CN116267623B - 拟美国薄荷组培繁殖方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物离体组织培养技术领域，尤其涉及一种拟美国薄荷组培繁殖方法。所述拟美国薄荷组培繁殖方法以母株上生长期20‑60天的幼嫩枝条为外植体，通过在MS培养基中添加0.05‑0.15mg/L的6‑BA和0.05‑0.15mg/L的NAA，诱导外植体腋芽萌发生长形成不定芽。不定芽诱导效果良好，且获得的不定芽在后续增殖、生根阶段的培养表现良好，无褐化和玻璃化现象，繁殖效率高，成活率高。本发明提供的拟美国薄荷组培繁殖方法有助于促进拟美国薄荷的进一步推广应用。

Description

拟美国薄荷组培繁殖方法

技术领域

本发明涉及植物离体组织培养技术领域，尤其涉及一种拟美国薄荷组培繁殖方法。

背景技术

拟美国薄荷（Monarda fistulosa），属于唇形科，美国薄荷属，一年或多年生草本植物，常用作观赏植物。由于拟美国薄荷花色新颖优美，花期长久，具有极高的园艺价值和市场前景。

拟美国薄荷的繁殖方式包括播种繁殖、扦插繁殖和分株繁殖。由于拟美国薄荷园艺栽培的种子结实率低，质量参差不齐，因此播种繁殖时间长且成苗的质量差。而扦插繁殖和分株繁殖存在繁殖系数低、繁殖周期长、病虫害积累、长期使用易导致品种退化等缺点。另外，上述传统繁殖方法受到季节更替变化的影响，只能在春秋季进行。因此，拟美国薄荷的繁殖效率低下，不利于大范围推广。

目前针对拟美国薄荷的组织培养技术的研究尚较少，而且，现有的拟美国薄荷组织培养方法的污染率和死亡率较高，繁殖效率也有待提高。有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种拟美国薄荷组培繁殖方法。所述繁殖方法可显著提高拟美国薄荷的繁殖效率，且成活率高。

具体的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种拟美国薄荷组培繁殖方法，包括外植体的消毒，以及对消毒后的外植体进行诱导培养，所述外植体选择生长20-60天的枝条；所述诱导培养在诱导培养基中进行，所述诱导培养基以MS培养基为基础培养基，添加0.05-0.15mg/L的6-BA和0.05-0.15mg/L的NAA。

现有的拟美国薄荷组织培养多采用无菌播种后长大的无菌苗作为培养材料，由于种子小不易消毒且消毒后的种子发芽率低，污染率高、死亡率高，从而导致繁殖效率低。本发明发现，不同来源的外植体会直接影响拟美国薄荷组织培养的最终结果。

本申请选择拟美国薄荷的幼嫩枝条作为外植体进行组织培养，一方面，相较选择拟美国薄荷其他部位作为外植体进行组织培养，幼嫩枝条取材对于母株的生长有促进作用，更加有利于母株的复壮，在组织培养中有助于母株的重复利用，从而提高组织培养的繁殖效率，降低组织培养的成本；另一方面，幼嫩枝条的组织细胞分裂活动旺盛，发育良好，相较于其他来源的外植体，在组织培养中表现出更高的诱导率和成功率，同时能够有效缩短组织培养过程中的诱导周期，提高增殖系数和生根率。且在诱导不定芽及不定芽增殖时，采用腋芽萌发直接形成不定芽的方法进行增殖，相较于采用其他部位的其他诱导方式得到的分化苗更加健壮，且能稳定遗传母本特性，不易变异。

在本发明中，所述外植体选择母株茎段顶部生长健壮且无病虫害的幼嫩枝条，所述幼嫩枝条在母株上的生长期为20-60天。

相较于生长期小于20天的幼嫩枝条，本发明所选枝条组织厚实，对各类消毒剂的耐受能力较强，可通过延长消毒时间来降低外植体的污染率，且延长消毒时间对枝条造成的负面影响较小，存活率明显升高。而生长期大于60天的老枝条存在纤维化加重、叶片细胞代谢活动减弱的问题，且不容易消毒，污染率较高，诱导成功率明显下降，诱导时间长，增殖系数降低，且存在植物生理紊乱失调、产生畸形等问题。添加较高浓度的细胞分裂素和生长素虽然能在一定程度上缩短诱导时间，但会产生更为严重的植物生理紊乱失调情况，且会增加生成成本。本发明所选生长期为20-60天的幼嫩枝条，其细胞代谢活动旺盛、分裂能力强，枝条内各类激素浓度较高，在使用较低浓度的细胞分裂素和生长素即可成功诱导出不定芽，可有效避免因各类激素过高引起的玻璃化及其他不良反应。且生长期为20-60天的幼嫩枝条自身存在时间较短，受外界干扰较小，有助于降低拟美国薄荷组织培养的污染率。

