CN114606257A - 石榴农杆菌遗传转化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了石榴农杆菌遗传转化的方法，方法步骤如下：S1：选择组培继代石榴植株的嫩叶/茎尖/幼嫩茎段接种至预培养培养基；S2：将携带目的基因农杆菌接种至培养基中，摇菌至OD600＝0.6‑0.8，对收集的菌体进行清洗，并通过侵染培养基重悬菌体，制得农杆菌侵染液；S3：将S1中预培养后的嫩叶/茎尖/幼嫩茎段置于农杆菌侵染液中侵染；S4：将S3中侵染后的嫩叶/茎尖/幼嫩茎段晾干并接种至共培养培养基进行培养；S5：对S4中共培养后的嫩叶/茎尖/幼嫩茎段进行清洗、晾干，然后接种至选择培养基进行培养；S6：将S5中选择培养基上已分化的不定芽取出，接种至继代培养几种进行培养；S7：炼苗及移栽。本发明显著提高了不定芽出芽率和遗传转化成功率。

Description

石榴农杆菌遗传转化的方法
技术领域
本发明涉及遗传转化技术领域，尤其涉及石榴农杆菌遗传转化的方法。
背景技术
农杆菌介导的遗传转化是最为经济也是最为普遍的遗传转化途径之一。其操作相对简单，安全性较高。但是石榴的遗传转化目前为止研究的较为有限，较多见于石榴种子的下胚轴，但是由于石榴许多品种为杂合体，种子繁殖后代会出现性状分离等特征，导致遗传背景不清晰，不能够进行育种与相关基因功能的研究。
此外，由于木本植物的酚类物质较多，因此，在组织培养、共培养等遗传转化过程中会出现较为明显的褐化现象，导致转化率下降，甚至出现完全失败的情况，因此如何解决石榴遗传转化过程中褐化的问题，也是本领域亟需攻克的难题。
发明内容
基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了石榴农杆菌遗传转化的方法，解决了石榴在遗传转化过程中褐化的问题，显著提高了不定芽出芽率和遗传转化成功率。
本发明提出的石榴农杆菌遗传转化的方法，方法步骤如下：
S1：预培养
选择组培继代石榴植株的嫩叶/茎尖/幼嫩茎段接种至预培养培养基；
S2：农杆菌侵染液的制备
将携带目的基因农杆菌接种至LB培养基100mL+卡那霉素50mg/L+利福平25mg/L中，摇菌至OD600＝0.6-0.8，对收集的菌体进行清洗，并通过侵染培养基重悬菌体，制得农杆菌侵染液；
S3：农杆菌侵染
将S1中预培养后的嫩叶/茎尖/幼嫩茎段置于农杆菌侵染液中侵染；
S4：共培养
将S3中侵染后的嫩叶/茎尖/幼嫩茎段晾干并接种至共培养培养基进行培养；
S5：选择培养
对S4中共培养后的嫩叶/茎尖/幼嫩茎段进行清洗、晾干，然后接种至选择培养基进行培养；
S6：继代培养
将S5中选择培养基上已分化的不定芽取出，接种至继代培养几种进行培养；
S7：炼苗及移栽。
优选地，所述S1中组培继代石榴植株的制备方法如下：将石榴枝条进行茎尖脱毒接种至WPM+IBA0.5-0.7mg/L+琼脂6g/L+蔗糖20-30g/L+活性炭0.6-1.2g/L培养基中，每30-40d继代一次。
优选地，所述组培继代石榴植株为第二代继代植株。
优选地，所述S1中预培养基为WPM+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.22mg/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L，培养时间为1-4d。
优选地，所述S2中侵染培养基为WPM+AS 200μmol/L+糖30g/L。
优选地，所述S4中共培养培养基为WPM+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.22mg/L+AS 200μmol/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L，于25±3℃培养2-3d，光照2000-5000lux。
优选地，所述S5中选择培养基为WPM+IBA 0.4-0.8mg/L+6-BA 0.22mg/L+卡那霉素50mg/L+特美汀200mg/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L。
优选地，所述S6中继代培养基为WPM+IBA0.4-0.8mg/L+卡那霉素50mg/L+特美汀200mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L，pH为6.5，培养时间25-30d。
优选地，所述S7中炼苗的温度为25±2℃、光照2000-5000lux、湿度50-80％。
本发明的有益技术效果：
(1)本发明的遗传转化方法可以适用于软籽，硬籽，半软籽等不同种类的石榴品种，具有普适性，利用转基因手段获得目的性状改良新品种，在解析基因功能、分析调控性状的分子机理、推进石榴分子育种进程等方面具有重要意义。
