CN113100069B - 一种大花美人蕉去病毒优质种苗组织培养快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种大花美人蕉去病毒优质种苗组织培养快速繁殖方法。它包括a.外植体的获得和消毒方法：b.不定芽诱导和继代增殖：c、生根培养：d、试管苗移栽：e、病毒检测。本发明利用茎尖为外植体结合高温和抗病毒药剂去除病毒生产出优质的无病毒种苗，实现了大花美人蕉快速繁殖，应用价值高。实施该发明只需有简单的植物组织培养设备即可进行。
Description
技术领域
本发明属于植物繁殖领域，具体涉及一种大花美人蕉去病毒优质种苗组织培养快速繁殖方法。
背景技术
大花美人蕉(Canna x generalis)，属于美人蕉科(Cannaceae)美人蕉属(Canna)的园艺杂交种，原产美洲热带和非洲等地。其枝叶茂盛、花朵艳丽、姿态优美、花期长，在华南地区几乎全年可开花，是配置大型花坛的优良品种。但大花美人蕉常在生长过程中易受病毒侵染，特别是常采用根茎进行分株繁殖，病毒会积累并传给后代。美人蕉感染病毒后主要表现为花叶、具褪绿条纹、花小夹有杂色斑纹，植株矮化等症状，影响美人蕉的正常生长及观赏价值，感染的病毒有黄瓜花叶病毒(CMV)且分布广泛,其它还有菜豆黄花叶病毒(BYMV)、黄斑驳病毒(CaYMV)和烟草花叶病毒(TMV)等。
目前，国内外还没有大花美人蕉去病毒优质种苗组织培养快速繁殖方法的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种大花美人蕉去病毒优质种苗组织培养快速繁殖方法。
本发明的大花美人蕉去病毒优质种苗组织培养快速繁殖方法，其包括以下步骤：
a.外植体的获得和消毒方法：
选择生长健壮的、表面无病毒感染症状的大花美人蕉优良母株，挖取根茎上2－4厘米长的嫩芽，擦拭干净后，经第一次消毒后，剥除嫩芽外面的嫩叶，再经第二次消毒，剥取2-4毫米的茎尖，接种于初代培养基中，所述的初代培养基为MS培养基+3.0-5.0毫克/升6-苄基嘌呤+8-12毫克/升抗病毒醚+蔗糖20-30克/升+琼脂，pH 5.8-6.0，先在黑暗条件下培养，培养温度35-37℃，然后将无污染并成活的茎尖在培养温度26-30℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天下培养直至外植体基部有不定芽长出；
b.不定芽诱导和继代增殖：将3-4厘米高的不定芽切去上部叶片接种到不定芽诱导和继代增殖培养基中进行不定芽的诱导和增殖，所述的不定芽诱导和继代增殖培养基为MS培养基+3.0-5.0毫克/升6-苄基嘌呤+3.0-5.0毫克/升激动素+0.1-0.5毫克/升萘乙酸+8-12毫克/升抗病毒醚+蔗糖20-30克/升+琼脂，pH 5.8-6.0，先在35-37℃条件下暗培养，再移入光照下培养，培养温度26-30℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，然后将增殖芽接种到增殖培养基中进行增殖，所述的增殖培养基为MS培养基+3.0-5.0毫克/升6-苄基嘌呤+3.0-5.0毫克/升激动素+0.1-0.5毫克/升萘乙酸+蔗糖20-30克/升+琼脂，pH5.8-6.0；
c、生根培养：当芽高3-4厘米高时，切下接种到生根培养基中进行生根培养，所述的生根培养基为MS培养基+1.0-2.0毫克/升吲哚丁酸+1.0-2.0克/升活性炭+蔗糖15-20克/升+琼脂，pH 5.8-6.0，培养温度26-30℃，光照度1800-2500lx，光照12-16小时/天；
d、试管苗移栽：当生根试管苗长至5-6厘米高时，在自然光照下炼苗，然后打开瓶塞，把试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入基质中，浇水、遮荫、保温和保湿；
e、病毒检测：取即将出瓶的试管苗进行病毒检测，获得无病毒感染的试管苗。
优选，所述的第一次消毒是用体积分数75％乙醇棉擦拭表面，浸泡在体积分数75％酒精中浸泡10-30秒后，再用质量分数1％次氯酸钠溶液消毒5-7分钟，无菌水冲洗4-6次。
