CN112704011B - 一种生姜组织培养的方法 - Google Patents
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Abstract
一种组织培养快速繁殖生姜的方法，其特征在于：是取生姜茎尖预处理后置于缓释培养基上诱导产生丛生芽，随后在缓释培养基中加入NH4NO3浓度减半的MS基础培养基，并补加0.5~1mg/L的PP333，持续培养获得带根苗；所述的缓释培养基是MS基础培养基中补充6‑BA 0.5~1.5mg/L、NAA缓释生长素2~3mg/L、TDZ 0.25~0.3mg/L，2%蔗糖，琼脂0.55~0.65%，调节pH为5.8~6。本发明通简化了组织培养步骤，缩短了培养时间，提高了芽苗成活率和脱毒率，成活率达到96%，脱毒率达到100%，同时防止了生姜组织培养过程中产生变异，增殖系数显著提高，达到5.13，生根率达到97.7%，培育健壮的生姜带根苗。
Description
技术领域
本发明涉及组织培养技术领域，具体涉及一种生姜组织培养的方法。
背景技术
生姜是一种一年生活多年生的姜科姜属升温宿根草本植物，是我国许多地区种植业的主要来源。生姜是药食两用的经济植物，具有发汗解表、温中止呕，温肺止咳、解鱼蟹毒等作用。中国是生姜的发源地及主要出产国之一，距今已有两千多年的栽培历史。传统的生姜生产是在收获季节选健壮、无病虫害的根茎窖藏，次年取已萌芽的种姜切块种植，这种方式存在严重的浪费，需要的人力物力多，而且，由于生姜不开花或很少开花，只能采用无性繁殖，长期的无性繁殖，导致病毒的病害的积累与传播(如黄瓜花叶病毒、细菌性枯萎病、镰刀霉菌及根节线虫)，导致生姜大量减产，生姜品质退化，抗逆性下降，在国内，大量报道集中在有青枯假单胞杆菌引起的姜瘟病上，尤其是在生姜主产区，长年连作栽培，田间发病率严重时高达70～80％，感染了病毒的生姜品质差，叶子皱缩，生长缓慢，一般减产30～80％，甚至绝收，这成为了生姜创高产、获得高效益的主要阻碍。采用茎尖组织培养技术获得脱毒苗可以降低病毒的影响。
在茎尖培养过程的关键在于既要保证优异的脱毒效果，又要满足诱导成苗率高。但是，现有的组织培养并不适用于生姜的组织培养，很难诱导其产生愈伤组织和丛生芽，繁殖缓慢，愈伤组织容易褐变，诱导成活率低，容易烂苗，而且繁琐的培养过程中容易发生变异问题，从而造成生姜组织培养方面存在这繁殖系数低，生根率低、易产生畸形苗等问题。
发明内容
鉴于此，本发明目的在于提供一种生姜组织培养的方法。该方法简化了组织培养步骤，诱导成活率高、提高了生姜的繁殖系数，脱毒率达到100％。
本发明目的通过如下技术方案实现：
一种组织培养快速繁殖生姜的方法，其特征在于：是取大小为0.6～0.8cm的生姜茎尖预处理后置于缓释培养基上诱导产生丛生芽，随后在缓释培养基中加入NH4NO3浓度减半的MS基础培养基，并补加0.5～1mg/L的PP333，持续培养获得带根苗。
所述的缓释培养基是MS基础培养基中补充6-BA 0.5～1.5mg/L、NAA缓释生长素2～3mg/L、TDZ 0.25～0.3mg/L，2％蔗糖，琼脂0.55～0.65％，调节pH为5.8～6。
TDZ具有类细胞分裂素的作用，其分子中有两个功能基团：苯基和噻二唑，在诱导反应中，两个环状基团起到相互促进作用，诱导愈伤组织生长速率是其他生长调节剂的几十倍，因此，培养基中0.25～0.3mg/L低浓度的TDZ具有快速启动愈伤组织生长的作用，另一方面TDZ的存在，抑制了生姜茎尖中细胞分裂素氧化酶的活性(能够使细胞分裂素不可逆转失活的唯一的酶)，保证了6-BA 在组织培养过程中保持其高效活性。
