CN104782495A - 一种续随子组培快繁方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种续随子组培快繁方法，续随子（Euphorbia lathyris L.）为大戟科大戟属二年生草本植物,其种子又名千金子，为我国传统中药，具有逐水消肿,破血散结的功效,是治疗晚期血吸虫病的特效药,并具有抗肿瘤的作用。续随子还是一种理想的能源植物,其种子含油量高达45%左右，是制备生物柴油的优质原料之一。本发明以续随子种子为外植体，通过愈伤组织诱导、增殖、分化、生根、炼苗移栽等过程成功获得了续随子离体再植株，建立续随子组织培养快速繁殖技术体系，为节约栽培生产中的用种量,提高其药材的产量及为续随子进一步开展遗传转化研究奠定基础。

Description

一种续随子组培快繁方法
技术领域
    本发明涉及农业生物技术中植物组织培养的方法，具体地说，涉及一种续随子组培快繁方法。
背景技术
续随子（Euphorbia lathyris L.），又名千金子、小巴豆等，为大戟科大戟属二年生草本植物,广泛分布我国浙江、广西、西藏、吉林等10余个省市。为我国传统中药，具有逐水消肿,破血散结的功效,是治疗晚期血吸虫病的特效药,并具有抗肿瘤的作用。续随子还是一种理想的能源植物,其种子含油量高达45%左右，是制备生物柴油的优质原料之一。近年来,续随子作为能源植物在世界范围内广受重视,而通过种质资源收集、优良品种选育,培育出的能源专用型植物品种。2006年以来贵州省亚热带作物研究所开展的关于续随子种质资源收集、品种选育及栽培利用的研究,初步选育出3个优良新品系,并在贵州省内建立了续随子示范栽培基地。此外,续随子还具有观赏和作为农药用植物等用途。因此,续随子是一种具有广泛开发前景和应用价值的多用途经济作物。
目前，续随子主要是以种子繁殖,但其药用部分也是种子,这在一定程度上降低了其药材的产量。因此，本发明以续随子种子为外植体，通过愈伤组织诱导、增殖、分化、生根、炼苗移栽等过程成功获得了续随子离体再植株，建立续随子组织培养快速繁殖技术体系，为节约栽培生产中的用种量,提高其药材的产量及为续随子进一步开展遗传转化研究奠定基础。
发明内容
    本发明的目的在于提供出一种续随子组培快繁方法，本发明以续随子种子为外植体，通过愈伤组织诱导、增殖、分化、生根、炼苗移栽等过程成功获得了续随子离体再植株，建立续随子组织培养快速繁殖技术体系，从而实现了本发明的目的。
本发明的一种续随子组培快繁方法，包括以下的步骤：
（1）无菌苗的获得：选取饱满的续随子种子,在超净工作台中用手术剪刀剥去种皮，用75%酒精消毒30～60s,再0.1%升汞溶液消毒8～15min,最后用无菌水漂洗3～5次，用无菌滤纸吸干表面水分后接种到种子萌发培养基中。接种后置于每天光照24小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养20天后统计萌发率。
（2）愈伤诱导：当无菌苗的子叶刚展开时,取无菌苗的茎尖作为外植体,用解剖刀切成0.5cm左右长度,接种于用于愈伤诱导的培养基中培养。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计诱导率。
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小的小块并转入增殖培养基进行扩繁。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计增殖情况。
（4）分化培养：将步骤（3）增殖得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小的小块并转入分化培养基诱导不定芽的产生。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计分化情况。
（5）生根培养：将步骤（4）分化得到不定芽从基部切下并接种至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计生根情况。
（6）炼苗移栽：生根一个月后,打开其瓶口,并灌入无菌水,以保证其水分供应,5～7天后取出生根苗洗净根上所带培养基,移栽到基质由泥炭土:珍珠岩:蛭石＝3:1:1组成的基质中。用留有透气孔的薄膜覆盖,放置在阴凉透气的室内,10～15天将薄膜揭去,然后置于室外培养,隔天浇一次水,移栽30天后统计成活率。
    上述步骤（1）所述的萌发培养基为：1/2MS+0.01～0.05mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
    上述步骤（2）所述的愈伤诱导培养基为：MS+1.0～3.0mg/L 6-BA+0.1～0.5mg/LNAA+0.1～1.0mg/L KT+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
    上述步骤（3）所述的增殖培养基为：MS+1.0～2.0mg/L 6-BA+0.1～0.5mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
    上述步骤（4）所述的分化培养基为：MS+0.5～1.0mg/LKT+1.0～2.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
    上述步骤（3）所述的生根培养基为：1/2MS+0.5～1.0mg/L IBA+0.1～0.5mg/L NAA+0.5～1.0%活性炭+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