在本发明的一些实施方式中，所述茎段顶部的幼嫩枝条在母株上的生长期可以为20天、40天、60天。

在本发明的一些实施方式中，所述茎段顶部的幼嫩枝条在母株上的生长期可以为20-40天。

在本发明的一些实施方式中，所述茎段顶部的幼嫩枝条在母株上的生长期可以为40-60天。

优选的，所述幼嫩枝条为母株上生长期为20-40天的枝条。

以上述幼嫩枝条为外植体进行拟美国薄荷的组织培养，能够有效提高拟美国薄荷的繁殖效率和成活率，降低季节对拟美国薄荷生产的限制，促进拟美国薄荷的推广应用。

除了外植体的选取，诱导培养基的成分，尤其是激素的种类和浓度，也对拟美国薄荷组织培养的最终结果有直接且重要的影响。

本发明发现，较低浓度的植物激素组合对拟美国薄荷幼嫩枝条的诱导效果更好。低浓度的6-BA有助于促进拟美国薄荷外植体细胞分裂；低浓度的NAA有助于促进拟美国薄荷细胞生长伸长及细胞分裂。

进一步的，当诱导培养基中包含0.05-0.15mg/L的6-BA和0.05-0.15mg/L的NAA时，拟美国薄荷的外植体细胞得到了更好的增殖和扩大效果，外植体上的腋芽可在较短时间内诱导萌发伸长形成不定芽，且不定芽生长健壮，无褐化，无玻璃化。另外，上述低浓度的6-BA和NAA组合还有助于降低外植体的死亡率，相较其他的激素浓度或激素组合，具有明显优势。优选的，所述诱导培养基中包含0.05-0.1mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA。进一步的，在本发明所述诱导培养基中，所述6-BA和所述NAA的用量比例优选为（0.8-1.2）:1，更优选为1:1。

当6-BA和NAA的用量比小于上述范围时，以幼嫩枝条外植体诱导的不定芽在后续培养中表现较差，增殖系数较低，且获得的分化苗长势一般，植株稍弱。当6-BA和NAA的用量比大于上述范围时，获得的不定芽及分化苗玻璃化严重。

在本发明更优选的实施方式中，所述诱导培养基中包含0.1mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA。

本发明所述诱导培养基中优选不添加2,4-D。本发明发现，添加2,4-D容易使诱导的不定芽玻璃化，且容易导致不定芽在后续发育过程中生理紊乱失调，出现畸形。不添加2,4-D的诱导培养基对外植体的不定芽诱导效果更好。

本发明所述诱导培养基中优选不添加TDZ。本发明发现，添加TDZ容易使诱导的不定芽玻璃化，不添加TDZ的诱导培养基对外植体的不定芽诱导效果更好。

在本发明中，所述诱导培养的光照时间优选为8-10h/天，光照强度优选为1500-1800Lux；所述诱导培养的温度优选为23-27℃。上述诱导培养条件有助于诱导培养获得更好的效果。

