CN110199872B - 一种短消毒时间的白掌茎尖组培快繁的方法 - Google Patents

一种短消毒时间的白掌茎尖组培快繁的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种短消毒时间的白掌茎尖组培快繁的方法。所述的方法包括以下步骤：1)外植体选择及消毒；2)茎尖培养；3)丛生芽诱导；4)丛生芽增殖5)生根及移栽。本发明以带有1～2个叶原基、直径1～2mm的茎尖为外植体，能大幅度缩短0.1％升汞消毒时间，最大程度减少重金属对植株的伤害，消毒后茎尖全部成活，生长恢复快，降低由于重金属毒害所造成的变异风险。使用相对较低浓度的细胞分裂素(0.6～1mg/L 6‑BA)进行培养及增殖，获得较高的增殖倍数，并降低增殖过程中的变异概率，提高种苗质量。将生根植株进行移栽，成活率达99％以上。

Description

一种短消毒时间的白掌茎尖组培快繁的方法
技术领域
本发明属于植物种苗生产领域，具体涉及一种短消毒时间的白掌茎尖组培快繁的方法。
背景技术
白掌是天南星科白鹤芋属(Spathiphyllum)的一个种，其花、叶具有较高观赏价值，且株型美观、大小适中，耐荫，又具有净化室内空气的功效，适合家庭及办公场所摆放，深受广大消费者的喜爱，市场前景广阔。
白掌通常采用分株方式进行繁育，繁殖系数低、周期长，易携带病毒，大大限制了白掌的规模化和商品化生产。而通过植物组织培养可以在短期内生产出大量优质组培种苗，满足市场需求。
国内关于白掌组培快繁有不少报道，但通常以叶片、叶柄、顶芽、茎段、花梗、花序等组织、器官为外植体，其表面消毒难度均较高，污染率介于10％～87％，且经过多代培养后，易产生内生细菌，影响后续增殖及成苗质量。以叶片、叶柄、茎段、花梗、花序诱导愈伤再分化成苗的途径，容易产生变异。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，提供一种短消毒时间的白掌茎尖组培快繁的方法。
本发明的短消毒时间的白掌茎尖组培快繁的方法，包括以下步骤：(1)外植体选择及消毒、(2)茎尖培养、(3)丛生芽诱导、(4)丛生芽增殖、(5)生根及移栽。
具体的步骤为：
(1)外植体选择及消毒：于8～10月切取二年生白掌植株，取带4～5片叶柄的茎段，将茎段冲洗、晾干，以含氯消毒溶液进行清洁，用去离子水冲洗干净，无菌条件下剥去部分叶柄，加入HgCl2溶液进行消毒，再用灭菌去离子水冲洗干净，吸干水分，剥取带有1～2个叶原基、直径为1～2mm的茎尖作为外植体；
(2)茎尖培养：将茎尖置于1/2MS+0.2～0.6mg/L KT+0.1～0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.2g/L卡拉粉，pH 5.8～6.0的培养基中培养，获得无菌单芽；培养基配制方法为：将各成分按其含量加入1/2MS培养基中，调pH值，混合均匀，灭菌即得。
(3)丛生芽诱导：将无菌单芽转接到1/2MS+0.6mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.2g/L卡拉粉，pH 5.8～6.0的培养基中培养，获得丛生芽；培养基配制方法为：将各成分按其含量加入1/2MS培养基中，调pH值，混合均匀，灭菌即得。
(4)丛生芽增殖：将丛生芽以双芽形式接种于3/4MS+0.6～1mg/L 6-BA+0.05～0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉粉，pH 5.8～6.0的培养基中进行增殖培养；培养基配制方法为：将各成分按其含量加入3/4MS培养基中，调pH值，混合均匀，灭菌即得。
(5)生根及移栽：从增殖获得的丛生芽中切下带根单株，将带根单株置于1/2MS+0.5～1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.2g/L卡拉粉+0.2g/L活性炭，pH 5.8～6.0的培养基中进行生根培养，经炼苗后，移栽于填满泥炭基质的穴盘中进行栽培。培养基配制方法为：将各成分按其含量加入1/2MS培养基中，调pH值，混合均匀，灭菌即得。
所述的1/2MS培养基是将MS培养基中的大量元素减半而得到的培养基，3/4MS是将MS培养基中的大量元素减去1/4，留下3/4，而得到的培养基。
所述步骤(1)的HgCl2溶液为0.1％(即1mg/mL)的HgCl2溶液，消毒时间为4～8min。
所述步骤(1)的以含氯消毒溶液进行清洁具体为：用0.6％含氯消毒溶液(以君鸿牌消毒粉配制，其有效氯成分18～21％，w/w)振荡清洁40min，期间换一次清洁液。
所述步骤(2)茎尖培养条件为：先在6μmol·m-2·s-1弱光下培养1周，再转入光照强度为25～30μmol·m-2·s-1，光照时间为10h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60％的条件下培养33天。
所述步骤(3)的丛生芽诱导培养条件为：在光照强度为25～30μmol·m-2·s-1，光照时间为10h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60％的条件下培养80天。
