CN117337767B - 彩虹大戟组培快繁方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及植物组培技术领域，具体来说是一种彩虹大戟组培快繁方法及应用，步骤包括：外植体选择与消毒、初代培养、续代培养、生根培养和生根苗的驯化。本发明初代丛生芽诱导培养采用NAA、IAA、TDZ以及极其不常用的2‑iP组合，可使丛生芽诱导率达64%以上。同时由于2‑iP较为昂贵，在继代增殖培养采用IAA、TDZ和KT组合，可使增殖系数稳定在6.0左右，生根培养采用WPM为基本培养基，并搭配IAA以及IBA，使组培苗生根率提高到98%以上，苗更加健壮、驯化成活率更高，利用本方法进行种苗生产，一年内即可获得数千万株商品苗，较常规繁殖方法（扦插）繁殖系数高数千倍，且不受季节、气候等因素限制。
Description
技术领域
本发明涉及植物组培技术领域，具体来说是一种彩虹大戟组培快繁方法及应用。
背景技术
彩虹大戟Euphorbia characias，又名爱斯科特彩虹，大戟科大戟属多年生观叶植物，原产欧洲，叶色根据光照、温差等的不同变化，呈现嫩绿至金黄至橘红如彩虹版绚烂的颜色，是一款即可观叶亦可观花的植物。耐寒，可耐-20℃低温，在长江以南可常绿越冬。
目前彩虹大戟繁殖主要有扦插繁殖，但其存在传统无性繁殖的通病-繁殖周期长，繁殖系数低等。目前还未有彩虹大戟组培相关的研究报道，仅有类似植物彩叶大戟的组培繁育技术的报道（一种彩叶大戟的快速繁殖方法CN115968783），但经本发明团队多次试验，其方法并不能应用于彩虹大戟上，因此急需开发一种彩虹大戟的组培快速繁殖方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种彩虹大戟的组培快速繁殖方法，解决繁殖周期长和繁殖成功率低等问题。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种彩虹大戟组培快繁方法，步骤包括：
（1）外植体选择：选择彩虹大戟的幼嫩具芽茎段为外植体；
（2）外植体消毒：外植体洗净后转移至超净台，用75%酒精消毒20～30s，无菌水涮洗2～3次，饱和漂白粉溶液消毒20～30min，无菌水涮洗3～4次，0.1%升汞溶液消毒4～5min，无菌水涮洗6～7次；
（3）初代培养：将消毒好的具芽茎段，用无菌纸吸去表面水分，同时剪去两端伤口，按极性接种初代培养基中，在温度为25±2℃，光照强度2000～3000Lx，日照光12h的光暗交替环境下培养30～40天；
所述初代培养基配方为：MS + NAA 0.02～0.05 mg/L + IAA 0.1～0.2 mg/L +2-iP 0.2～0.3 mg/L +TDZ 1.0～2.0 mg/L +活性炭0.2 g/L；
（4）续代增殖培养：丛生芽切成单芽，按极性接种在续代增殖培养基中，在温度为25±2℃，光照强度2000～3000Lx，日照光12h的光暗交替环境下培养25～30天；
所述续代增值培养基配方为：MS + IAA 0.05～0.1 mg/L + TDZ 2.0～3.0 mg/L+ KT 4.0～6.0 mg/L；
（5）生根培养：将增殖的丛生芽切成单芽，接种在丛生芽生根培养基中，在温度为25±2℃，光照强度2000～3000 Lx，日照光14h的光暗交替环境下培养20～25天；
所述生根培养基配方为：WPM + IAA 1.0～1.5 mg/L + IBA 0.3～0.5 mg/L。
进一步的，外植体选择具体步骤为：将彩虹大戟移栽于室内，每隔3天用75%多菌灵1000倍液喷施茎叶，连续喷施3次后取彩虹大戟顶端30cm内茎段，去叶后将其剪成2～3cm带芽小段，用饱和肥皂水溶液涮洗10～15min后，用自来水洗净，后加2～3滴吐温-80，震摇15～20min，后用自来水冲淋50～60min。
进一步的，所述初代培养基配方为：MS + NAA 0.03 mg/L + IAA 0.15 mg/L +2-iP 0.2 mg/L +TDZ 1.5 mg/L +活性炭0.2 g/L。