进一步的，本发明选择生长35-45天的枝条作为外植体，并对外植体进行消毒。所述消毒依次包括新洁尔灭消毒、酒精消毒和次氯酸钠消毒。

优选的，所述次氯酸钠消毒采用0.8%-1.2%浓度的次氯酸钠溶液进行处理。

优选的，所述次氯酸钠消毒采用0.95%-1.05%浓度的次氯酸钠溶液进行处理。

优选的，所述次氯酸钠消毒采用1%浓度的次氯酸钠溶液进行处理。

优选的，所述次氯酸钠溶液消毒处理的时间为10-20min。

优选的，所述次氯酸钠溶液消毒处理的时间为14-16min。

优选的，所述次氯酸钠溶液消毒处理的时间为15min。

在上述消毒方法中，新洁尔灭浸泡消毒可以降低菌体的表面张力，产生一定的清洁作用；另外，还能吸附于细菌表面，改变菌体细胞膜的通透性，使菌体内的酶、辅酶和中间代谢产物溢出，阻碍细菌的呼吸和糖酵解的过程，使菌体蛋白变性，起到一定的杀菌作用。酒精浸泡消毒可杀灭少量附着在材料表面的病原体，有效排除外植体表面可能附带的污染源的干扰，并可有效增加消毒剂对外植体材料表面的浸透性，进一步提高外植体消毒的成功率。次氯酸钠属于高效的含氯消毒剂，且相较于氯化汞、次氯酸钠等对环境的污染较小，操作更安全。次氯酸钠在水中形成分子量小且不带电荷的次氯酸，不仅可与细胞壁发生作用，且能侵入细胞内与蛋白质发生氧化作用或破坏其磷酸脱氢酶，使糖代谢失调而致细胞死亡，有效杀死病原菌，进一步提高外植体消毒的成功率。

在本发明优选的实施方案中，所述消毒先用1%新洁尔灭消毒14-16min，再用75%酒精消毒40-80s，最后使用0.95%-1.05%的次氯酸钠消毒剂消毒14-16min。其中，新洁尔灭和酒精都具有较强的浸润作用，能够排除外植体表面的空气，利于消毒剂的渗入，从而提高消毒剂对外植体材料表面的浸透性，提高消毒剂的消毒效果。本发明在新洁尔灭、酒精消毒和消毒剂消毒的配合下，可提高外植体消毒的成功率。本发明在利用次氯酸钠对外植体消毒时要严格控制浸泡时间和使用浓度，方能保证消毒效果的同时避免对外植体后续发育造成不良影响。

进一步的，本发明所述拟美国薄荷组培繁殖方法还包括在所述诱导培养后的增殖培养；所述增殖培养在增殖培养基中进行，所述增殖培养基优选以MS培养基为基础培养基，添加0.05-0.15mg/L的6-BA和0.05-0.15mg/L的NAA。

更优选的，所述增殖培养基以MS培养基为基础培养基，添加0.1mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA。

在本发明中，所述诱导培养的时间优选≤30天；和/或，所述增殖培养的时间优选为25-35天。

进一步的，本发明所述拟美国薄荷组培繁殖方法还包括在所述增殖培养后的生根培养；所述生根培养在生根培养基中进行，所述生根培养基优选以1/2MS培养基为基础培养基，添加0.05-0.15mg/L的IBA和0.2-0.4g/L的活性炭。

本发明发现，诱导不定芽生根的培养基中IBA和活性炭的添加对生根有很大影响。当添加上述用量的IBA和活性炭时，拟美国薄荷的生根率可达到100%，且生根速度快，成活率高。

更优选的，所述生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加0.1mg/L的IBA和0.3g/L的活性炭。上述浓度的IBA可有效促进拟美国薄荷生根。活性炭的加入能吸附不定芽代谢产物，增强培养基的通透性。相较于不使用IBA和活性炭的培养基，本申请提供的生根培养基可以使不定芽100%生根，且用时较短。进而有助于提高拟美国薄荷的繁殖效率和成活率。

在本发明进一步优选的实施方案中，所述拟美国薄荷的组织培养方法包括母本的养护及外植体的选择、外植体的清洗及消毒、不定芽的诱导、不定芽的增殖、不定芽的生根。

优选的，所述母本的养护及外植体的选择中，供试母本应无病虫害，生长健壮，定期修剪；外植体选取无病虫害，生长健壮的幼嫩枝条。

优选的，所述外植体的清洗及消毒中，采集后的外植体先用流水冲洗30min，冲洗掉表面灰尘，放入超净工作台。然后依次用1%新洁尔灭消毒15min，用无菌水涮洗4-5次；再用75%酒精消毒1min，无菌水涮洗4-5次；最后用0.8%-1.2%次氯酸钠消毒15min，无菌水涮洗4-5次。