所述步骤(4)的丛生芽增殖培养条件为：在光照强度为25～30μmol·m-2·s-1，光照时间为10h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60％的条件下培养40天。
所述步骤(5)的生根培养条件为：在光照强度为25～30μmol·m-2·s-1，光照时间为10h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60％的条件下培养30天。
所述步骤(5)的炼苗是在温度为24～28℃的温室中炼苗1周。
所述步骤(5)的栽培是在温度为24～28℃，空气相对湿度为80％的温室中栽培。
本发明的有益效果是：
本发明以带有1～2个叶原基、直径1～2mm的茎尖为外植体，由于白掌茎尖部的特殊结构，使得茎尖部未受环境污染，只需做好表面的简单消毒，便可获得无菌外植体，茎尖消毒成功率达到96.7％以上，能大幅度缩短0.1％升汞消毒时间，最大程度减少重金属对植株的伤害，消毒后茎尖全部成活，生长恢复快，降低由于重金属毒害所造成的变异风险。使用相对较低浓度的细胞分裂素(0.6～1mg/L 6-BA)进行培养及增殖，获得较高的增殖倍数，增殖率为2.5～3.1，并降低增殖过程中的变异概率，提高种苗质量，生根率达100％。将生根植株进行移栽，成活率达99％以上。
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
1、外植体选择和消毒
选取栽培于温室中生长健壮、无病虫害的二年生美酒白掌，于8月切取植株，将植株整株切下，取带4～5片叶柄的茎段约5cm，将茎段冲洗、晾干，用0.6％(即6mg/mL)含氯消毒溶液(以君鸿牌消毒粉配制，其有效氯成分18～21％，w/w)振荡清洁40min，期间换一次清洁液，用去离子水冲洗干净，无菌条件下剥去2片叶柄，加入0.1％(即1mg/mL)HgCl2溶液浸泡消毒4min，用灭菌去离子水冲洗6次，吸干水分，剥取带有1～2个叶原基、直径1～2mm茎尖作为外植体。茎尖消毒成功率达到96.7％。
2、茎尖培养
将茎尖置于1/2MS+0.2mg/L KT+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.2g/L卡拉粉，pH 5.8～6.0的培养基中，在弱光下(6μmol·m-2·s-1)培养1周，然后转入光照强度为25～30μmol·m-2·s-1，光照时间为10h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60％的条件下培养33天。茎尖均转绿成活，形成无菌单芽。经过40天的培养，茎基部直径平均增长3.01±0.18mm。
3、丛生芽诱导
将无菌单芽转接到1/2MS+0.6mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.2g/L卡拉粉，pH 5.8～6.0的培养基中，在光照强度为25～30μmol·m-2·s-1，光照时间为10h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60％的条件下培养80天(2个周期)。各茎尖均能诱导出2个以上的丛生芽。
4、丛生芽增殖
将丛生芽以双芽形式接种于3/4MS+0.6mg/L 6-BA+0.05mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉粉，pH 5.8～6.0的培养基上，每瓶4个芽团，在光照强度为25～30μmol·m-2·s-1，光照时间为10h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60％的条件下培养40天，其增殖率为2.69。
5、生根及移栽
从增殖获得的丛生芽中将株高3cm以上、具有3片叶的带根单株切下，将带根单株置于1/2MS+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.2g/L卡拉粉+0.2g/L活性炭，pH 5.8～6.0的培养基中，在光照强度为25～30μmol·m-2·s-1，光照时间为10h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60％的条件下培养30天，生根率达到100％，置于温度为26±2℃的温室中炼苗1周后，移栽于填满泥炭基质(0～20mm)的穴盘中，在温室温度为26±2℃，空气相对湿度约为80％条件下栽培，成活率达99％。
实施例2
1、外植体选择和消毒
选取栽培于温室中生长健壮、无病虫害的二年生美酒白掌，于10月切取植株，将植株整株切下，取带4～5片叶柄的茎段约5cm，将茎段冲洗、晾干，用0.6％(即6mg/mL)含氯消毒溶液(以君鸿牌消毒粉配制，其有效氯成分18～21％，w/w)振荡清洁40min。期间换一次清洁液，用去离子水冲洗干净，无菌条件下剥去2片叶柄，加入0.1％(即1mg/mL)HgCl2溶液浸泡消毒8min，用灭菌去离子水冲洗6次，约35min，吸干水分，剥取带有1～2个叶原基、直径1～2mm茎尖作为外植体。茎尖消毒成功率达到100％。
2、茎尖培养