进一步的，所述续代增值培养基配方为：MS + IAA 0.1 mg/L + TDZ 2.5 mg/L +KT 5.0 mg/L。
进一步的，所述生根培养基配方为：WPM + IAA 1.5 mg/L + IBA 0.4 mg/L。
本发明的有益技术效果是：
1、彩虹大戟对0.1%升汞的消毒时间特别敏感，时间过长，极易导致外植体死亡，即使未死亡的外植体存在严重褐化，而时间过短，极易导致污染，本发明创造性的在消毒过程中添加饱和漂白粉溶液，同时配合短时升汞消毒，即达到了消毒的目的，又几乎不损伤外植体，可有利于进一步丛生芽的诱导。
2、彩虹大戟在初代丛生芽诱导培养时，对常规的BA、KT等均不敏感，本发明在初代丛生芽诱导培养时，采用一定浓度的NAA、IAA、TDZ以及极其不常用的2-iP组合，可使丛生芽诱导率达64%以上。同时由于2-iP较为昂贵，在继代增殖培养时，采用一定浓度的IAA、TDZ和KT组合，可使增殖系数稳定在5.7-6.1。
3、在继代增殖培养的基础上，一般常规采用1/2继代增殖基本培养基进行生根，但在彩虹大戟方面，采用1/2MS时，苗极其纤弱，且无论NAA、IAA、IBA怎样组合，其生根率均未超过70%，而本发明在生根培养时，采用WPM为基本培养基，并搭配一定浓度的IAA以及IBA，可使彩虹大戟组培苗生根率提高到98%以上，苗更加健壮，驯化时成活率更高。
4、利用本发明方法进行彩虹大戟种苗生产时，一年内即可获得数千万株彩虹大戟商品苗，较常规彩虹大戟繁殖方法（扦插）繁殖系数高数千倍，且几乎不受季节、气候等因素限制。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例1续代培养结果图；
图2是本发明实施例2续代培养结果图；
图3是本发明实施例3续代培养结果图；
图4是本发明对比例1续代培养结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种彩虹大戟组培快繁方法，步骤包括：
（1）外植体选择：将彩虹大戟移栽于室内，每隔3天用75%多菌灵1000倍液喷施茎叶，连续喷施3次后取彩虹大戟顶端30cm内茎段，去叶后将其剪成2cm带芽小段，用饱和肥皂水溶液涮洗10min后，用自来水洗净，后加2滴吐温-80，震摇15min，后用自来水冲淋50min。
（2）外植体消毒：外植体洗净后转移至超净台，用75%酒精消毒20s，无菌水涮洗2次，饱和漂白粉溶液消毒20min，无菌水涮洗3次，0.1%升汞溶液消毒4min，无菌水涮洗6次。
（3）初代培养：将消毒好的具芽茎段，用无菌纸吸去表面水分，同时剪去两端伤口，按极性接种初代培养基中，在温度为25±2℃，光照强度2000Lx，日照光12h的光暗交替环境下培养30天；
其中，初代培养基配方为：MS + NAA 0.02 mg/L + IAA 0.1 mg/L +2-iP 0.2 mg/L +TDZ 1.0 mg/L +活性炭0.2 g/L。
（4）续代增殖培养：丛生芽切成单芽，按极性接种在续代增殖培养基中，在温度为25±2℃，光照强度2000Lx，日照光12h的光暗交替环境下培养25天；
其中，续代增值培养基配方为：MS + IAA 0.05 mg/L + TDZ 2.0 mg/L + KT 4.0mg/L；
培养结果如图1所示，从图中可以看出续代培养后，组培苗长势旺盛，苗高达到了10-15cm。
（5）生根培养：将增殖的丛生芽切成单芽，接种在丛生芽生根培养基中，在温度为25±2℃，光照强度2000 Lx，日照光14h的光暗交替环境下培养20 天；
其中，生根培养基配方为：WPM + IAA 1.0 mg/L + IBA 0.3 mg/L。
（6）生根苗的驯化：将彩虹大戟组培生根苗，移栽于生根基质中，驯化环境为65%遮阴率的大棚下，移栽后喷施一次30mg/L的水杨酸（SA），后每隔5天喷施一次30 mg/L的水杨酸（SA）。
其中，生根基质为泥炭土、椰糠和珍珠岩，其重量比为4:6:1。
实施例2
一种彩虹大戟组培快繁方法，步骤包括：