优选的，所述不定芽的诱导中，所用的培养基配方为：MS+糖25-30g/L+琼脂4.5-5g/L+6-BA 0.05-0.1mg/L+NAA 0.1mg/L，PH值5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照时间8-10h/天，光照强度1500-1800Lux。

优选的，所述不定芽的诱导中，将消毒好的外植体稍微晾干表面水分或用消毒后的滤纸吸干表面水分，切去伤口位置，然后切成每段带有1-2片叶子的茎段，直立接种于培养基上。

优选的，所述不定芽的增殖中，所用的培养基配方与不定芽诱导配方一致，培养条件一致。

优选的，所述不定芽的增殖中，将叶腋处生长出的不定芽切下，切成带1-2片叶子的茎段，直立接种于培养基上。

在本发明中，所述不定芽的增殖采用腋芽萌发快速伸长的方式，优选将腋芽按照1段带2个腋芽的标准切成茎段继续扩繁。此种扩繁方式的繁殖系数较高，腋芽萌发抽生数量乘以每个小枝条的节间数量（带芽点数），通常每段萌发1-3条，每条2-5个节间（枝条少则节间多，枝条多则节间少）。培养30天左右繁殖系数通常在4-6之间。

优选的，所述不定芽的生根中，所用的培养基配方为：1/2MS+糖25-30g/L+琼脂4.5-5g/L+IBA 0.1mg/L+AC（活性炭）0.3-0.5g/L，PH5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照时间8-10h/天，光照强度1500-1800Lux。

优选的，所述不定芽的生根中，将增殖的不定芽切下直立接种于生根培养基中。

通过采用上述技术方案，本发明在进行拟美国薄荷的组织培养中，选择生长健壮且无病虫害的母株的幼嫩枝条作为外植体，并提供了诱导外植体形成不定芽步骤、不定芽增殖步骤以及诱导不定芽生根步骤中所用的培养基配方。本申请提供的拟美国薄荷的组织培养方法，能够提高拟美国薄荷的繁殖效率，降低季节对拟美国薄荷生产的限制，为目前尚处于空白的拟美国薄荷植物组织培养领域提供了新的尝试。

第二方面，本发明提供了一种用于拟美国薄荷组织培养的培养基，所述培养基包括诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；

所述诱导培养基和所述增殖培养基分别以MS培养基为基础培养基，添加0.05-0.15mg/L的6-BA和0.05-0.15mg/L的NAA；

所述生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加0.05-0.15mg/L的IBA和0.2-0.4g/L的活性炭。

第三方面，本发明提供上述培养基在拟美国薄荷组织培养中的应用。

有益效果

本发明提供了一种拟美国薄荷组培繁殖方法，所述拟美国薄荷组培繁殖方法以母株上生长期20-60天的幼嫩枝条为外植体，通过在MS培养基中添加0.05-0.15mg/L的6-BA和0.05-0.15mg/L的NAA，诱导外植体腋芽快速萌发生长形成不定芽。本发明提供的方法选用特定的外植体，在诱导外植体形成不定芽的培养基以及适宜的培养环境的共同作用下，作为外植体的幼嫩枝条的腋芽萌发伸长，形成不定芽。利用上述形成的不定芽进行后续增殖培养和生根培养，增殖系数较高，分化苗生长状况良好，无褐化、无玻璃化。

本发明提供的拟美国薄荷组培繁殖方法有助于提高拟美国薄荷的繁殖效率和生根苗质量，降低季节对该品种生产的限制，解决了其他繁殖方式产生的生根苗质量参差不齐的问题。有助于促进拟美国薄荷的进一步应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图进行说明。

图1是本发明实施例1中诱导外植体形成不定芽的照片。

图2是本发明实施例1中不定芽增殖的照片。

图3是本发明实施例1中不定芽生根的照片。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合具体实施方式及附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

以下实施例中使用的新洁尔灭为有效成分苯扎溴铵27g/L-33g/L的500mL溶液，购自山东利尔康医疗科技股份有限公司；酒精为欧洁75%消毒酒精500mL，购自杭州欧拓普生物技术有限公司；次氯酸钠为有效氯含量10.0%的500mL溶液，购自天津市致远化学试剂有限公司；预防性消毒剂为国光50%多菌灵，购自四川润尔科技有限公司。

