CN110447538B - 一种以潘氏冰灯玉露花序轴为外植体的组织培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物组织培养的技术领域，提供了一种以潘氏冰灯玉露花序轴为外植体的组织培养方法，包括以下步骤：挑选健康玉露花序轴清洗、消毒后，获得无菌外植体；将无菌外植体切段后接种到诱导愈伤组织培养基中进行愈伤组织的诱导；然后将愈伤组织切割成小块转入不定芽分化培养基中分化培养，获得丛生芽；再然后将丛生芽分株壮苗培养后，转入生根培养基中培养，获得带根的完整植株，最后进行炼苗栽培。本发明通过对玉露花序轴组织进行离体培养获得玉露组培苗，该方法材料易得，消毒方便，愈伤组织分化率高，生根率高，保证品系优势，能快速大量繁殖出大量优良潘氏冰灯玉露幼苗。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养的技术领域，涉及一种多肉植物潘氏冰灯玉露的组织培养方法，尤其涉及一种以潘氏冰灯玉露花序轴为外植体的组织培养方法。
背景技术
玉露（Haworthia obtusa var. pilifera）是百合科十二卷属植物中的“软叶系”品种。植株玲珑小巧，种类丰富，叶色晶莹剔透，富于变化，如同有生命的工艺品，非常可爱，是近年来人气较旺的小型多肉植物品种之一。越来越受到多肉植物爱好者的青睐。潘氏冰灯玉露是玉露品种中观赏价值更为突出的品种之一，大多数采用分株、叶插等方法繁殖。但这些方法繁殖率低、繁殖方法损害母株生长、且小苗不易成活、生长缓慢，且生产速度无法及时满足新优品种的市场需求。此外，采用营养杯种植占有空间大，人工管理和设施成本均比较大，从而影响了经济效益，因此，提高潘氏冰灯玉露生产效率、缩短培育时间、降低人工成本是急需解决的问题。
植物的组织培养采用的是无性繁殖技术，在组培瓶内可以达到数倍的繁殖系数，加之组培架的高效节约空间，繁殖不受地区、季节限制，除需要一定设备及能源消耗外，由于植物材料能按几何级数繁殖生产，成本低廉。
文献“冰灯玉露的组织培养与快速繁殖技术研究，现代农业科学2014年”公开了冰灯玉露的组织培养和快速繁殖方法，以冰灯玉露幼嫩的花茎作为材料，通过优化初代培养基、增殖培养基以及生根培养基，诱导率最高可达到80%，10-15 d内可长出2-3条根，生根率最高可达到75%。但是，为了提高繁殖效率、降低成本，愈伤组织诱导率以及生根率等指标需要进一步提升。
综上所述，采取组织培养繁殖潘氏冰灯玉露是解决种苗需求的重要途径之一，对多肉植物新品种的开发和推广都具有着非常重要的意义。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种以潘氏冰灯玉露花序轴为外植体的组织培养方法，可以实现快速繁殖，大大缩短人工生产成本，极大提高了生产效率。
为了达到上述目的，本发明采用如下的技术方案。
一种以潘氏冰灯玉露花序轴为外植体的组织培养方法，其包括如下步骤：
步骤A）外植体选择与消毒，步骤B）愈伤组织的诱导，步骤C）愈伤组织的分化，步骤D）壮苗培养，步骤E）根的诱导，步骤F）炼苗驯化。
进一步地，所述组织培养方法包括如下步骤：
步骤A）外植体选择与消毒；
步骤B）愈伤组织的诱导：取消毒后的外植体切分为2.0cm长的小段，接种于愈伤诱导培养基中进行诱导培养；
步骤C）愈伤组织的分化：将步骤B）中所得玉露愈伤组织切割后接入继代分化培养基中进行诱导不定芽，继代培养25-30天，培养温度25±2℃，光照时间10-14h/天，光照强度为1600-1800lx；
步骤D）壮苗培养：将步骤C）所得玉露丛生芽切为单芽后，接入壮苗培养基中进行培养25-30天，培养温度25±2℃，光照时间10-14h/天，光照强度为1600-1800lx；
步骤E）根的诱导：将步骤D）所得玉露组培苗接入生根培养基中进行生根培养20天，培养温度25±2℃，光照时间10-14h/天，光照强度为1600-1800lx；
步骤F）炼苗驯化：将步骤E）获得的组培幼苗，栽入带有基质为体积比1:1珍珠岩：草炭土的容器内，移栽前基质喷施杀菌剂。
优选地，
所述步骤A）中的外植体选取玉露盛花期的花序轴。
优选地，
所述步骤A）中的消毒方法为：将外植体用流水冲洗30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒30s，再用0.1%的升汞消毒8min，最后用无菌水洗涤6次，每次洗1min，用无菌纸吸干表面水分，获得消毒外植体。
优选地，
所述愈伤诱导培养基的配方为：MS+6-BA 1.5mg/L +NAA0.3 mg/L。
优选地，
所述诱导培养的条件为：诱导培养温度在24-26℃，首先在黑暗中培养24h，然后进行正常培养20-35天。
优选地，
所述继代分化培养基的配方为：MS+6-BA 0.5mg/L。
优选地，