本发明的优点是：以续随子种子为外植体，通过愈伤组织诱导、增殖、分化、生根、炼苗移栽等过程成功获得了续随子离体再植株，建立续随子组织培养快速繁殖技术体系，为节约栽培生产中的用种量,提高其药材的产量及为续随子进一步开展遗传转化研究奠定基础。
具体实施方式
    以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1
 （1）无菌苗的获得：选取饱满的续随子种子,在超净工作台中用手术剪刀剥去种皮，用75%酒精消毒30s,再0.1%升汞溶液消毒8min,最后用无菌水漂洗3次，用无菌滤纸吸干表面水分后接种到种子萌发培养基中。接种后置于每天光照24小时，光照强度为1000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养20天后萌发率达到100%。所述的萌发培养基为：1/2MS+0.02mg/L NAA+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.5。
（2）愈伤诱导：当无菌苗的子叶刚展开时,取无菌苗的茎尖作为外植体,用解剖刀切成0.5cm左右长度,接种于用于愈伤诱导的培养基中培养。接种后置于每天光照12小时，光照强度为1000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后诱导率达到89.7%。所述的愈伤诱导培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.3mg/LNAA+0.7mg/L KT+25g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.4。
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小的小块并转入增殖培养基进行扩繁。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖倍数达到4.52倍。所述的增殖培养基为：MS+1.5mg/L 6-BA+0.3mg/L NAA+20g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.4。
（4）分化培养：将步骤（3）增殖得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小的小块并转入分化培养基诱导不定芽的产生。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后分化率达到89.3%，平均不定芽数为4.37个。所述的分化培养基为：MS+0.6mg/LKT+1.5mg/L NAA+30g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.4。
    （5）生根培养：将步骤（4）分化得到不定芽从基部切下并接种至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照12小时，光照强度为2000lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后生根率91.5%。所述的生根培养基为：1/2MS+0.6mg/L IBA+0.2mg/L NAA+0.5%活性炭+15g/L蔗糖+3.5g/L琼脂，pH为5.4。
（6）炼苗移栽：生根一个月后,打开其瓶口,并灌入无菌水,以保证其水分供应,5天后取出生根苗洗净根上所带培养基,移栽到基质由泥炭土:珍珠岩:蛭石＝3:1:1组成的基质中。用留有透气孔的薄膜覆盖,放置在阴凉透气的室内,10天将薄膜揭去,然后置于室外培养,隔天浇一次水,移栽30天后成活率达到90%以上。
    实施例2
（1）无菌苗的获得：选取饱满的续随子种子,在超净工作台中用手术剪刀剥去种皮，用75%酒精消毒45s,再0.1%升汞溶液消毒10min,最后用无菌水漂洗5次，用无菌滤纸吸干表面水分后接种到种子萌发培养基中。接种后置于每天光照24小时，光照强度为1500lx，置于培养温度为25℃，空气相对湿度为75%的条件下培养20天后萌发率达到100%。所述的萌发培养基为：1/2MS+0.05mg/L NAA+18g/L蔗糖+3.8g/L琼脂，pH为5.7。
（2）愈伤诱导：当无菌苗的子叶刚展开时,取无菌苗的茎尖作为外植体,用解剖刀切成0.5cm左右长度,接种于用于愈伤诱导的培养基中培养。接种后置于每天光照13小时，光照强度为1500lx，置于培养温度为27℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后诱导率达到90.3%。所述的愈伤诱导培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/LNAA+1.0mg/L KT+28g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH为5.7。
（3）增殖培养：将步骤（2）诱导得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小的小块并转入增殖培养基进行扩繁。接种后置于每天光照13小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为27℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后增殖倍数达到5.06倍。所述的增殖培养基为：MS+2.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA+25g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.7。