本申请中用到的拟美国薄荷母株选自北京花乡花卉科技研究所有限公司。

本申请提供了一种拟美国薄荷的组织培养方法，具体包括以下步骤：

1.母本的养护与外植体的选择：

（1）母本的养护：将母本与其它品种隔离开，放置于温室中的单独区域培养30-60天，生长过程中及时去除枯叶病叶，并每15天喷洒一次预防性杀菌剂；要定期修剪，保证外植体的最佳取材状态；

（2）外植体的选择：选择上述母本中生长健壮、性状表现良好且无病虫害的母株，取母株上生长时间20-60天的幼嫩枝条；

2.外植体的清洗与消毒：

（1）冲洗：采集后的外植体先用流水冲洗30min，冲洗掉表面灰尘，然后放入超净工作台内晾干。

（2）新洁尔灭消毒：晾干后切成4-5cm的茎段，用1%新洁尔灭震荡消毒15min，然后用无菌水涮洗4-5次，每次1-2min；

（3）酒精消毒：然后用75%酒精震荡消毒1min，无菌水涮洗4-5次，每次1-2min；

（4）次氯酸钠消毒：最后用1%次氯酸钠震荡消毒15min，无菌水涮洗4-5次，每次1-2min，稍微晾干水分。

（5）将消毒后的茎段的两端切除，形成1.5-2cm带芽点的茎段，得到消毒后的外植体。

3.诱导外植体形成不定芽：

将上述消毒后的外植体直立接种到诱导分化的培养基上，诱导外植体形成不定芽；诱导外植体形成不定芽的培养基配方为：MS培养基，6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.05-0.1mg/L，NAA(萘乙酸)0.1mg/L，蔗糖25-30g/L，琼脂4-4.5g/L，pH值在5.8-6.0；培养温度为23-27℃，光照强度为1500-1800Lux，光照时长为8-10h/天。

4.不定芽增殖：

将上述诱导形成的不定芽从之前的茎段上切离，切成2-3厘米的带芽点的茎段，将切好的茎段直立接种到诱导不定芽增殖的培养基上；诱导不定芽增殖的培养基配方和培养条件与诱导不定芽的一样。

5.诱导不定芽生根：

将上述增殖获得的不定芽切离成单独的不定芽，并将单个不定芽接种到诱导不定芽生根的培养基上；诱导不定芽生根的培养基配方为：1/2MS培养基，IBA（吲哚丁酸）0.1mg/L，AC(活性炭)0.3g/L，蔗糖25-30g/L，琼脂4-4.5g/L，pH值在5.8-6.0；培养温度为23-27℃，光照强度为1500-1800Lux，光照时长为8-10h/天。

以下结合附图以及实施例1-5、对比例1-11的相关数据及对比结果，对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

本实施例提供了一种拟美国薄荷的组织培养方法，具体包括以下步骤：

1.母本的养护与外植体的选择：

（1）母本的养护：将母本与其它品种隔离开，放置于温室中的单独区域培养45天，生长过程中及时去除枯叶病叶，并每15天喷洒一次预防性杀菌剂；要定期修剪，保证外植体的最佳取材状态；

（2）外植体的选择：选择上述母本中生长健壮、性状表现良好且无病虫害的母株，取母株上生长时间40天的幼嫩枝条；

2.外植体的清洗与消毒：

（1）冲洗：采集后的外植体先用流水冲洗30min，冲洗掉表面灰尘，然后放入超净工作台内晾干。

（2）新洁尔灭消毒：晾干后切成5cm的茎段，用1%新洁尔灭震荡消毒15min，然后用无菌水涮洗5次，每次1-2min；

（3）酒精消毒：然后用75%酒精震荡消毒1min，无菌水涮洗5次，每次1min；

（4）次氯酸钠消毒：最后用1%次氯酸钠震荡消毒15min，无菌水涮洗4次，每次2min，稍微晾干水分。

（5）将消毒后的茎段的两端切除，形成2cm带芽点的茎段，得到消毒后的外植体。

3.诱导外植体形成不定芽：

将上述消毒后的外植体直立接种到诱导分化的培养基上，诱导外植体形成不定芽；诱导外植体形成不定芽的培养基配方为：MS培养基，6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)0.1mg/L，NAA(萘乙酸)0.1mg/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在6.0；培养温度为25℃，光照强度为1800Lux，光照时长为10h/天。