优选，所述的第二次消毒是将剥除外面的嫩叶的嫩芽放入质量分数0.1％升汞溶液消毒1-3分钟，无菌水冲洗4～6次。
优选，不定芽诱导和继代增殖需先在黑暗条件下培养5天，且培养温度35-37℃。
优选，所述的试管苗移栽中的基质是由泥炭土:珍珠岩＝2-4:1v/v混合而成的基质。
优选，所述的病毒检测优选是取即将出瓶的试管苗叶片用酶联免疫吸附法进行病毒检测。
优选，所述的病毒检测是对黄瓜花叶病毒(CMV)、菜豆黄花叶病毒(BYMV)、黄斑驳病毒(CaYMV)和烟草花叶病毒(TMV)等病毒进行检测。
本发明利用茎尖为外植体结合高温和抗病毒药剂去除病毒生产出优质的无病毒种苗，实现了大花美人蕉快速繁殖，应用价值高。实施该发明只需有简单的植物组织培养设备即可进行。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1.外植体的获得和消毒方法：
选择生长健壮的、表面无病毒感染症状的优良母株，挖取根茎上2－4厘米长的嫩芽，用湿布擦拭干净后，再用体积分数75％乙醇棉擦拭表面，浸泡在体积分数75％酒精中浸泡10秒后，再用质量分数1％次氯酸钠溶液消毒5分钟，无菌水冲洗4次后，剥除外面的嫩叶，再放入质量分数0.1％升汞溶液消毒2分钟，无菌水冲洗4次后，再剥除外面的嫩叶，再放入质量分数0.1％升汞溶液消毒1分钟，无菌水冲洗4次后，剥取2毫米的茎尖用于初代培养。初代培养基为MS培养基+3.0毫克/升6-苄基嘌呤(6-BA)+12毫克/升抗病毒醚+蔗糖20克/升+琼脂6克/升，pH 5.8，先在黑暗条件下培养5天(如果不进行暗培养，直接在光照条件下培养，外植体易褐化死亡)，培养温度35℃，培养消毒成功率75％，茎尖成活率70％。将无污染并成活的茎尖继续在光照条件下培养5天时，培养温度26℃，光照度1500lx，光照16小时/天，生长点伸长形成小芽。在培养温度26℃，光照度1500lx，光照16小时/天下再培养15天时外植体基部有不定芽长出。
所述的初代培养基的每升配制方法是：将3.0毫克6-苄基嘌呤(6-BA)、12毫克抗病毒醚、蔗糖20克、琼脂6克加入到1L MS培养基中，调pH至5.8，灭菌。
2.不定芽诱导和继代增殖：培养30天时将3－4厘米高的小芽切去上部叶片接种到不定芽诱导和继代增殖培养基：MS培养基+3.0毫克/升6-苄基嘌呤(6-BA)+3.0毫克/升激动素(KT)+0.1毫克/升萘乙酸(NAA)+8毫克/升抗病毒醚+蔗糖20克/升+琼脂6克/升，pH5.8，进行不定芽的诱导和增殖。先在35℃条件下暗培养5天后(如果不进行暗培养，直接在光照条件下培养，芽易褐化死亡)，再移入光照下培养，培养温度26℃，光照度1500lx，光照16小时/天，增殖倍数为2倍。此后在增殖培养基：MS培养基+3.0毫克/升6-苄基嘌呤(6-BA)+3.0毫克/升激动素(KT)+0.1毫克/升萘乙酸(NAA)+蔗糖20克/升+琼脂6克/升，pH 5.8，培养温度26℃，光照度1500lx，光照16小时/天，进行增殖，一般40天为1个继代增殖周期，每增殖周期后的增殖倍数为3倍。
所述的不定芽诱导和继代增殖培养基每升配制方法为：3.0毫克6-苄基嘌呤(6-BA)、3.0毫克激动素(KT)、0.1毫克萘乙酸(NAA)、8毫克抗病毒醚、蔗糖20克、琼脂6克加入到1L MS培养基中，调pH 5.8，灭菌备用；
所述的增殖培养基每升配制方法为：3.0毫克6-苄基嘌呤(6-BA)、3.0毫克激动素(KT)、0.1毫克萘乙酸(NAA)、蔗糖20克、琼脂6克加入到1L MS培养基中，调pH 5.8，灭菌备用。
3.生根培养：当芽高约3－4厘米高时，切下接种到生根培养基：MS培养基+1.0毫克/升吲哚丁酸(IBA)+1.0克/升活性炭(AC)+蔗糖15克/升+琼脂6克/升，pH 5.8，培养温度26℃，光照度1800lx，光照16小时/天。能正常生根，培养40天时生根率可达90％，每株苗有根数4条。
所述的生根培养基每升配制方法为：将1.0-毫克吲哚丁酸(IBA)、1.0克活性炭(AC)、蔗糖15克、琼脂6克加入到1L MS培养基中，调pH 5.8，灭菌备用。