将茎尖置于1/2MS+0.6mg/L KT+0.5mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.2g/L卡拉粉，pH 5.8～6.0的培养基中，在弱光下(6μmol·m-2·s-1)培养1周，然后转入光照强度为25～30μmol·m-2·s-1，光照时间为10h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60％的条件下培养33天。茎尖均转绿成活，形成无菌单芽。经过40天的培养，茎基部直径平均增长2.63±0.13mm。
3、丛生芽诱导
将无菌单芽转接到1/2MS+0.6mg/L 6-BA+0.02mg/L NAA+30g/L蔗糖+7.2g/L卡拉粉，pH 5.8～6.0的培养基中，在光照强度为25～30μmol·m-2·s-1，光照时间为10h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60％的条件下培养80天(2个周期)。各茎尖均能诱导出2个以上的丛生芽。
4、丛生芽增殖
将丛生芽以双芽形式接种于3/4MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L IBA+30g/L蔗糖+6.5g/L卡拉粉，pH 5.8～6.0的培养基上，每瓶4个芽团，在光照强度为25～30μmol·m-2·s-1，光照时间为10h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60％的条件下培养40天，其增殖率为3.03。
5、生根及移栽
从增殖获得的丛生芽中将株高3cm以上、具有3片叶的带根单株切下，将带根单株置于1/2MS+1.0mg/L IBA+30g/L蔗糖+7.2g/L卡拉粉+0.2g/L活性炭，pH 5.8～6.0的培养基中，在光照强度为25～30μmol·m-2·s-1，光照时间为10h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60％的条件下培养30天，生根率达到100％，置于温度为26±2℃的温室中炼苗1周后，移栽于填满泥炭基质(0～20mm)的穴盘中，在温室温度为26±2℃，空气相对湿度约为80％条件下栽培，成活率达100％。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种短消毒时间的白掌茎尖组培快繁的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）外植体选择及消毒：于8~10月切取二年生美酒白掌植株，取带4~5片叶柄的茎段，将茎段冲洗、晾干，用0.6%含氯消毒溶液振荡清洁40 min，期间换一次清洁液，用去离子水冲洗干净，无菌条件下剥去部分叶柄，加入0.1% HgCl2溶液进行消毒4~8 min，再用灭菌去离子水冲洗干净，吸干水分，剥取带有1~2个叶原基、直径为1~2 mm的茎尖作为外植体；
（2）茎尖培养：将茎尖置于1/2 MS+0.2~0.6 mg/L KT+0.1 ~0.5mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7.2 g/L卡拉粉，pH 5.8~6.0的培养基中培养，培养条件：先在6 μmol·m-2·s-1弱光下培养1周，再转入光照强度为25~30 μmol·m-2·s-1，光照时间为10 h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60 %的条件下培养33天，获得无菌单芽；
（3）丛生芽诱导：将无菌单芽转接到1/2 MS+0.6 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+7.2 g/L卡拉粉，pH 5.8~6.0的培养基中培养，培养条件：在光照强度为25~30 μmol·m-2·s-1，光照时间为10 h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60 %的条件下培养80天，获得丛生芽；
（4）丛生芽增殖：将丛生芽以双芽形式接种于3/4 MS+0.6~1 mg/L 6-BA+0.05~0.1 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L卡拉粉，pH 5.8~6.0的培养基中进行增殖培养，培养条件：在光照强度为25~30 μmol·m-2·s-1，光照时间为10 h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60 %的条件下培养40天；
（5）生根及移栽：从增殖获得的丛生芽中切下带根单株，将带根单株置于1/2 MS+0.5~1.0 mg/L IBA+30 g/L蔗糖+7.2 g/L卡拉粉+0.2 g/L活性炭，pH 5.8~6.0的培养基中进行生根培养，培养条件：在光照强度为25~30 μmol·m-2·s-1，光照时间为10 h/d，温度为24±2℃，空气相对湿度为60 %的条件下培养30天，然后在温度为24~28℃的温室中炼苗1周，移栽于填满泥炭基质的穴盘中，在温度为24~28℃，空气相对湿度为80%的温室中栽培。
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