4.不定芽增殖：

将上述诱导形成的不定芽从之前的茎段上切离，切成2-3厘米的带芽点的茎段，将切好的茎段直立接种到诱导不定芽增殖的培养基上；诱导不定芽增殖的培养基和培养条件与诱导不定芽的一样。

5.诱导不定芽生根：

将上述增殖获得的不定芽切离成单独的不定芽，并将单个不定芽接种到诱导不定芽生根的培养基上；诱导不定芽生根的培养基配方为：1/2MS培养基，IBA（吲哚丁酸）0.1mg/L，AC(活性炭)0.3g/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在6.0；培养温度为25℃，光照强度1800Lux，光照时长为10h/天。

上述各步骤涉及的条件参数以及用到的培养基配方如表1和表2所示。

实施例2-3

实施例2-3提供一种拟美国薄荷的组织培养方法，其与实施例1的步骤流程相同，区别之处在于部分步骤的条件参数和用到的培养基配方，具体如表2所示。除表2中列出的条件参数和培养基外，实施例2-3的方法步骤与实施例1均相同。

实施例4-5

实施例4-5分别提供一种拟美国薄荷的组织培养方法，其与实施例1的区别之处在于作为外植体的茎段顶部的幼嫩部分在母株上的生长期，具体如表3所示。除表3中列出的条件参数外，实施例4-5的方法步骤与实施例1均相同。

对比例1-8

对比例1-8分别提供了一种拟美国薄荷的组织培养方法，其与实施例1的区别之处在于部分步骤的条件参数和用到的培养基配方，具体如表1、2所示。除表1、2中列出的条件参数和培养基外，对比例1-8的方法步骤与实施例1均相同。

对比例9-11

对比例9-11分别提供一种拟美国薄荷的组织培养方法，其与实施例1的区别之处在于外植体的选材以及消毒、接种步骤，具体如表3所示。除表3中列出的条件参数外，对比例9-11的方法步骤与实施例1均相同。

表1 实施例1和对比例1-4各步骤涉及的参数和涉及的培养基配方

表2 实施例1-3和对比例5-8各步骤涉及的参数和涉及的培养基配方

表3 实施例1、实施例4-5、对比例9-11的外植体选材及消毒和接种步骤

实验例

利用实施例1-5以及对比例1-11提供的拟美国薄荷组织培养方法进行培养，记录各阶段培养物在相应培养过程中的考察参数，并计算拟美国薄荷的污染率、死亡率、诱导率、增殖系数和生根率，具体的考察参数和记录结果如表4所示。同时，记录拟美国薄荷的培养过程中外植体的消毒效果、形成不定芽的质量情况，具体记录结果如表5所示。

表4 拟美国薄荷的组织培养的结果（1）

表5 拟美国薄荷的组织培养的结果（2）

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结合实施例1-5以及对比例1-11的组织培养方法以及表4和表5的内容，本申请选择母株上生长期为20-60d的枝条作为外植体，同时在各组织培养阶段选择合适的培养基配方和培养条件，进行拟美国薄荷的组织培养，不仅提高了拟美国薄荷外植体的消毒成功率，而且缩短了诱导周期，提高了不定芽增殖倍率。同时，拟美国薄荷的生根效果较好，进而提高了拟美国薄荷的繁殖效率，降低季节对该品种生产的限制，从而促进拟美国薄荷的应用。

首先，选择合适的母株部位作为外植体来进行拟美国薄荷的组织培养，能够直接影响拟美国薄荷组织培养的最终结果。对比实施例1、实施例4-5和对比例9-11的培养结果，在相同组织培养条件和无病虫害的要求下，本申请实施例1选择的外植体为母株上生长期为40d的枝条，而对比例9-11选择的外植体分别为母株上生长期为10d的幼嫩枝条、母株上生长期为80d的老枝条、母株上生长期为40d的叶片。通过表4和表5可知，利用实施例1、实施例4-5的组织培养方法获得的污染率为5%，死亡率分别为10%、12%和10%，诱导获得大量不定芽，不定芽生长迅速，无玻璃化现象，且分化苗长势较好，植株茁壮，增殖率正常；而利用对比例9-11的组织培养方法获得的污染率分别为5%、15%、10%，死亡率分别为30%、20%、10%，但对比例9形成的不定芽细弱，部分玻璃化；对比例10形成的不定芽畸形卷曲，生长缓慢；对比例11有大量愈伤组织形成，但培育60天，仍未形成分化苗。