在生姜组织培养过程中，想要同时诱导芽的有效增殖和大量生根是相当困难的，容易造成诱导生根的同时导致发芽困难，或者保证了高效诱导发芽，但是生根较少，因此本领域是采用诱导、增殖和生根过程依次培养的手段；本发明在组织培养初始阶段，由于较低的生长素(NAA)浓度和相对较高的细胞分裂素浓度(6-BA和TDZ)快速启动并促进丛生芽的高效增殖，随着NAA缓释，NAA 浓度逐渐上升，细胞分裂素/生长素的比例下降，有利于生根，增殖的芽苗逐渐生根，从而诱导出大量的带根苗。
进一步，上述NAA缓释生长素是将纳米SiO2分散于去乙醇离子水溶液中，加入NAA，再加入PVP k30，混合后加热至80～90℃保温20～30min，停止加热，冷却至室温，随后过滤、干燥。
PVP高聚物链上含有丰富的羰基氧，二氧化硅表面含有大量的硅羟基，硅羟基中的氢与羰基氧形成氢键，从而发生团聚，形成纳米微球，将生长素NAA有效包裹在微球中，在将与纳米SiO2复合的NAA加入到培养基中时，SiO2对NAA 起到缓释作用，从而控制NAA在培养基中浓度缓慢升高，达到高效诱导的效果，其次SiO2为NAA提供了稳定的弱酸环境，不仅促进了NAA有效进入生姜的细胞，还有效提高了NAA对质膜专一结合位点的结合强度。其中PVP一方面在复合过程中作为粘结剂使SiO2团聚对NAA形成包裹，从而实现对NAA的有效缓释，另一方面还在培养基中起到抑制愈伤组织发生褐变死亡。
进一步，上述纳米SiO2、NAA和PVP k30的质量比为4～6：1：0.03～0.08。
进一步，上述乙醇水溶液是由乙醇和纯化水的体积比为1:1组成，纳米SiO2和乙醇水溶液的质量体积比为1g：10～15mL。
进一步，所述预处理是采用体积浓度为70％的乙醇浸润0.6～0.8cm的生姜茎尖30～40s，然后采用无菌水洗涤，再重复相同的乙醇浸润一次，无菌水洗涤后置于50℃下加热5～8min。
由于生姜的肉质根茎生长于土壤中，外植体带菌量大，灭菌较为困难，传统的方法是采用升汞处理或者大量抗生素处理，虽然会降低生姜的污染率，达到灭菌的效果，但是，同时也伴随着存活率下降的问题，且容易出现褐化。因此，本发明将生姜茎尖控制为0.6～0.8cm，采用乙醇重复浸润2次以及较高温度处理，达到优异的灭菌效果。
进一步，在缓释培养基中加入NH4NO3浓度减半的MS基础培养基的同时，按照MS基础培养基的添加量补加2％蔗糖和0.6％的琼脂，MS基础培养基和缓释培养基的体积比为1:3。
在培养过程中，生姜较易出现叶片黄化、畸形现象，因此，本发明采用中途添加NH4NO3浓度减半的MS基础培养基，降低了培养基中调节6-BA、NAA以及TDZ的浓度，降低了玻璃化苗和黄化苗的出现。
进一步，上述培养具体是先在28℃，相对湿度为60～70％下暗室培养至长出白色、绿色的愈伤组织，以及芽苗，待芽苗长到4～5cm时，将芽苗截去上部叶及叶鞘，重新置于培养基中，加入NH4NO3浓度减半的MS基础培养基和 0.5～1mg/L的PP333后，先在光照强度为1500～1800Lux下持续培养24h，再在无光照环境下培养24h，交替培养得增殖的生根苗。
最具体的，一种组织培养快速繁殖生姜的方法，其特征在于，按如下步骤进行：
预处理：取大小为0.6～0.8cm的生姜茎尖，用体积浓度为70％的乙醇浸润 30～40s，然后采用无菌水洗涤，再重复相同的乙醇浸润一次，无菌水洗涤后置于50℃下热处理5～8min；
接种培养