4.试管苗移栽：当生根试管苗长至5－6厘米高时，在自然光照下炼苗7天。然后打开瓶塞，用镊子把试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土:珍珠岩＝2:1(v/v)混合的基质中，注意浇水、遮荫、保温和保湿，成活率可达95％。
5.病毒检测：取即将出瓶的试管苗叶片用酶联免疫吸附法(ELISA)进行黄瓜花叶病毒(CMV)、菜豆黄花叶病毒(BYMV)、黄斑驳病毒(CaYMV)和烟草花叶病毒(TMV)等病毒进行检测，以感染病毒的植株叶片作阳性对照，结果发现所生产出的试管苗均不带病毒。
实施例2：
1.外植体的获得和消毒方法：
选择生长健壮的、表面无病毒感染症状的优良母株，挖取根茎上2－4厘米长的嫩芽，用湿布擦拭干净后，再用体积分数75％乙醇棉擦拭表面，浸泡在体积分数75％酒精中浸泡20秒后，再用质量分数1％次氯酸钠溶液消毒6分钟，无菌水冲洗4次后，剥除外面的嫩叶，再放入质量分数0.1％升汞溶液消毒3分钟，无菌水冲洗5次后，再剥除外面的嫩叶，再放入质量分数0.1％升汞溶液消毒2分钟，无菌水冲洗5次后，剥取3毫米的茎尖用于初代培养。初代培养基为MS培养基+4.0毫克/升6-苄基嘌呤(6-BA)+10毫克/升抗病毒醚+蔗糖25克/升+琼脂6克/升，pH 5.9，先在黑暗条件下培养5天(如果不进行暗培养，直接在光照条件下培养，外植体易褐化死亡)，培养温度36℃，培养消毒成功率80％，茎尖成活率65％。将无污染并成活的茎尖继续在光照条件下培养5天时，培养温度28℃，光照度1800lx，光照14小时/天，生长点伸长小芽。在培养温度28℃，光照度1800lx，光照14小时/天条件下再培养13天时外植体基部有不定芽长出。
所述的初代培养基的每升配制方法是：将4.0毫克6-苄基嘌呤(6-BA)、10毫克抗病毒醚、蔗糖25克、琼脂6克加入到1L MS培养基中，调pH至5.9，灭菌。
2.不定芽诱导和继代增殖：培养30天时将3－4厘米高的小芽切去上部叶片接种到不定芽诱导和继代增殖培养基中：MS培养基+4.0毫克/升6-苄基嘌呤(6-BA)+4.0毫克/升激动素(KT)+0.3毫克/升萘乙酸(NAA)+10毫克/升抗病毒醚+蔗糖25克/升+琼脂6克/升，pH5.9，进行不定芽的诱导和增殖。先在36℃条件下暗培养5天后(如果不进行暗培养，直接在光照条件下培养，芽易褐化死亡)，再移入光照下培养，培养温度28℃，光照度1800lx，光照14小时/天。增殖倍数为2.5倍。此后在增殖培养基：MS培养基+4.0毫克/升6-苄基嘌呤(6-BA)+4.0毫克/升激动素(KT)+0.3毫克/升萘乙酸(NAA)+蔗糖25克/升+琼脂6克/升，pH 5.9，进行繁殖，培养温度28℃，光照度1800lx，光照14小时/天。一般40天为1个继代增殖周期，每增殖周期后的增殖倍数为3.5倍。
所述的不定芽诱导和继代增殖培养基每升配制方法为：4.0毫克6-苄基嘌呤(6-BA)、4.0毫克激动素(KT)、0.3毫克萘乙酸(NAA)、10毫克抗病毒醚、蔗糖25克、琼脂6克加入到1L MS培养基中，调pH 5.9，灭菌备用；
所述的增殖培养基每升配制方法为：4.0毫克6-苄基嘌呤(6-BA)、4.0毫克激动素(KT)、0.3毫克萘乙酸(NAA)、蔗糖25克、琼脂6克加入到MS培养基中，调pH 5.9，灭菌备用。
3.生根培养：当芽高约3－4厘米高时，切下接种到生根培养基中：MS培养基+1.5毫克/升吲哚丁酸(IBA)+1.5克/升活性炭(AC)+蔗糖18克/升+琼脂6克/升，pH 5.9，培养温度28℃，光照度2000lx，光照14小时/天。能正常生根，培养40天时生根率可达95％，每株苗有根数5条。
所述的生根培养基每升配制方法为：将1.5-毫克吲哚丁酸(IBA)、1.5克活性炭(AC)、蔗糖18克、琼脂6克加入到1LMS培养基中，调pH 5.9，灭菌备用。
4.试管苗移栽：当生根试管苗长至5－6厘米高时，在自然光照下炼苗8天。然后打开瓶塞，用镊子把试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土:珍珠岩＝3:1(v/v)混合的基质中，注意浇水、遮荫、保温和保湿，成活率可达98％。