由上述可知，外植体的选择对植物组织培养的效果影响较大，选择合适的母株部位作为外植体来进行植物组织培养，能够提高拟美国薄荷组织培养的效果。本申请选择母株上生长期为20-60d的枝条作为拟美国薄荷的组织培养的外植体，能够有效降低植物组织培养过程中拟美国薄荷的污染率和死亡率，提高拟美国薄荷的诱导率、增殖系数和生根率，缩短拟美国薄荷形成不定芽的诱导时间。

另外，拟美国薄荷组织培养各阶段选择的培养基配方和培养条件也能够影响拟美国薄荷组织培养的结果，尤其是诱导外植体形成不定芽步骤中植物激素的选择。对比实施例1-3，对比例5和对比例6-8的培养结果，实施例1诱导外植体形成不定芽中采用的植物激素是低浓度的6-BA和NAA的组合。对比例5无激素添加，对比例6-8则是相对高浓度的6-BA和NAA的组合，6-BA和NAA的比值≥2。其中，对比例7诱导外植体形成不定芽中采用的植物激素中还进一步添加了2,4-D。对比例8诱导外植体形成不定芽中采用的植物激素中还进一步添加了TDZ。通过表4和表5可知，利用实施例1-3的组织培养方法获得的污染率和死亡率分别为5%、8%、10%和10%，可诱导大量不定芽形成，不定芽生长迅速，无玻璃化现象，且分化苗长势较好，植株茁壮，增殖率正常。对比例5可诱导形成不定芽，植株较健壮，但生长缓慢，增殖率稍低。污染率和死亡率分别为5%和20%。对比例6的污染率和死亡率分别为5%和10%，其虽然可形成不定芽，但部分玻璃化。对比例7的组织培养方法获得的污染率为15%，死亡率为15%，但对比例7只形成了少量不定芽分化，且长势较弱，部分玻璃化且畸形，增殖率低，且成品率极低。对比例8的组织培养方法获得的污染率为10%，死亡率为10%，但对比例8形成的不定芽多数玻璃化，增殖率一般，且成品率极低。

由上述可知，诱导外植体形成不定芽步骤中植物激素的选择对植物组织培养的效果也有较大影响，本申请选择较低浓度的6-BA和NAA的组合作为诱导外植体形成不定芽中所用培养基的植物激素，能够提高拟美国薄荷组织培养中诱导形成的不定芽质量，且能诱导出大量不定芽，同时提高拟美国薄荷的诱导率和增殖系数，缩短拟美国薄荷形成不定芽的诱导时间。可知，在诱导外植体形成不定芽步骤中，低浓度的6-BA和NAA的组合提高了拟美国薄荷的繁殖效率，降低季节对拟美国薄荷生产的限制。

再者，外植体的获取和消毒步骤中，消毒浓度和时长对外植体的消毒效果有较大的影响，选择合适的外植体消毒浓度和时长对拟美国薄荷的组织培养效果有较大影响。对比例3、实施例1和对比例4的消毒浓度分别是0.8%、1%、1.2%，消毒时长为15min。通过表4和表5可知，对比例3、实施例1和对比例4的污染率分别为60%、5%、2%，死亡率分别为5%、10%、80%。对比例3有较多不定芽形成，不定芽生长迅速，无玻璃化现象，分化苗长势较好，植株茁壮。对比例4多数外植体失绿发黄，部分外植体褐化死亡，有大量不定芽形成，不定芽生长迅速，但部分苗有褐化现象。而实施例1有大量不定芽形成，不定芽生长迅速，无玻璃化现象，且分化苗长势较好，植株茁壮，增殖率正常。同一浓度但不同消毒时长也会对组织培养效果有很大影响。对比实施例1和对比例1-2的培养结果，对比例1-2的污染率和死亡率分别为25%、3%和5%、60%。而实施例1的污染率和死亡率分别为5%、10%。

