CN107568065A - 一种毛汉十二卷离体培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毛汉十二卷离体培养方法，以毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体，建立了初代培养，继代培养，生根培养的离体快繁方法体系；采用本发明方法，可以叶片为外植体，降低了取材难度；克服芽诱导过程中外植体褐变及死亡等问题，提高了愈伤组织诱导率及再生苗生长状况，获取数量多、质量好的丛生芽，减少了增殖时间，提高了增殖倍数，无褐化，无污染，再生苗健壮，无徒长，满足了工厂化生产的需求。

Description

一种毛汉十二卷离体培养方法

技术领域

本发明属于无性繁殖技术领域，具体涉及一种毛汉十二卷离体培养方法，尤其涉及一种毛汉十二卷“稻妻”的离体培养方法。

背景技术

毛汉十二卷(Haworthia maughanii)，也称万象，肉质叶从基部斜出，排成松散的莲座状，叶片半圆筒形，顶端截形，半透明，依品种的差异，有不同的花纹，叶色深绿、灰绿或红褐，表面粗糙。毛汉十二卷喜温暖干燥和阳光充足环境。不耐寒，怕高温和强光，耐半阴。以疏松、排水良好的沙壤土为好。冬季温度不低于10℃。

目前，关于十二卷属植物离体组织培养快速繁殖的报道，多数采用植物花葶作为外植体，虽然容易获得再生芽，但实际操作中，植物体从幼苗到开花需要的时间较长，导致取得外植体周期较长，难度较大；同时，在离体诱导培养中，多采取连续强光下培养，并且转接周期较长，多为一个月；伴随着较高的褐化率和污染率，不能适应现在市场的需求。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种毛汉十二卷离体培养方法，该方法可以高效地培养毛汉十二卷“稻妻”。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种毛汉十二卷离体培养方法，包括以下步骤：

(1)初代培养：选择毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体，清洗消毒后，将叶片基部切除后，剪成小块接种于愈伤组织诱导培养基上在培养室适宜条件下培养；

(2)继代培养：将愈伤组织诱导出来后，将愈伤组织接种于增殖分化培养基中培养得到再生苗；

(3)生根培养：将再生苗转入生根培养基进行生根培养，获得试管苗；

(4)驯化移栽：将试管苗取出，清洗消毒后，栽入营养土中进行驯化移栽。

其中，步骤(1)中外植体的清洗消毒步骤为：采集的外植体经过洗衣粉清洗，流水冲洗，然后用纱布包裹起来，放在冰箱4℃条件下预冷48h(预冷的目的是降低污染率)，然后将外植体转到无菌操作台上，先用酒精消毒，用无菌水冲洗，再用氯化汞或者次氯酸钠消毒，用无菌水冲洗。

其中，步骤(1)中所述适宜条件为温度25±2℃，在红光：蓝光＝1:1的光照条件下培养30-60天。

红光和蓝光可加速初代愈伤组织的诱导，一般常规的传统方法需要三个月。

其中，步骤(2)中所述接种于增殖分化培养基中培养的步骤为：在温度25±2℃的培养室中，光强为2000-5000lux的连续强光下培养20-30天，每日光照时间8-24小时，之后每隔20-30天转接一次。

其中，步骤(1)和(2)中所述愈伤组织诱导培养基和增殖分化培养基均为MS培养基，成分为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0-3mg/L、激动素(KT)0-3mg/L、萘乙酸(NAA)0-1mg/L、3-吲哚乙酸(IAA)0-1mg/L、琼脂4-8g/L、蔗糖5-40g/L，pH值调至5.6-6.0。

其中，步骤(3)中所述生根培养基为1/2MS培养基、MS培养基中的一种，成分为萘乙酸(NAA)0-2mg/L、3-吲哚丁酸(IAA)0-2mg/L、琼脂4-8g/L、蔗糖5-40g/L、培养基pH值调至5.6-6.0。

其中，步骤(4)中所述清洗消毒的步骤为：将根长至1cm以上的试管苗取出清洗干净，用消毒剂浸泡0.1-10小时后，放在通风处晾干，栽入营养土中。

其中，上述消毒剂为高锰酸钾或者多菌灵。

其中，上述营养土为泥炭土，椰槺，蛭石，沙土，珍珠岩，麦饭石、赤玉土中的一种或几种的组合。

有益效果：与现有方法相比，本发明方法具备以下优点：本发明以毛汉十二卷的叶片为外植体，降低了取材难度；在初代培养时采用弱光下培养，将继代培养中的转接时间缩短，提高了增殖倍数，减少了增殖时间，无褐化，无污染，再生苗健壮，无徒长，满足了工厂化生产的需求。