（1）外植体选择：将彩虹大戟移栽于室内，每隔3天用75%多菌灵1000倍液喷施茎叶，连续喷施3次后取彩虹大戟顶端30cm内茎段，去叶后将其剪成3cm带芽小段，用饱和肥皂水溶液涮洗15min后，用自来水洗净，后加3滴吐温-80，震摇120min，后用自来水冲淋60min。
（2）外植体消毒：外植体洗净后转移至超净台，用75%酒精消毒30s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒30min，无菌水涮洗4次，0.1%升汞溶液5min，无菌水涮洗7次。
（3）初代培养：将消毒好的具芽茎段，用无菌纸吸去表面水分，同时剪去两端伤口，按极性接种初代培养基中，在温度为25±2℃，光照强度3000Lx，日照光12h的光暗交替环境下培养40天；
其中，初代培养基配方为：MS + NAA 0.05 mg/L + IAA 0.2 mg/L +2-iP 0.3 mg/L +TDZ 2.0 mg/L +活性炭0.2 g/L。
（4）续代增殖培养：丛生芽切成单芽，按极性接种在续代增殖培养基中，在温度为25±2℃，光照强度3000Lx，日照光12h的光暗交替环境下培养30天；
其中，续代增值培养基配方为：MS + IAA 0.1 mg/L + TDZ 3.0 mg/L + KT 6.0mg/L；
培养结果如图2所示，从图中可以看出续代培养后，组培苗长势旺盛，苗高达到了8-10cm。
（5）生根培养：将增殖的丛生芽切成单芽，接种在丛生芽生根培养基中，在温度为25±2℃，光照强度 3000 Lx，日照光14h的光暗交替环境下培养 25天；
其中，生根培养基配方为：WPM + IAA 1.5 mg/L + IBA 0.5 mg/L。
（6）生根苗的驯化：将彩虹大戟组培生根苗，移栽于生根基质中，驯化环境为 75%遮阴率的大棚下，移栽后喷施一次 40mg/L的水杨酸（SA），后每隔 7天喷施一次 40mg/L的水杨酸（SA）。
其中，生根基质为泥炭土、椰糠和珍珠岩，其重量比为4:6:1。
实施例3
一种彩虹大戟组培快繁方法，步骤包括：
（1）外植体选择：将彩虹大戟移栽于室内，每隔3天用75%多菌灵1000倍液喷施茎叶，连续喷施3次后取彩虹大戟顶端30cm内茎段，去叶后将其剪成3cm带芽小段，用饱和肥皂水溶液涮洗15min后，用自来水洗净，后加2滴吐温-80，震摇15min，后用自来水冲淋55min。
（2）外植体消毒：外植体洗净后转移至超净台，用75%酒精消毒25s，无菌水涮洗3次，饱和漂白粉溶液消毒25min，无菌水涮洗3次，0.1%升汞溶液消毒4min，无菌水涮洗7次。
（3）初代培养：将消毒好的具芽茎段，用无菌纸吸去表面水分，同时剪去两端伤口，按极性接种初代培养基中，在温度为25±2℃，光照强度2500Lx，日照光12h的光暗交替环境下培养35天；
其中，初代培养基配方为：MS + NAA 0.03 mg/L + IAA 0.15 mg/L +2-iP 0.2mg/L +TDZ 1.5 mg/L +活性炭0.2 g/L。
（4）续代增殖培养：丛生芽切成单芽，按极性接种在续代增殖培养基中，在温度为25±2℃，光照强度2500Lx，日照光12h的光暗交替环境下培养27天；
其中，续代增值培养基配方为：MS + IAA 0.1 mg/L + TDZ 2.5 mg/L + KT 5.0mg/L；
培养结果如图3所示，从图中可以看出续代培养后，组培苗长势旺盛，苗高达到了12-15cm。
（5）生根培养：将增殖的丛生芽切成单芽，接种在丛生芽生根培养基中，在温度为25±2℃，光照强度2500 Lx，日照光14h的光暗交替环境下培养23天；
其中，生根培养基配方为：WPM + IAA 1.5 mg/L + IBA 0.4 mg/L。
（6）生根苗的驯化：将彩虹大戟组培生根苗，移栽于生根基质中，驯化环境为65～75%遮阴率的大棚下，移栽后喷施一次35mg/L的水杨酸（SA），后每隔6天喷施一次35mg/L的水杨酸（SA）。
其中，生根基质为泥炭土、椰糠和珍珠岩，其重量比为4:6:1。
对比例1