(1)将预处理后生姜茎尖接种于缓释培养基中进行初代培养，所述缓释培养基是在MS基础培养基补充6-BA 0.5～1.5mg/L、NAA缓释生长素2～3mg/L、TDZ 0.25～0.3mg/L，2％蔗糖，琼脂0.55～0.65％，调节pH为5.8～6；
其中NAA缓释生长素是将纳米SiO2分散于去乙醇离子水溶液中，加入NAA，再加入PVP k30，混合后加热至80～90℃保温20～30min，停止加热，冷却至室温，随后过滤、干燥制得，SiO2、NAA和PVP k30的质量比为4～6：1：0.03～0.08；
(2)在28℃，相对湿度为60～70％下暗室培养至长出白色、绿色的愈伤组织，以及芽苗，待芽苗长到4～5cm时，将芽苗截去上部叶及叶鞘，重新置于培养基中，并向培养基中加入补充了0.2％蔗糖和0.6％的琼脂的，NH4NO3浓度减半的MS基础培养基，并补加0.5～1mg/L的PP333，MS基础培养基和缓释培养基的体积比为1:3，保持相同温度和湿度，先在光照强度为1500～1800Lux下持续培养24h，再在无光照环境下培养24h的交替培养方式培养得增殖的生根苗；
本发明具有如下技术效果：
本发明通过将NAA包裹与纳米SiO2中，在生姜组织培养过程缓慢释放NAA，使得在不同阶段培养基中生长调节剂的浓度逐渐发生变化，以适应丛生芽培养、增殖苗的培养以及生根苗的培养在一个培养基中就可完全实现，简化了组织培养步骤，缩短了培养时间，提高了芽苗成活率和脱毒率，成活率达到96％，脱毒率达到100％，同时防止了生姜组织培养过程中产生变异，增殖系数显著提高，达到5.13，生根率达到97.7％，培育健壮的生姜带根苗。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行具体的描述，有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明进行进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述本发明内容对本发明作出一些非本质的改进和调整。
实施例1
一种组织培养快速繁殖生姜的方法，其特征在于，按如下步骤进行：
预处理：取大小为0.6cm的生姜茎尖，用体积浓度为70％的乙醇浸润30s，然后采用无菌水洗涤，再重复相同的乙醇浸润一次，无菌水洗涤后置于50℃下热处理5min；
接种培养
(1)将预处理后生姜茎尖接种于缓释培养基中进行初代培养，所述缓释培养基是在MS基础培养基补充6-BA 0.5mg/L、NAA缓释生长素2mg/L、TDZ 0.3mg/L，2％蔗糖，琼脂0.55％，调节pH为5.8；
其中NAA缓释生长素是将纳米SiO2分散于去乙醇离子水溶液中，加入NAA，再加入PVP k30，混合后加热至80℃保温30min，停止加热，冷却至室温，随后过滤、干燥制得，SiO2、NAA和PVP k30的质量比为6：1：0.03，乙醇水溶液是由乙醇和纯化水的体积比为1:1组成，纳米SiO2和乙醇水溶液的质量体积比为 1g：15mL；
(2)在28℃，相对湿度为70％下暗室培养至长出白色、绿色的愈伤组织，以及芽苗，待芽苗长到4～5cm时，将芽苗截去上部叶及叶鞘，重新置于培养基中，并向培养基中加入补充了0.2％蔗糖和0.6％的琼脂的，NH4NO3浓度减半的 MS基础培养基，并补加0.5mg/L的PP333，MS基础培养基和缓释培养基的体积比为1:3，保持相同温度和湿度，先在光照强度为1500Lux下持续培养24h，再在无光照环境下培养24h的交替培养方式培养得增殖的生根苗；