（4）分化培养：将步骤（3）增殖得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小的小块并转入分化培养基诱导不定芽的产生。接种后置于每天光照13小时，光照强度为2500lx，置于培养温度为27℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后分化率达到93.8%，平均不定芽数为4.97个。所述的分化培养基为：MS+1.0mg/LKT+2.0mg/L NAA+30g/L蔗糖+5.5g/L琼脂，pH为5.5。
    （5）生根培养：将步骤（4）分化得到不定芽从基部切下并接种至生根培养基中进行诱导生根。接种后置于每天光照14小时，光照强度为3000lx，置于培养温度为27℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后生根率95.2%。所述的生根培养基为：1/2MS+1.0mg/L IBA+0.5mg/L NAA+0.8%活性炭+20g/L蔗糖+4.5g/L琼脂，pH为5.7。
（6）炼苗移栽：生根一个月后,打开其瓶口,并灌入无菌水,以保证其水分供应,5天后取出生根苗洗净根上所带培养基,移栽到基质由泥炭土:珍珠岩:蛭石＝3:1:1组成的基质中。用留有透气孔的薄膜覆盖,放置在阴凉透气的室内,13天将薄膜揭去,然后置于室外培养,隔天浇一次水,移栽30天后成活率达到94.9%。

Claims (6)

1.一种续随子组培快繁方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）无菌苗的获得：选取饱满的续随子种子,在超净工作台中用手术剪刀剥去种皮，用75%酒精消毒30～60s,再0.1%升汞溶液消毒8～15min,最后用无菌水漂洗3～5次，用无菌滤纸吸干表面水分后接种到种子萌发培养基中，接种后置于每天光照24小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养20天后统计萌发率；
（2）愈伤诱导：当无菌苗的子叶刚展开时,取无菌苗的茎尖作为外植体,用解剖刀切成0.5cm左右长度,接种于用于愈伤诱导的培养基中培养，接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为1000～2000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计诱导率；
(3)增殖培养：将步骤（2）诱导得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小的小块并转入增殖培养基进行扩繁，接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计增殖情况；
(4)分化培养：将步骤（3）增殖得到的愈伤组织切割成0.5cm3大小的小块并转入分化培养基诱导不定芽的产生，接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计分化情况；
(5)生根培养：将步骤（4）分化得到不定芽从基部切下并接种至生根培养基中进行诱导生根，接种后置于每天光照12～14小时，光照强度为2000～3000lx，置于培养温度为25～28℃，空气相对湿度为75%的条件下培养30天后统计生根情况；
(6)炼苗移栽：生根一个月后,打开其瓶口,并灌入无菌水,以保证其水分供应,5～7天后取出生根苗洗净根上所带培养基,移栽到基质由泥炭土:珍珠岩:蛭石＝3:1:1组成的基质中，用留有透气孔的薄膜覆盖,放置在阴凉透气的室内,10～15天将薄膜揭去,然后置于室外培养,隔天浇一次水,移栽30天后统计成活率。
2.    根据权利要求1所述的一种续随子组培快繁方法，其特征在于步骤（1）所述的萌发培养基为：1/2MS+0.01～0.05mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
3.根据权利要求1所述的一种续随子组培快繁方法，其特征在于步骤（2）所述的愈伤诱导培养基为：MS+1.0～3.0mg/L 6-BA+0.1～0.5mg/LNAA+0.1～1.0mg/L KT+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
4.根据权利要求1所述的一种续随子组培快繁方法，其特征在于步骤（3）所述的增殖培养基为：MS+1.0～2.0mg/L 6-BA+0.1～0.5mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
5.     根据权利要求1所述的一种续随子组培快繁方法，其特征在于步骤（4）所述的分化培养基为：MS+0.5～1.0mg/LKT+1.0～2.0mg/L NAA+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
6.     根据权利要求1所述的一种续随子组培快繁方法，其特征在于步骤（3）所述的生根培养基为：1/2MS+0.5～1.0mg/L IBA+0.1～0.5mg/L NAA+0.5～1.0%活性炭+15～30g/L蔗糖+3.5～6.0g/L琼脂，pH为5.4～5.8。
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