所述壮苗培养基的配方为：MS+IBA0.2 mg/L。
优选地，
所述杀菌剂的配方为：多粘类芽孢杆菌的浓度为（1-5）×108cfu/L。
优选地，
所述生根培养基的配方为：MS+IBA0.2 mg/L。
更优选地，
所述正常培养的条件为：光照时间10-14h/天，光照强度为1600-1800lx。
更优选地，
所述杀菌剂的配方为：多粘类芽孢杆菌的浓度为1×108cfu/L。
本发明相对现有技术的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
利用玉露花序轴为外植体，通过愈伤组织分化获得组培苗，克服了多肉植物组织培养叶片诱导容易出现玻璃化现象的缺点。本发明方法材料易得，消毒简单，分化率高，增值系数大，并能保证潘氏冰灯玉露品种的特征品质。本发明方法能够快速大量繁殖出适合移栽的优良潘氏冰灯玉露幼苗，满足生产需求，提高经济效益，应用前景广阔；本发明通过对培养基的优化，提高了愈伤组织诱导率、生根率等指标。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所使用的原料，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
一种以潘氏冰灯玉露花序轴为外植体的组织培养方法，其包括如下步骤：
1、外植体选择与消毒：于3月底，选取玉露盛花期的花序轴为外植体，消毒方法用流水冲洗30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒30s，再用0.1%的升汞消毒8min，最后用无菌水洗涤6次，每次洗1min，用无菌纸吸干表面水分，获得消毒外植体50个；
2、愈伤组织的诱导：取消毒后的外植体切分为2.0cm长的小段，接种于愈伤诱导培养基MS+6-BA 1.5mg/L +NAA0.3 mg/L中进行诱导，控制培养温度在23℃，首先在黑暗中培养24h，然后进行正常光照培养，光照时间10h/天，光照强度为1600lx，20天后外植体污染率为0%，诱导率为100%，花序轴2端各发育出1块愈伤组织，获得愈伤100块；
3、愈伤组织的分化：将所得玉露愈伤组织切割后接入继代分化培养基MS+6-BA0.5mg/L中进行诱导不定芽，培养温度23℃，光照时间10h/天，光照强度为1600lx，继代培养25天后，平均每块愈伤分化不定芽6.2个，共获得不定芽620个；
4、壮苗培养：将所得玉露丛生芽切为单芽后，接入壮苗培养基MS+IBA0.2 mg/L中进行培养25天，培养温度23℃，光照时间10h/天，光照强度为1600lx，壮苗后，玉露体积增加1倍，同时每株基部分生出小苗，数量平均为2.1个，共获得组培苗1922株；
5、根的诱导：将所得玉露组培苗切分为单株后，接入生根培养基MS+IBA0.2 mg/L中进行生根培养20天，培养温度23℃，光照时间10h/天，光照强度为1600lx，生根苗平均根长达4.0cm，平均根数5.4条，共获得生根苗1922株；
6、炼苗驯化：将所得的组培幼苗，栽入带有基质为体积比1:1珍珠岩：草炭土的容器内，移栽前基质喷施浓度为1×108cfu/L多粘类芽孢杆菌的杀菌剂，喷洒量占基质重量的10%，混匀；成活率100%。
至此，由50个外植体增殖获得适合移栽的玉露组培苗1922株，一个周期90d内繁殖系数达38.44倍。
实施例2
一种以潘氏冰灯玉露花序轴为外植体的组织培养方法，其包括如下步骤：
1、外植体选择与消毒：于4月中旬，选取玉露盛花期的花序轴为外植体，消毒方法用流水冲洗30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒30s，再用0.1%的升汞消毒8min，最后用无菌水洗涤6次，每次洗1min，用无菌纸吸干表面水分，获得消毒外植体50个；
2、愈伤组织的诱导：取消毒后的外植体切分为2.0cm长的小段，接种于愈伤诱导培养基MS+6-BA 1.5mg/L +NAA0.3 mg/L中进行诱导，控制培养温度在27℃，首先在黑暗中培养24h，然后进行正常光照培养，光照时间14h/天，光照强度为1800lx，35天后外植体污染率为0%，诱导率为100%，花序轴2端各发育出1块愈伤组织，获得愈伤100块；
3、愈伤组织的分化：将所得玉露愈伤组织切割后接入继代分化培养基MS+6-BA0.5mg/L中进行诱导不定芽，培养温度27℃，光照时间14h/天，光照强度为1600lx，继代培养30天后，平均每块愈伤分化不定芽7.3个，共获得不定芽730个；
4、壮苗培养：将所得玉露丛生芽切为单芽后，接入壮苗培养基MS+IBA0.2 mg/L中进行培养30天，培养温度27℃，光照时间14h/天，光照强度为1800lx，壮苗后，玉露体积增加1倍，同时每株基部分生出小苗，数量平均为2.3个，共获得组培苗2409株；