实施例2
一种组织培养快速繁殖生姜的方法，其特征在于，按如下步骤进行：
预处理：取大小为0.8cm的生姜茎尖，用体积浓度为70％的乙醇浸润40s，然后采用无菌水洗涤，再重复相同的乙醇浸润一次，无菌水洗涤后置于50℃下热处理8min；
接种培养
(1)将预处理后生姜茎尖接种于缓释培养基中进行初代培养，所述缓释培养基是在MS基础培养基补充6-BA 1.5mg/L、NAA缓释生长素3mg/L、TDZ 0.25mg/L，2％蔗糖，琼脂0.65％，调节pH为6；
其中NAA缓释生长素是将纳米SiO2分散于去乙醇离子水溶液中，加入NAA，再加入PVP k30，混合后加热至90℃保温20min，停止加热，冷却至室温，随后过滤、干燥制得，SiO2、NAA和PVP k30的质量比为4：1：0.08，乙醇水溶液是由乙醇和纯化水的体积比为1:1组成，纳米SiO2和乙醇水溶液的质量体积比为 1g：10mL；
(2)在28℃，相对湿度为60％下暗室培养至长出白色、绿色的愈伤组织，以及芽苗，待芽苗长到4～5cm时，将芽苗截去上部叶及叶鞘，重新置于培养基中，并向培养基中加入补充了0.2％蔗糖和0.6％的琼脂的，NH4NO3浓度减半的 MS基础培养基，并补加1mg/L的PP333，MS基础培养基和缓释培养基的体积比为1:3，保持相同温度和湿度，先在光照强度为1800Lux下持续培养24h，再在无光照环境下培养24h的交替培养方式培养得增殖的生根苗；
实施例3
一种组织培养快速繁殖生姜的方法，其特征在于，按如下步骤进行：
预处理：取大小为0.7cm的生姜茎尖，用体积浓度为70％的乙醇浸润35s，然后采用无菌水洗涤，再重复相同的乙醇浸润一次，无菌水洗涤后置于50℃下热处理6min；
接种培养
(1)将预处理后生姜茎尖接种于缓释培养基中进行初代培养，所述缓释培养基是在MS基础培养基补充6-BA 1mg/L、NAA缓释生长素2.5mg/L、TDZ 0.28mg/L，2％蔗糖，琼脂0.6％，调节pH为5.8；
其中NAA缓释生长素是将纳米SiO2分散于去乙醇离子水溶液中，加入NAA，再加入PVP k30，混合后加热至85℃保温25min，停止加热，冷却至室温，随后过滤、干燥制得，SiO2、NAA和PVP k30的质量比为5：1：0.05，乙醇水溶液是由乙醇和纯化水的体积比为1:1组成，纳米SiO2和乙醇水溶液的质量体积比为 1g：12mL；
(2)在28℃，相对湿度为65％下暗室培养至长出白色、绿色的愈伤组织，以及芽苗，待芽苗长到4～5cm时，将芽苗截去上部叶及叶鞘，重新置于培养基中，并向培养基中加入补充了0.2％蔗糖和0.6％的琼脂的，NH4NO3浓度减半的 MS基础培养基，并补加0.8mg/L的PP333，MS基础培养基和缓释培养基的体积比为1:3，保持相同温度和湿度，先在光照强度为1600Lux下持续培养24h，再在无光照环境下培养24h的交替培养方式培养得增殖的生根苗；
本发明中MS培养基的基本组成如表1所示。
表1：
在组织培养过程中，从接种开始每3天观察一次，根据茎尖的生长情况定时地统计污染率和生长状况：
污染率(％)＝(污染外植体个数/外植体总数)×100；
增殖系数＝(生成的有效苗数/接种苗数)
增殖率(％)＝(增殖的丛生芽数/接种总苗数)×100；
生根率(％)＝(生根苗个数/接种苗数)×100；