采用彩虹大戟具芽茎段为外植体，参照专利一种彩叶大戟的快速繁殖方法（CN115968783）的实施例的最佳方法，进行外植体清洁、外植体消毒、初代丛生芽诱导、继代丛生芽增殖（如图4所示，组培苗生长非常缓慢，组培苗偏黄）以及丛生芽生根，并按照本发明实施例1方法进行驯化。
本发明实施例与对比例进行消毒死亡率、消毒污染率、初代丛生芽诱导率、继代增殖系数、生根率和驯化成活率进行比较，结果如表1所示。
表1 比较结果
| 消毒死亡率 | 消毒污染率 | 初代丛生芽诱导率 | 继代增殖系数 | 生根率 | 驯化成活率 | |
| 实施例1 | 11.6% | 17.9% | 65.8% | 5.83 | 98.9% | 97.4% |
| 实施例2 | 10.2% | 21.3% | 67.4% | 5.76 | 99.1% | 98.9% |
| 实施例3 | 11.0% | 19.8% | 64.9% | 6.12 | 99.3% | 98.1% |
| 对比例1 | 3.6% | 84.6% | 3.6% | 2.67 | 63.2% | 90.4% |
从上表可知，与对比例1相比，本发明实施例1-3除了消毒死亡率高于对比例1，其他包括消毒污染率、初代丛生芽诱导率、继代增殖系数、生根率和驯化成活率指标均高于对比例1。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。
Claims (6)
1.彩虹大戟组培快繁方法，其特征在于，步骤包括：
（1）外植体选择：选择彩虹大戟的幼嫩具芽茎段为外植体；
（2）外植体消毒：外植体洗净后转移至超净台，用75%酒精消毒20～30s，无菌水涮洗2～3次，饱和漂白粉溶液消毒20～30min，无菌水涮洗3～4次，0.1%升汞溶液消毒4～5min，无菌水涮洗6～7次；
（3）初代培养：将消毒好的具芽茎段用无菌纸吸去表面水分，同时剪去两端伤口，按极性接种初代培养基中，在温度为25±2℃，光照强度2000～3000Lx，日照光12h的光暗交替环境下培养30～40天；
所述初代培养基配方为：MS + NAA 0.02～0.05 mg/L + IAA 0.1～0.2 mg/L +2-iP0.2～0.3 mg/L +TDZ 1.0～2.0 mg/L +活性炭0.2 g/L；
（4）续代增殖培养：丛生芽切成单芽，按极性接种在续代增殖培养基中，在温度为25±2℃，光照强度2000～3000Lx，日照光12h的光暗交替环境下培养25～30天；
所述续代增殖培养基配方为：MS + IAA 0.05～0.1 mg/L + TDZ 2.0～3.0 mg/L + KT4.0～6.0 mg/L；
（5）生根培养：将增殖的丛生芽切成单芽，接种在生根培养基中，在温度为25±2℃，光照强度2000～3000 Lx，日照光14h的光暗交替环境下培养20～25天；
所述生根培养基配方为：WPM + IAA 1.0～1.5 mg/L + IBA 0.3～0.5 mg/L。
2.根据权利要求1所述彩虹大戟组培快繁方法，外植体选择具体步骤为：将彩虹大戟移栽于室内，每隔3天用75%多菌灵1000倍液喷施茎叶，连续喷施3次后取彩虹大戟顶端30cm内茎段，去叶后将其剪成2～3cm带芽小段，用饱和肥皂水溶液涮洗10～15min后，用自来水洗净，后加2～3滴吐温-80，震摇15～20min，后用自来水冲淋50～60min。
3.根据权利要求1所述彩虹大戟组培快繁方法，其特征在于，所述初代培养基配方为：MS + NAA 0.03 mg/L + IAA 0.15 mg/L +2-iP 0.2 mg/L +TDZ 1.5 mg/L +活性炭0.2 g/L。
4.根据权利要求1所述彩虹大戟组培快繁方法，其特征在于，所述续代增殖培养基配方为：MS + IAA 0.1 mg/L + TDZ 2.5 mg/L + KT 5.0 mg/L。
5.根据权利要求1所述彩虹大戟组培快繁方法，其特征在于，所述生根培养基配方为：WPM + IAA 1.5 mg/L + IBA 0.4 mg/L。
6.根据权利要求1-5任一项所述方法在彩虹大戟组培苗繁育中的应用。
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