5、根的诱导：将所得玉露组培苗切分为单株后，接入生根培养基MS+IBA0.2 mg/L中进行生根培养20天，培养温度27℃，光照时间14h/天，光照强度为1800lx，生根苗平均根长达4.5cm，平均根数5.2条，共获得生根苗2409株；
6、炼苗驯化：将所得的组培幼苗，栽入带有基质为体积比1:1珍珠岩：草炭土的容器内，移栽前基质喷施浓度为5×108cfu/L多粘类芽孢杆菌的杀菌剂，喷洒量占基质重量的10%，混匀；成活率100%。
至此，由50个外植体增殖获得适合移栽的玉露组培苗2409株，一个周期115d内繁殖系数达48.18倍。
实施例3
外植体消毒处理后，接种于含不同激素配比的诱导培养基上，比较不同培养基对愈伤组织诱导率的影响。具体见表1。
表1 诱导培养基对愈伤组织诱导率的影响
从表1可看出，在MS+6-BA 1.5mg/L +NAA0.3 mg/L培养基上，外植体发育最好，愈伤组织诱导率最高，为100%。
实施例4
玉露愈伤组织切割后接入含不同激素配比的继代分化培养基中进行诱导不定芽，比较不同培养基对不定芽的影响。具体见表2。
表2 继代分化培养基对不定芽的影响
从表2可看出，在MS+6-BA 0.5mg/L培养基上，进行继代培养30天后，平均每块愈伤分化不定芽7.3个，远高于其余培养基组。
实施例5
微生物胁迫组培苗生长与合成和积累刺激代谢物，为植物细胞生长和次生代谢的调控提供了新手段，筛选合适的微生物，与玉露多肉植物共生形成的营养平衡关系，促进细胞的生长和分化，能够提高生根效率。此外，微生物杀菌剂可有效防治植物细菌性和真菌性土传病害，同时可使植物叶部的细菌和真菌病害明显减少。
接种于含不同的炼苗基质上，比较不同基质对生根率的影响。观察发育情况，统计成活率。
从下表3可看出，在体积比1:1珍珠岩：草炭土的基质上喷施多粘类芽孢杆菌，生根率最高，达到100%。三种微生物在培养基中的浓度均控制在108cfu/L。
表3 基质对炼苗生根率的影响
| 基质配方 | 生根率% |
| 园土 | 70.1 |
| 珍珠岩：草炭土（体积比1:1） | 91.2 |
| 珍珠岩：草炭土（体积比1:1）+多粘类芽孢杆菌 | 100 |
| 珍珠岩：草炭土（体积比1:1）+短小芽孢杆菌 | 96.0 |
| 珍珠岩：草炭土（体积比1:1）+淡紫灰链霉菌 | 93.5 |
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，或在实施案例之外的树种实施本方法，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改，改进或范围的扩大，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (2)
1.一种以潘氏冰灯玉露花序轴为外植体的组织培养方法，其包括如下步骤：
步骤A）外植体选择与消毒；
所述外植体选取玉露盛花期的花序轴；
所述步骤A）中的消毒方法为：将外植体用流水冲洗30min后，于无菌操作台上用75%乙醇消毒30s，再用0.1%的升汞消毒8min，最后用无菌水洗涤6次，每次洗1min，用无菌纸吸干表面水分，获得消毒外植体；
步骤B）愈伤组织的诱导：取消毒后的外植体切分为2.0cm长的小段，接种于愈伤诱导培养基中进行诱导培养；
所述愈伤诱导培养基的配方为：MS+6-BA 1.5mg/L +NAA0.3 mg/L；
所述诱导培养的条件为：诱导培养温度在24-26℃，首先在黑暗中培养24h，然后进行正常培养20-35天；所述正常培养的条件为：光照时间10-14h/天，光照强度为1600-1800lx；
步骤C）愈伤组织的分化：将步骤B）中所得愈伤组织切割后接入继代分化培养基中进行诱导不定芽，继代培养25-30天，培养温度25±2℃，光照时间10-14h/天，光照强度为1600-1800lx；
所述继代分化培养基的配方为：MS+6-BA 0.5mg/L；
步骤D）壮苗培养：将步骤C）所得玉露丛生芽切为单芽后，接入壮苗培养基中进行培养25-30天，培养温度25±2℃，光照时间10-14h/天，光照强度为1600-1800lx；
所述壮苗培养基的配方为：MS+IBA0.2 mg/L；
步骤E）根的诱导：将步骤D）所得玉露组培苗接入生根培养基中进行生根培养20天，培养温度25±2℃，光照时间10-14h/天，光照强度为1600-1800lx；
所述生根培养基的配方为：MS+IBA0.2 mg/L；
步骤F）炼苗驯化：将步骤E）获得的组培幼苗，栽入带有基质为体积比1:1珍珠岩：草炭土的容器内，移栽前基质喷施杀菌剂。
2.根据权利要求1所述的组织培养方法，其特征在于，所述杀菌剂为浓度为（1-5）×108cfu/L的多粘类芽孢杆菌液。
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