具体实施方式

实施例1：

选取毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体，通过外植体无菌处理后，将外植体接种于初代培养愈伤组织诱导培养基上，置于合适的温度、湿度和光照强度条件下进行培养，诱导愈伤组织，具体步骤为：

1、初代培养：选择毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体，经过洗衣粉清洗，流水冲洗1小时，将外植体转到无菌操作台上，先用75％酒精消毒10秒，用无菌水冲洗1次，再用0.1％氯化汞消毒5min或者用15％次氯酸钠消毒15min，再用无菌水冲洗4次后，将叶片基部切除后，剪成1cm²的小块接种于愈伤组织诱导培养基上，每瓶接一块。愈伤组织诱导培养基为MS培养基，成分为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg/L、激动素(KT)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.1mg/L、6g/L琼脂、20g/L蔗糖；培养基pH值调至5.8。将接种后的外植体放在培养室适宜条件下培养。条件为温度25±2℃，在红光：蓝光＝1:1的光照条件下培养60天，愈伤组织诱导率100％，污染率为0，褐化率为0。

2、继代培养：愈伤组织诱导出来后，将愈伤组织转入增殖分化培养基，培养基为MS培养基，成分为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5mg/L、激动素(KT)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.01mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.01mg/L、6g/L琼脂、30g/L蔗糖；培养基pH值调至5.8。将转接后的愈伤组织放在培养室适宜条件下培养，条件为温度25±2℃，在光强为3000lux的连续强光(红光：蓝光＝1:1)下培养30天，每日光照时间12小时。以后每隔30天转接一次。再生苗生长健壮，颜色翠绿，无玻璃化现象，增殖倍数达到10.5。

3、生根培养：将苗高达到1cm以上的再生苗转入生根培养基进行生根培养得到试管苗，生根培养基为1/2MS培养基，成分为萘乙酸(NAA)0.5mg/L、琼脂6g/L、蔗糖30g/L；培养基pH值调至5.8，生根率95.2％。

4、驯化移栽：将根长至1cm以上的试管苗取出清洗干净，用0.1％高锰酸钾浸泡后，放在通风处晾干，栽入营养土中。浸泡时间为0.5小时。营养土采用泥炭土：蛭石：珍珠岩：赤玉土＝1:1:1:1，移栽成活率达96.2％。

实施例2：

选取毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体，通过外植体无菌处理后，将外植体接种于初代培养愈伤组织诱导培养基上，置于合适的温度、湿度和光照强度条件下进行培养，诱导愈伤组织，具体步骤为：

1、初代培养：选择毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体，经过洗衣粉清洗，流水冲洗2小时，将外植体转到无菌操作台上，先用75％酒精消毒20秒，用无菌水冲洗2次，再用0.1％氯化汞消毒3min，再用无菌水冲洗,6次后，将叶片基部切除后，剪成2cm²的小块接种于愈伤组织诱导培养基上，每瓶接一块。愈伤组织诱导培养基为MS培养基，成分为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg/L、激动素(KT)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.1mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.1mg/L、7g/L琼脂、20g/L蔗糖；培养基pH值调至5.6。将接种后的外植体放在培养室适宜条件下培养，条件为温度25±2℃，在红光：蓝光＝1:1的光照条件下培养45天,愈伤组织诱导率56.2％，污染率为0，褐化率为15.5％。

2、继代培养：愈伤组织诱导出来后，将愈伤组织转入增殖分化培养基，培养基为MS培养基，成分为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg/L、萘乙酸(NAA)0.01mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.01mg/L、6g/L琼脂、30g/L蔗糖；培养基pH值调至5.8。将转接后的愈伤组织放在培养室适宜条件下培养，条件为温度25±2℃，在强光(红光：蓝光＝1:1)为5000lux的连续强光下培养30天，每日光照时间18小时。以后每隔30天转接一次。再生苗增殖倍数达到16.5，生长部分畸形，部分苗出现玻璃化现象。

3、生根培养：将苗高达到1cm以上的再生苗转入生根培养基进行生根培养得到试管苗，生根培养基为MS培养基，成分为萘乙酸(NAA)0mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L、6g/L琼脂、30g/L蔗糖；培养基pH值调至5.8；生根率为72.8％，新生根健壮。

4、驯化移栽：将根长至1cm以上的试管苗取出清洗干净，用0.1％高锰酸钾浸泡后，放在通风处晾干，栽入营养土中。浸泡时间为1小时。营养土采用纯椰糠，移栽成活率达76.2％。

实施例3：

选取毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体，通过外植体无菌处理后，将外植体接种于初代培养愈伤组织诱导培养基上，置于合适的温度、湿度和光照强度条件下进行培养，诱导愈伤组织，具体步骤为：

