瓶置于室温下炼苗3d，打开瓶盖炼苗2d后，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入质量浓度0.3％的多菌灵溶液中消毒3min，后移栽至经沸水煮3h的碎松树皮(约1.5×1.5cm)为基质的花盆中保温(24℃)保湿(80％)培养60d后，即得移栽苗，成活率为100％。
本发明的技术原理：
1、外植体选用藏南石斛茎段作为外植体，保证了其具稳定的遗传特性，解决了由于遗传漂变和近交繁殖所产生的种质衰退问题。
2、本发明的核心在于由藏南石斛茎段诱导出膨大的分生结节处产生原球茎聚合体，其间无愈伤组织发生，原球茎直接高效率地增殖和发育；其种子通过人工非共生性萌发虽然可以获得大量种苗，但是随着转接次数和增殖代数的增加，导致试管苗失去繁殖能力，最终陷入一个死循环；而且通过种子组培获得种苗存在基因型参差不齐的问题。本发明在保证高繁殖系数的前提下，创造了保持藏南石斛优良种性最有效的增殖方式：即原球茎直接增殖，从而克服了无菌实生苗存在的上述问题。
3、通过生根培养阶段培养基组分多效唑的添加，其复壮效果明显，植株强壮，叶片宽大舒展，根系粗而发达，如图3所示，在进行炼苗移栽时成活率高，均达100％，从而解决了藏南石斛炼苗移栽成活率低的问题。
4、本发明简化了藏南石斛的人工快繁过程，最多仅需120d即可实现试管苗的再生培养，成本低廉，易于标准化、工厂化操作，从而解决了人工栽培中的分株繁殖周期长、效率低，育种进程缓慢，极度限制藏南石斛的种植规模的问题。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (1)

1.一种藏南石斛茎段诱导原球茎及植株再生的高效繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)外植体的获取：选择表型性状优良的藏南石斛植株，取其茎段作为外植体；
(2)将步骤(1)的茎段先用自来水清洗表面灰尘，再用洗衣粉溶液浸泡并震荡搅动后流水冲洗，置于工作台；用乙醇溶液处理，再经升汞水溶液消毒，最后冲洗，得到消毒灭菌好的茎段材料；
(3)原球茎的诱导：将经过步骤(2)消毒灭菌好的茎段按节数用手术刀切割茎段，放入A培养基中进行培养；
所述A培养基，由以下组分组成：
1/2MS基本培养液
香蕉泥
土豆泥
萘乙酸(NAA)
6-苄胺基嘌呤(6-BA)
激动素(KT)
活性炭(AC)
蔗糖
琼脂粉
控制光照度、温度、光照时间的条件下进行原球茎诱导和初步增殖；
(4)原球茎增殖和发育培养：取步骤(3)中的原球茎转接至步骤(3)中的新鲜A培养基进行培养；
控制光照度、温度、光照时间的条件下同步进行原球茎增殖和发育培养；
(5)复壮和生根培养：将步骤(4)中继代增殖培养后原球茎发育来的幼苗，按2-3株为一丛接种于B培养基中进行培养；
所述B培养基，由以下组分组成：
1/2MS基本培养液
香蕉泥
土豆泥
萘乙酸(NAA)
6-苄胺基嘌呤(6-BA)
多效唑(PP333)
活性炭(AC)
蔗糖
琼脂粉
控制光照度、温度、光照时间的条件下进行原球茎增殖和幼苗的发育；
(6)炼苗和移栽：取步骤(5)中的生根瓶置于室温下炼苗3d，再打开瓶盖炼苗2d；从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中浸泡后移栽至经消毒后的碎松树皮中保温保湿培养，得移栽苗；
步骤(2)中所述茎段消毒处理方法为：将步骤(2)的带5-6个节长6-8cm茎段，用自来水清洗表面灰尘和杂物，再用质量浓度为10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗20min，置于超净工作台上用体积比为70％的酒精消毒10s，再用质量百分比为0.1％的升汞(HgCl2)消毒10min，最后无菌水冲洗4-5次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿，最后剪切至带1-2个节，长1.5-2.0cm大小；
步骤(3)中所述A培养基，由以下原料组成：
Figure FDA0004143842250000021
所述A培养基的pH值为5.4-5.6；
将步骤(4)中由原球茎发育而来的小苗按每2-3株为1丛，转接入步骤(5)中的B培养基中，所述B培养基，由以下原料组成：
Figure FDA0004143842250000031
所述B培养基的pH值为5.4-5.6；
步骤(6)中所述多菌灵溶液的质量浓度为0.1-0.5％；
步骤(6)中所述碎松树皮大小为1.5×1.5cm、消毒方法为沸水蒸煮2-3h；
步骤(6)中所述的温度为(25±2)℃，湿度60-80％。
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