由上述可知，利用1%次氯酸钠对外植体进行消毒时，将消毒时长控制在10-15min内，消毒后外植体表现正常。当消毒时长较长时，组织培养过程中的污染率越低，消毒效果较佳，但会导致外植体死亡率升高，表明外植体不能长时间处于次氯酸钠溶液中。当消毒时间越短时，外植体基本不会死亡，但外植体的污染率会显著升高，显然低于消毒时间较长时的消毒效果。因此，本申请最终将外植体的消毒时长控制在10-15min的范围内，最佳的消毒时长为15min。

最后，诱导不定芽生根的培养基中IBA和活性炭的添加对生根有很大影响。通过对比实施例1和对比例5-8可以发现，添加了适量IBA和活性炭的实施例1，生根率100%，生根快，且生根效果好。而没有添加IBA和活性炭的对比例5、6、8则只有70%生根率，且生根速度慢。

综上所述，本申请提供的拟美国薄荷的组织培养方法，外植体选择母株上生长期为20-60d的枝条，取材容易，且有利于母株更新复壮。外植体诱导成功率高，且能够直接诱导出不定芽，且苗更加健壮，容易稳定遗传母本特性，不易变异。缩短了诱导周期，提高了不定芽增殖系数。进一步的，所述不定芽在本发明提供的生根培养基中具有较好的生根效果，生根率达百分之百，能提高拟美国薄荷的繁殖效率和生根苗质量，降低季节对该品种生产的限制。本发明提供的拟美国薄荷组培繁殖方法解决了其他繁殖方式产生的生根苗质量参差不齐的问题，有助于促进拟美国薄荷的推广应用。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，便于具体和详细地理解本发明的技术方案，但并不能因此而理解为对发明专利保护专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.拟美国薄荷组培繁殖方法，包括外植体的消毒，以及对消毒后的外植体进行不定芽诱导培养，其特征在于，所述外植体选择生长20-60天的枝条；所述诱导培养在诱导培养基中进行，所述诱导培养基以MS培养基为基础培养基，添加0.05-0.15mg/L的6-BA和0.05-0.15mg/L的NAA；所述6-BA和所述NAA的用量比例为（0.8-1.2）:1；

所述外植体的消毒依次包括新洁尔灭消毒、酒精消毒和次氯酸钠消毒；

所述次氯酸钠消毒采用0.8%-1.2%的次氯酸钠溶液消毒处理10-20min；

所述拟美国薄荷组培繁殖方法还包括在所述不定芽诱导培养后的不定芽增殖培养；所述不定芽增殖培养在增殖培养基中进行，所述增殖培养基的配方与所述诱导培养基的配方一致；

所述拟美国薄荷组培繁殖方法还包括在所述不定芽增殖培养后的生根培养；所述生根培养在生根培养基中进行，所述生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加0.05-0.15mg/L的IBA和0.2-0.4g/L的活性炭。

2.根据权利要求1所述拟美国薄荷组培繁殖方法，其特征在于，所述诱导培养的光照时间为8-10h/天，光照强度为1500-1800Lux；和/或，所述诱导培养的温度为23-27℃。

3.根据权利要求1所述拟美国薄荷组培繁殖方法，其特征在于，所述外植体选择生长35-45天的枝条。

4.根据权利要求1所述拟美国薄荷组培繁殖方法，其特征在于，所述次氯酸钠消毒采用0.95%-1.05%的次氯酸钠溶液消毒处理14-16min。

5.根据权利要求1所述拟美国薄荷组培繁殖方法，其特征在于，所述不定芽诱导培养的时间≤30天；和/或，所述不定芽增殖培养的时间为25-35天。

6.培养基在拟美国薄荷组织培养中的应用，其特征在于，所述培养基包括诱导培养基、增殖培养基和生根培养基；

所述诱导培养基和所述增殖培养基分别以MS培养基为基础培养基，添加0.05-0.15mg/L的6-BA和0.05-0.15mg/L的NAA；所述6-BA和所述NAA的用量比例为（0.8-1.2）:1；

所述生根培养基以1/2MS培养基为基础培养基，添加0.05-0.15mg/L的IBA和0.2-0.4g/L的活性炭；

所述培养基在拟美国薄荷组织培养中的应用包括：使用权利要求1所述方法进行拟美国薄荷的组培繁殖。