在组织培养过程中，较高的激素水平有利于茎尖脱毒，但是较高的激素水平在诱导培养过程中，芽苗容易变异，在预处理过程中，用0.6～0.8cm的生姜茎尖分为三组，分别采用如下预处理手段：(1)1次体积浓度为70％的乙醇浸润后，用体积浓度为0.1％升汞(HgCl2)浸泡20min，无菌水洗涤后在38℃下处理5min，随后接种于本发明的缓释培养基中培养；(2)采用1次体积浓度为70％的乙醇浸润后，无菌水洗涤后在38℃下处理5min，在福利平35℃下、40mg/L溶液中浸泡处理20min，随后接种于本发明的缓释培养基中培养；(3)采用本发明中采用体积浓度70％的乙醇浸润30s后，采用无菌水洗涤后，再重复乙醇浸润30s，然后在50℃高温处理5min，随后接种于本发明的缓释培养基中培养。
表:2：生姜诱导成活率和脱毒率
从表中可以看出，采用传统的乙醇浸润以及升汞浸泡处理后，在一定温度处理后，生姜茎尖的脱毒率显著提高，但是成活率受到了显著抑制。而采用乙醇表面消毒后高温处理，再结合抗生素处理，生姜茎尖的成活率有明显提高，但是脱毒率有一定的下降，采用本发明两次乙醇浸润，结合较高的高温处理，生姜茎尖的成活率进一步得到提高，脱毒率达到100％。
将本发明制备的SiO2包覆的NAA加入到MS基础培养基中，添加浓度为 3mg/L，每隔5天检测一次培养基中NAA的浓度变化如下：
表3：NAA缓释生长素在培养基中随时间的浓度变化。
| 起始浓度 | 第5天 | 第10天 | 第15天 | 第20天 | 第25天 | |
| NAA的浓度 | 0.073mg/L | 0.196mg/L | 0.276mg/L | 0.349mg/L | 0.454mg/L | 0.455mg/L |
在组织培养过程中，我们将本发明方法预处理后的茎尖直接接种在本发明 MS基础培养基+1.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA进行培养，作为对照组1；我们将本发明方法预处理后的茎尖直接接种在本发明MS基础培养基+1mg/L 6-BA +0.5mg/L NAA+0.1mg/L TDZ进行培养，作为对照组2；我们将本发明方法预处理后的茎尖直接接种在本发明配制的缓释培养基中培养，中间不添加任何物质，作为对照组3；本发明则按照实施例3进行培养，最终培养结果如表4所示。
表4
| 分组 | 接种外植体数 | 增殖系数 | 生根率 | 异常株数 | 培养时间 |
| 对照组1 | 20 | 1.14 | 58.9 | 2 | 38天 |
| 对照组2 | 20 | 2.88 | 86.4 | 4 | 25天 |
| 对照组3 | 20 | 3.55 | 90.3 | 5 | 25天 |
| 本发明 | 20 | 5.13 | 97.7 | 0 | 25天 |
通过上述组织培养对比，可见，对照组1中由于启动培养基中生长素浓度 NAA过高，抑制了丛生芽的诱导效率，使得增殖率较低，且生根率也较低；对照组2中在培养基中增加了0.1mg/L TDZ(类细胞分裂素)，但是该浓度下没有起到快速启动诱导的作用，仅仅是增加了细胞分裂素/生长素的比例，从而增强诱导丛生芽生成的作用，对照组3中采用本发明配制的缓释培养基，使得起始时 NAA浓度较低，有利于丛生芽的诱导生成，在培养过程中NAA浓度随培养时间逐渐上升促进了丛生芽生长出幼根，但是到后期生长调节剂的整体浓度过高，导致带根苗出现异常；本发明中采用了特定的缓释培养基，并在诱导生成丛生芽完成后，添加了原缓释培养基体积的1/3的NH4NO3浓度减半的MS基础培养基，调节了各生长调节剂的在培养基中的浓度，减少了异常带根苗的产生，并加入1～1.5mg/L的PP333与生长素产生受体竞争，从而达到壮苗的作用。本发明中生姜组织培养过程使得诱导培养、增殖培养和生根培养均在该培养基中完成，大大简化了培养步骤，缩短了培养时间，培养的带根苗健壮。