5.病毒检测：取即将出瓶的试管苗叶片用酶联免疫吸附法(ELISA)进行黄瓜花叶病毒(CMV)、菜豆黄花叶病毒(BYMV)、黄斑驳病毒(CaYMV)和烟草花叶病毒(TMV)等病毒进行检测，以感染病毒的植株叶片作阳性对照，结果发现所生产出的试管苗均不带病毒。
实施例3：
1.外植体的获得和消毒方法：
选择生长健壮的、表面无病毒感染症状的优良母株，挖取根茎上2－4厘米长的嫩芽，用湿布擦拭干净后，再用体积分数75％乙醇棉擦拭表面，浸泡在体积分数75％酒精中浸泡30秒后，再用质量分数1％次氯酸钠溶液消毒7分钟，无菌水冲洗6次后，剥除外面的嫩叶，再放入质量分数0.1％升汞溶液消毒4分钟，无菌水冲洗6次后，再剥除外面的嫩叶，再放入质量分数0.1％升汞溶液消毒3分钟，无菌水冲洗6次后，剥取4毫米的茎尖用于初代培养。初代培养基为：MS培养基+5.0毫克/升6-苄基嘌呤(6-BA)+8毫克/升抗病毒醚+蔗糖30克/升+琼脂6克/升，pH 6.0，先在黑暗条件下培养5天(如果不进行暗培养，直接在光照条件下培养，外植体易褐化死亡)，培养温度37℃，培养消毒成功率85％，茎尖成活率60％。将无污染并成活的茎尖继续在光照条件下培养5天时，培养温度30℃，2000lx，光照12小时/天。生长点伸长小芽。在培养温度30℃，2000lx，光照12小时/天下再培养10天时外植体基部有不定芽长出。
所述的初代培养基的每升配制方法是：将5.0毫克6-苄基嘌呤(6-BA)、8毫克抗病毒醚、蔗糖30克、琼脂6克加入到1L MS培养基中，调pH至6.0，灭菌。
2.不定芽诱导和继代增殖：培养30天时将3－4厘米高的小芽切去上部叶片接种到不定芽诱导和继代增殖培养基中：MS培养基+5.0毫克/升6-苄基嘌呤(6-BA)+5.0毫克/升激动素(KT)+0.5毫克/升萘乙酸(NAA)+12毫克/升抗病毒醚+蔗糖30克/升+琼脂6克/升，pH6.0进行不定芽的诱导和增殖。先在37℃条件下暗培养5天后(如果不进行暗培养，直接在光照条件下培养，芽易褐化死亡)，再移入光照下培养，培养温度30℃，光照度2000lx，光照12小时/天。增殖倍数为3倍。此后在增殖培养基中：MS培养基+5.0毫克/升6-苄基嘌呤(6-BA)+5.0毫克/升激动素(KT)+0.5毫克/升萘乙酸(NAA)+蔗糖30克/升+琼脂6克/升，pH 6.0进行增殖，培养温度30℃，光照度2000lx，光照12小时/天。一般40天为1个继代增殖周期，每增殖周期后的增殖倍数为4倍。
所述的不定芽诱导和继代增殖培养基每升配制方法为：5.0毫克6-苄基嘌呤(6-BA)、5.0毫克激动素(KT)、0.5毫克萘乙酸(NAA)、12毫克抗病毒醚、蔗糖30克、琼脂6克加入到1L MS培养基中，调pH 5.8，灭菌备用；
所述的增殖培养基每升配制方法为：5.0毫克6-苄基嘌呤(6-BA)、5.0毫克激动素(KT)、0.5毫克萘乙酸(NAA)、蔗糖30克、琼脂6克加入到1L MS培养基中，调pH6，灭菌备用。
3.生根培养：当芽高约3－4厘米高时，切下接种到生根培养基：MS培养基+2.0毫克/升吲哚丁酸(IBA)+2.0克/升活性炭(AC)+蔗糖30克/升+琼脂6克/升，pH 6.0，培养温度30℃，光照度2500lx，光照12小时/天。能正常生根，培养40天时生根率可达100％，每株苗有根数6条。
所述的生根培养基每升配制方法为：将2.0-毫克吲哚丁酸(IBA)、2.0克活性炭(AC)、蔗糖30克、琼脂6克加入到1L MS培养基中，调pH 6，灭菌备用。
4.试管苗移栽：当生根试管苗长至5－6厘米高时，在自然光照下炼苗10天。然后打开瓶塞，用镊子把试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入泥炭土:珍珠岩＝4:1(v/v)混合的基质中，注意浇水、遮荫、保温和保湿，成活率可达100％。