1.初代培养：选择毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体，经过洗衣粉清洗，流水冲洗2小时，将外植体转到无菌操作台上，先用75％酒精消毒30秒，用无菌水冲洗2次，再用0.1％氯化汞消毒8min，再用无菌水冲洗6次后，将叶片基部切除后，剪成1-2cm²的小块接种于愈伤组织诱导培养基上，每瓶接一块。愈伤组织诱导培养基为MS培养基，成分为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg/L、激动素(KT)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.5mg/L、7g/L琼脂、20g/L蔗糖；培养基pH值调至5.6。将接种后的外植体放在培养室适宜条件下培养，条件为温度25±2℃，在红光：蓝光＝1:1的光照条件下培养45天,愈伤组织诱导率23.5％，污染率为0，褐化率为35.1％，死亡率为41.4％。

2.继代培养：愈伤组织诱导出来后，将愈伤组织转入增殖分化培养基，培养基为MS培养基，成分为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg/L、激动素(KT)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.1mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.1mg/L、6g/L琼脂、30g/L蔗糖；培养基pH值调至5.8。将转接后的愈伤组织放在培养室适宜条件下培养，条件为温度25±2℃，在光强为2000lux的连续强光下培养30天，每日光照时间18小时。以后每隔30天转接一次。再生苗增殖倍数达到20.6，愈伤组织和再生苗发红，生长大部分畸形，大部分苗出现玻璃化现象。

3.生根培养：将苗高达到1cm以上的再生苗转入生根培养基进行生根培养得到试管苗，生根培养基为MS培养基，成分为萘乙酸(NAA)2mg/L、6g/L琼脂、30g/L蔗糖；培养基pH值调至5.8；生根率为88.3％，部分根出现畸形。

4.驯化移栽：将根长至1cm以上的试管苗取出清洗干净，用市售多菌灵浸泡后，放在通风处晾干，栽入营养土中。浸泡时间为2小时。营养土采用泥炭土：蛭石：珍珠岩：赤玉土＝1:1:1:1，移栽成活率达91.5％。

Claims (9)

1.一种毛汉十二卷离体培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)初代培养：选择毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体，清洗消毒后，将叶片基部切除后，剪成小块接种于愈伤组织诱导培养基上在培养室适宜条件下培养；

(2)继代培养：将愈伤组织诱导出来后，将愈伤组织接种于增殖分化培养基中培养得到再生苗；

(3)生根培养：将再生苗转入生根培养基进行生根培养，获得试管苗；

(4)驯化移栽：将试管苗取出，清洗消毒后，栽入营养土中进行驯化移栽。

2.根据权利要求1所述的毛汉十二卷离体培养方法，其特征在于，步骤(1)中外植体的清洗消毒步骤为：采集的外植体经过洗衣粉清洗，流水冲洗，然后用纱布包裹起来，放在冰箱4度条件下预冷48h，然后将外植体转到无菌操作台上，先用酒精消毒，用无菌水冲洗，再用氯化汞或者次氯酸钠消毒，用无菌水冲洗。

3.根据权利要求1所述的毛汉十二卷离体培养方法，其特征在于，步骤(1)中所述适宜条件为温度25±2℃，在红光：蓝光＝1:1的光照条件下培养30-60天。

4.根据权利要求1所述的毛汉十二卷离体培养方法，其特征在于，步骤(2)中所述接种于增殖分化培养基中培养的步骤为：在温度25±2℃的培养室中，光强为2000-5000lux的连续强光下培养20-30天，每日光照时间8-24小时，之后每隔20-30天转接一次。

5.根据权利要求1所述的毛汉十二卷离体培养方法，其特征在于，步骤(1)和(2)中所述愈伤组织诱导培养基和增殖分化培养基均为MS培养基，成分为6-苄氨基腺嘌呤0-3mg/L、激动素0-3mg/L、萘乙酸0-1mg/L、吲哚乙酸0-1mg/L、琼脂4-8g/L、蔗糖5-40g/L，pH值调至5.6-6.0。

6.根据权利要求1中所述的毛汉十二卷离体培养方法，其特征在于，步骤(3)中所述生根培养基为1/2MS培养基、MS培养基中的一种，成分为萘乙酸0-2mg/L、3-吲哚丁酸0-2mg/L、琼脂4-8g/L、蔗糖5-40g/L、培养基pH值调至5.6-6.0。

7.根据权利要求1所述的毛汉十二卷离体培养方法，其特征在于，步骤(4)中所述清洗消毒的步骤为：将根长至1cm以上的试管苗取出清洗干净，用消毒剂浸泡0.1-10小时后，放在通风处晾干，栽入营养土中。

8.根据权利要求7所述的毛汉十二卷离体培养方法，其特征在于：所述消毒剂为高锰酸钾或者多菌灵。

9.根据权利要求8所述的毛汉十二卷离体培养方法，其特征在于：所述营养土为泥炭土、蛭石、珍珠岩和赤玉土中的一种或几种。