Claims (5)
1.一种组织培养快速繁殖生姜的方法，其特征在于：是取大小为0.6~0.8cm的生姜茎尖预处理后置于缓释培养基上诱导产生丛生芽，随后在缓释培养基中加入NH4NO3浓度减半的MS基础培养基，并补加0.5~1mg/L的PP333 ，持续培养获得带根苗；所述的缓释培养基是由MS基础培养基、6-BA 0.5~1.5mg/L、NAA 缓释生长素2~3mg/L、TDZ 0.25~0.3mg/L，2%蔗糖，琼脂0.55~0.65%组成，并调节pH为5.8~6；所述NAA缓释生长素是将纳米SiO2分散于去乙醇离子水溶液中，加入NAA，再加入PVP k30，混合后加热至80~90℃保温20~30min，停止加热，冷却至室温，随后过滤、干燥，所述预处理是采用体积浓度为70%的乙醇浸润0.6~0.8cm的生姜茎尖30~40s，然后采用无菌水洗涤，再重复相同的乙醇浸润一次，无菌水洗涤后置于50℃下加热5~8min。
2.如权利要求1所述的一种组织培养快速繁殖生姜的方法，其特征在于：所述纳米SiO2、NAA和PVP k30的质量比为4~6：1：0.03~0.08。
3.如权利要求1或2所述的一种组织培养快速繁殖生姜的方法，其特征在于：在缓释培养基中加入NH4NO3浓度减半的MS基础培养基的同时，按照MS基础培养基的添加量补加2%蔗糖和0.6%的琼脂，NH4NO3 浓度减半的MS基础培养基和缓释培养基的体积比为1:3。
4.如权利要求1所述的一种组织培养快速繁殖生姜的方法，其特征在于：所述培养具体是先在28℃，相对湿度为60~70%下暗室培养至长出白色、绿色的愈伤组织，以及芽苗，待芽苗长到4~5cm时，将芽苗截去上部叶及叶鞘，重新置于培养基中，先在光照强度为1500~1800Lux下持续培养24h，再在无光照环境下培养24h，交替培养得增殖的生根苗。
5.一种组织培养快速繁殖生姜的方法，其特征在于，按如下步骤进行：
预处理：
取大小为0.6~0.8cm的生姜茎尖，用体积浓度为70%的乙醇浸润30~40s，然后采用无菌水洗涤，再重复相同的乙醇浸润一次，无菌水洗涤后置于50℃下热处理5~8min；
接种培养：
（1）将预处理后的生姜茎尖接种于缓释培养基中进行初代培养，所述缓释培养基是由MS基础培养基、6-BA 0.5~1.5mg/L、NAA 缓释生长素2~3mg/L、TDZ 0.25~0.3mg/L，2%蔗糖，琼脂0.55~0.65%组成，并调节pH为5.8~6；其中NAA 缓释生长素是将纳米SiO2分散于去乙醇离子水溶液中，加入NAA，再加入PVPk30，混合后加热至80~90℃保温20~30min，停止加热，冷却至室温，随后过滤、干燥制得，SiO2 、NAA和PVP k30的质量比为4~6：1：0.03~0.08；
（2）在28℃，相对湿度为60 ~ 70%下暗室培养至长出白色、绿色的愈伤组织，以及芽苗，待芽苗长到4~5cm时，将芽苗截去上部叶及叶鞘，重新置于培养基中，并向培养基中加入补充了0.2%蔗糖和0.6%的琼脂、且NH4NO3浓度减半的MS基础培养基，并补加0.5~1mg/L的PP333，MS基础培养基和缓释培养基的体积比为1:3，保持相同温度和湿度，先在光照强度为1500~1800Lux下持续培养24h，再在无光照环境下培养24h的交替培养方式培养得增殖的生根苗。
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