5.病毒检测：取即将出瓶的试管苗叶片用酶联免疫吸附法(ELISA)进行黄瓜花叶病毒(CMV)、菜豆黄花叶病毒(BYMV)、黄斑驳病毒(CaYMV)和烟草花叶病毒(TMV)等病毒进行检测，以感染病毒的植株叶片作阳性对照，结果发现所生产出的试管苗均不带病毒。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (6)
1.一种大花美人蕉去病毒优质种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
a.外植体的获得和消毒方法：
选择生长健壮的、表面无病毒感染症状的大花美人蕉优良母株，挖取根茎上2－4厘米长的嫩芽，擦拭干净后，经第一次消毒后，剥除嫩芽外面的嫩叶，再经第二次消毒，剥取2-4毫米的茎尖，接种于初代培养基中，所述的初代培养基为MS培养基+3.0-5.0毫克/升6-苄基嘌呤+8-12毫克/升抗病毒醚+蔗糖20-30克/升+琼脂，pH 5.8-6.0，先在黑暗条件下培养，培养温度35-37℃，然后将无污染并成活的茎尖在培养温度26-30℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天下培养直至外植体基部有不定芽长出；
b.不定芽诱导和继代增殖：将3-4厘米高的不定芽切去上部叶片接种到不定芽诱导和继代增殖培养基中进行不定芽的诱导和增殖，所述的不定芽诱导和继代增殖培养基为MS培养基+3.0-5.0毫克/升6-苄基嘌呤+3.0-5.0毫克/升激动素+0.1-0.5毫克/升萘乙酸+8-12毫克/升抗病毒醚+蔗糖20-30克/升+琼脂，pH 5.8-6.0，先在35-37℃条件下暗培养，再移入光照下培养，培养温度26-30℃，光照度1500-2000lx，光照12-16小时/天，然后将增殖芽接种到增殖培养基中进行增殖，所述的增殖培养基为MS培养基+3.0-5.0毫克/升6-苄基嘌呤+3.0-5.0毫克/升激动素+0.1-0.5毫克/升萘乙酸+蔗糖20-30克/升+琼脂，pH5.8-6.0；
c、生根培养：当芽高3-4厘米时，切下接种到生根培养基中进行生根培养，所述的生根培养基为MS培养基+1.0-2.0毫克/升吲哚丁酸+1.0-2.0克/升活性炭+蔗糖15-20克/升+琼脂，pH 5.8-6.0，培养温度26-30℃，光照度1800-2500lx，光照12-16小时/天；
d、试管苗移栽：当生根试管苗长至5-6厘米高时，在自然光照下炼苗，然后打开瓶塞，把试管苗从培养瓶中取出，洗掉根部培养基，栽入基质中，浇水、遮荫、保温和保湿；
e、病毒检测：取即将出瓶的试管苗进行病毒检测，获得无病毒感染的试管苗；
所述的不定芽诱导和继代增殖中在35-37℃条件下暗培养，是在黑暗条件下培养5天，且培养温度35-37℃。
2.根据权利要求1所述的大花美人蕉去病毒优质种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的第一次消毒是用体积分数75％乙醇棉擦拭表面，浸泡在体积分数75％酒精中浸泡10-30秒后，再用质量分数1％次氯酸钠溶液消毒5-7分钟，无菌水冲洗4-6次。
3.根据权利要求1所述的大花美人蕉去病毒优质种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的第二次消毒是将剥除外面的嫩叶的嫩芽放入质量分数0.1％升汞溶液消毒1-3分钟，无菌水冲洗4～6次。
4.根据权利要求1所述的大花美人蕉去病毒优质种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的试管苗移栽中的基质是由泥炭土:珍珠岩＝2-4:1v/v混合而成的基质。
5.根据权利要求1所述的大花美人蕉去病毒优质种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的病毒检测是取即将出瓶的试管苗叶片用酶联免疫吸附法进行病毒检测。
6.根据权利要求5所述的大花美人蕉去病毒优质种苗组织培养快速繁殖方法，其特征在于，所述的病毒检测是对黄瓜花叶病毒、菜豆黄花叶病毒、黄斑驳病毒和烟草花叶病毒进行检测。
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