CN107568065B - 一种毛汉十二卷离体培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种毛汉十二卷离体培养方法,以毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体,建立了初代培养,继代培养,生根培养的离体快繁方法体系;采用本发明方法,可以叶片为外植体,降低了取材难度;克服芽诱导过程中外植体褐变及死亡等问题,提高了愈伤组织诱导率及再生苗生长状况,获取数量多、质量好的丛生芽,减少了增殖时间,提高了增殖倍数,无褐化,无污染,再生苗健壮,无徒长,满足了工厂化生产的需求。
Description
技术领域
本发明属于无性繁殖技术领域,具体涉及一种毛汉十二卷离体培养方法,尤其涉及一种毛汉十二卷“稻妻”的离体培养方法。
背景技术
毛汉十二卷(Haworthia maughanii),也称万象,肉质叶从基部斜出,排成松散的莲座状,叶片半圆筒形,顶端截形,半透明,依品种的差异,有不同的花纹,叶色深绿、灰绿或红褐,表面粗糙。毛汉十二卷喜温暖干燥和阳光充足环境。不耐寒,怕高温和强光,耐半阴。以疏松、排水良好的沙壤土为好。冬季温度不低于10℃。
目前,关于十二卷属植物离体组织培养快速繁殖的报道,多数采用植物花葶作为外植体,虽然容易获得再生芽,但实际操作中,植物体从幼苗到开花需要的时间较长,导致取得外植体周期较长,难度较大;同时,在离体诱导培养中,多采取连续强光下培养,并且转接周期较长,多为一个月;伴随着较高的褐化率和污染率,不能适应现在市场的需求。
发明内容
发明目的:本发明的目的是提供一种毛汉十二卷离体培养方法,该方法可以高效地培养毛汉十二卷“稻妻”。
技术方案:为了解决上述技术问题,本发明提供了一种毛汉十二卷离体培养方法,包括以下步骤:
(1)初代培养:选择毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体,清洗消毒后,将叶片基部切除后,剪成小块接种于愈伤组织诱导培养基上在培养室适宜条件下培养;
(2)继代培养:将愈伤组织诱导出来后,将愈伤组织接种于增殖分化培养基中培养得到再生苗;
(3)生根培养:将再生苗转入生根培养基进行生根培养,获得试管苗;
(4)驯化移栽:将试管苗取出,清洗消毒后,栽入营养土中进行驯化移栽。
其中,步骤(1)中外植体的清洗消毒步骤为:采集的外植体经过洗衣粉清洗,流水冲洗,然后用纱布包裹起来,放在冰箱4℃条件下预冷48h(预冷的目的是降低污染率),然后将外植体转到无菌操作台上,先用酒精消毒,用无菌水冲洗,再用氯化汞或者次氯酸钠消毒,用无菌水冲洗。
其中,步骤(1)中所述适宜条件为温度25±2℃,在红光:蓝光=1:1的光照条件下培养30-60天。
红光和蓝光可加速初代愈伤组织的诱导,一般常规的传统方法需要三个月。
其中,步骤(2)中所述接种于增殖分化培养基中培养的步骤为:在温度25±2℃的培养室中,光强为2000-5000lux的连续强光下培养20-30天,每日光照时间8-24小时,之后每隔20-30天转接一次。
其中,步骤(1)和(2)中所述愈伤组织诱导培养基和增殖分化培养基均为MS培养基,成分为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0-3mg/L、激动素(KT)0-3mg/L、萘乙酸(NAA)0-1mg/L、3-吲哚乙酸(IAA)0-1mg/L、琼脂4-8g/L、蔗糖5-40g/L,pH值调至5.6-6.0。
其中,步骤(3)中所述生根培养基为1/2MS培养基、MS培养基中的一种,成分为萘乙酸(NAA)0-2mg/L、3-吲哚丁酸(IAA)0-2mg/L、琼脂4-8g/L、蔗糖5-40g/L、培养基pH值调至5.6-6.0。
其中,步骤(4)中所述清洗消毒的步骤为:将根长至1cm以上的试管苗取出清洗干净,用消毒剂浸泡0.1-10小时后,放在通风处晾干,栽入营养土中。
其中,上述消毒剂为高锰酸钾或者多菌灵。
其中,上述营养土为泥炭土,椰槺,蛭石,沙土,珍珠岩,麦饭石、赤玉土中的一种或几种的组合。
有益效果:与现有方法相比,本发明方法具备以下优点:本发明以毛汉十二卷的叶片为外植体,降低了取材难度;在初代培养时采用弱光下培养,将继代培养中的转接时间缩短,提高了增殖倍数,减少了增殖时间,无褐化,无污染,再生苗健壮,无徒长,满足了工厂化生产的需求。
具体实施方式
实施例1:
选取毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体,通过外植体无菌处理后,将外植体接种于初代培养愈伤组织诱导培养基上,置于合适的温度、湿度和光照强度条件下进行培养,诱导愈伤组织,具体步骤为:
1、初代培养:选择毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体,经过洗衣粉清洗,流水冲洗1小时,将外植体转到无菌操作台上,先用75%酒精消毒10秒,用无菌水冲洗1次,再用0.1%氯化汞消毒5min或者用15%次氯酸钠消毒15min,再用无菌水冲洗4次后,将叶片基部切除后,剪成1cm2的小块接种于愈伤组织诱导培养基上,每瓶接一块。愈伤组织诱导培养基为MS培养基,成分为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg/L、激动素(KT)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.1mg/L、6g/L琼脂、20g/L蔗糖;培养基pH值调至5.8。将接种后的外植体放在培养室适宜条件下培养。条件为温度25±2℃,在红光:蓝光=1:1的光照条件下培养60天,愈伤组织诱导率100%,污染率为0,褐化率为0。
2、继代培养:愈伤组织诱导出来后,将愈伤组织转入增殖分化培养基,培养基为MS培养基,成分为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)0.5mg/L、激动素(KT)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.01mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.01mg/L、6g/L琼脂、30g/L蔗糖;培养基pH值调至5.8。将转接后的愈伤组织放在培养室适宜条件下培养,条件为温度25±2℃,在光强为3000lux的连续强光(红光:蓝光=1:1)下培养30天,每日光照时间12小时。以后每隔30天转接一次。再生苗生长健壮,颜色翠绿,无玻璃化现象,增殖倍数达到10.5。
3、生根培养:将苗高达到1cm以上的再生苗转入生根培养基进行生根培养得到试管苗,生根培养基为1/2MS培养基,成分为萘乙酸(NAA)0.5mg/L、琼脂6g/L、蔗糖30g/L;培养基pH值调至5.8,生根率95.2%。
4、驯化移栽:将根长至1cm以上的试管苗取出清洗干净,用0.1%高锰酸钾浸泡后,放在通风处晾干,栽入营养土中。浸泡时间为0.5小时。营养土采用泥炭土:蛭石:珍珠岩:赤玉土=1:1:1:1,移栽成活率达96.2%。
实施例2:
选取毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体,通过外植体无菌处理后,将外植体接种于初代培养愈伤组织诱导培养基上,置于合适的温度、湿度和光照强度条件下进行培养,诱导愈伤组织,具体步骤为:
1、初代培养:选择毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体,经过洗衣粉清洗,流水冲洗2小时,将外植体转到无菌操作台上,先用75%酒精消毒20秒,用无菌水冲洗2次,再用0.1%氯化汞消毒3min,再用无菌水冲洗,6次后,将叶片基部切除后,剪成2cm2的小块接种于愈伤组织诱导培养基上,每瓶接一块。愈伤组织诱导培养基为MS培养基,成分为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg/L、激动素(KT)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.1mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.1mg/L、7g/L琼脂、20g/L蔗糖;培养基pH值调至5.6。将接种后的外植体放在培养室适宜条件下培养,条件为温度25±2℃,在红光:蓝光=1:1的光照条件下培养45天,愈伤组织诱导率56.2%,污染率为0,褐化率为15.5%。
2、继代培养:愈伤组织诱导出来后,将愈伤组织转入增殖分化培养基,培养基为MS培养基,成分为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)1mg/L、萘乙酸(NAA)0.01mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.01mg/L、6g/L琼脂、30g/L蔗糖;培养基pH值调至5.8。将转接后的愈伤组织放在培养室适宜条件下培养,条件为温度25±2℃,在强光(红光:蓝光=1:1)为5000lux的连续强光下培养30天,每日光照时间18小时。以后每隔30天转接一次。再生苗增殖倍数达到16.5,生长部分畸形,部分苗出现玻璃化现象。
3、生根培养:将苗高达到1cm以上的再生苗转入生根培养基进行生根培养得到试管苗,生根培养基为MS培养基,成分为萘乙酸(NAA)0mg/L、吲哚丁酸(IBA)0.5mg/L、6g/L琼脂、30g/L蔗糖;培养基pH值调至5.8;生根率为72.8%,新生根健壮。
4、驯化移栽:将根长至1cm以上的试管苗取出清洗干净,用0.1%高锰酸钾浸泡后,放在通风处晾干,栽入营养土中。浸泡时间为1小时。营养土采用纯椰糠,移栽成活率达76.2%。
实施例3:
选取毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体,通过外植体无菌处理后,将外植体接种于初代培养愈伤组织诱导培养基上,置于合适的温度、湿度和光照强度条件下进行培养,诱导愈伤组织,具体步骤为:
1.初代培养:选择毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体,经过洗衣粉清洗,流水冲洗2小时,将外植体转到无菌操作台上,先用75%酒精消毒30秒,用无菌水冲洗2次,再用0.1%氯化汞消毒8min,再用无菌水冲洗6次后,将叶片基部切除后,剪成1-2cm2的小块接种于愈伤组织诱导培养基上,每瓶接一块。愈伤组织诱导培养基为MS培养基,成分为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)3mg/L、激动素(KT)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.5mg/L、7g/L琼脂、20g/L蔗糖;培养基pH值调至5.6。将接种后的外植体放在培养室适宜条件下培养,条件为温度25±2℃,在红光:蓝光=1:1的光照条件下培养45天,愈伤组织诱导率23.5%,污染率为0,褐化率为35.1%,死亡率为41.4%。
2.继代培养:愈伤组织诱导出来后,将愈伤组织转入增殖分化培养基,培养基为MS培养基,成分为6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)2mg/L、激动素(KT)0.5mg/L、萘乙酸(NAA)0.1mg/L、吲哚乙酸(IAA)0.1mg/L、6g/L琼脂、30g/L蔗糖;培养基pH值调至5.8。将转接后的愈伤组织放在培养室适宜条件下培养,条件为温度25±2℃,在光强为2000lux的连续强光下培养30天,每日光照时间18小时。以后每隔30天转接一次。再生苗增殖倍数达到20.6,愈伤组织和再生苗发红,生长大部分畸形,大部分苗出现玻璃化现象。
3.生根培养:将苗高达到1cm以上的再生苗转入生根培养基进行生根培养得到试管苗,生根培养基为MS培养基,成分为萘乙酸(NAA)2mg/L、6g/L琼脂、30g/L蔗糖;培养基pH值调至5.8;生根率为88.3%,部分根出现畸形。
4.驯化移栽:将根长至1cm以上的试管苗取出清洗干净,用市售多菌灵浸泡后,放在通风处晾干,栽入营养土中。浸泡时间为2小时。营养土采用泥炭土:蛭石:珍珠岩:赤玉土=1:1:1:1,移栽成活率达91.5%。
Claims (1)
1.一种毛汉十二卷离体培养方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)初代培养:选择毛汉十二卷“稻妻”的叶片为外植体,经过洗衣粉清洗,流水冲洗1小时,将外植体转到无菌操作台上,先用75%酒精消毒10秒,用无菌水冲洗1次,再用0.1%氯化汞消毒5min或者用15%次氯酸钠消毒15min,再用无菌水冲洗4次后,将叶片基部切除后,剪成1cm2的小块接种于愈伤组织诱导培养基上,每瓶接一块,愈伤组织诱导培养基为MS培养基,成分为6-苄氨基腺嘌呤1mg/L、激动素0.5 mg/L、萘乙酸0.1 mg/L、6g/L琼脂、20g/L蔗糖;培养基pH值调至5.8,将接种后的外植体放在培养室适宜条件下培养,条件为温度25±2℃,在红光:蓝光=1:1的光照条件下培养60天;
(2)继代培养:愈伤组织诱导出来后,将愈伤组织转入增殖分化培养基,培养基为MS培养基,成分为6-苄氨基腺嘌呤0.5mg/L、激动素0.5mg/L、萘乙酸0.01 mg/L、吲哚乙酸0.01mg/L、6g/L琼脂、30g/L蔗糖;培养基pH值调至5.8;将转接后的愈伤组织放在培养室适宜条件下培养,条件为温度25±2℃,在光强为3000lux的连续强光,红光:蓝光=1:1下培养30天,每日光照时间12小时,以后每隔30天转接一次,再生苗生长健壮,颜色翠绿,无玻璃化现象,增殖倍数达到10.5;
(3)生根培养:将苗高达到1cm以上的再生苗转入生根培养基进行生根培养得到试管苗,生根培养基为1/2MS培养基,成分为萘乙酸0.5 mg/L、琼脂6g/L、蔗糖30g/L;培养基pH值调至5.8;
(4)驯化移栽:将根长至1cm以上的试管苗取出清洗干净,用0.1%高锰酸钾浸泡后,放在通风处晾干,栽入营养土中,浸泡时间为0.5小时,营养土采用泥炭土:蛭石:珍珠岩:赤玉土=1:1:1:1。
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2017
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多肉植物十二卷花影寿离体快繁技术研究;杨娟等;《上海农业科技》;20170405(第3期);第83第1节至第84页第3节 * |
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