(2)本发明通过对组培苗的继代及培养基的选择，杜绝了褐化现象，显著提高了不定芽出芽率和遗传转化成功率(现有的遗传转化成功率仅5％左右)。
附图说明
图1为本发明提出的石榴遗传转化步骤示意图；A为农杆菌侵染叶片后共培养、B为愈伤的诱导和阳性抗性转化筛选、C为阳性转化不定芽的诱导、D为不定芽生根、E为转基因植株炼苗、F为获得转基因植株；
图2为本发明提出的石榴转基因幼苗；(a)为白花玉石籽石榴、(b)为wonderful石榴、(c)为净皮甜石榴、(d)为红玛瑙石榴；
图3为本发明提出的组织培养25d后的转基因石榴和野生型石榴生长状态及转基因石榴的外源基因检测；A为转基因石榴、B为野生型石榴、C为转基因石榴的外源基因RT-PCR结果；
图4为本发明提出的石榴叶片接种35d后，石榴叶片愈伤组织分化情况。
具体实施方式
实施例1
S1：预培养
选择白花玉石籽石榴的组培继代石榴植株的嫩叶接种至预培养培养基；
其中组培继代石榴植株的制备方法如下：将石榴枝条进行茎尖脱毒接种至WPM+IBA0.6mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.8g/L培养基中，每30d继代一次，并选择第二代继代植株；预培养基为WPM+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.22mg/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L，培养时间为3d。
S2：农杆菌侵染液的制备
将携带石榴矮化基因PgCYP734A1的农杆菌接种至LB培养基100mL+卡那霉素50mg/L+利福平25mg/L中，摇菌至OD600＝0.6，对收集的菌体进行清洗，并通过侵染培养基重悬菌体，制得农杆菌侵染液；侵染培养基为WPM+AS 200μmol/L+糖30g/L。
S3：农杆菌侵染
将S1中预培养3d后的嫩叶置于农杆菌侵染液中侵染10min；
S4：共培养
将S3中侵染后的嫩叶晾干并接种至共培养培养基进行培养；共培养培养基为WPM+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.22mg/L+AS 200μmol/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L，于25℃培养2d，光照3000lux。
S5：选择培养
对S4中共培养后的嫩叶放入无菌水中清洗4遍，然后用含有200mg/mL的TMT的无菌水浸泡，最后放在无菌滤纸上晾干，将处理后的嫩叶接种至选择培养基进行培养；选择培养基为WPM+IBA 0.6mg/L+6-BA0.22mg/L+卡那霉素50mg/L+特美汀200mg/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L。
S6：继代培养
将S5中选择培养基上已分化的不定芽取出，接种至继代培养几种进行培养；继代培养基为WPM+IBA 0.6mg/L+卡那霉素50mg/L+特美汀200mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L，pH为6.5，培养时间25d。
S7：炼苗及移栽
炼苗的温度为25℃、光照3500lux、湿度70％。移栽要求：基质要高温灭菌，防止组培苗受到病虫侵害的影响，提高组培苗的抵抗力。此外，在移栽后穴盘上覆盖塑料薄膜以防水分散失，在移栽初期相对湿度为80％以上，以后慢慢降低，浇灌无菌营养液。
采用上述方法对150株外植体进行转化，获得36个转基因株系，转化率为24.0％，转基因幼苗如图2(a)所示。
对实施例1制备的转基因苗的目标基因进行检测，结果如图4所示，RT-PCR结果显示：转基因石榴扩增片段与载体扩增条带位置相同(图3C)；即：已成功获得PgCYP734A1过表达转基因石榴。将获得的过表达PgCYP734A1组培苗与野生型石榴组培苗同时培养25d后，转基因植株明显出现茎节缩短、叶片细长、植株矮小的特点。
实施例2
S1：预培养
选择wonderful石榴的组培继代石榴植株的嫩叶接种至预培养培养基；
其中组培继代石榴植株的制备方法如下：将石榴枝条进行茎尖脱毒接种至WPM+IBA 0.6mg/L+琼脂6g/L+蔗糖20g/L+活性炭0.8g/L培养基中，每30d继代一次，并选择第二代继代植株；预培养基为WPM+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.22mg/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L，培养时间为3d。
S2：农杆菌侵染液的制备
将携带石榴矮化基因PgCYP734A1的农杆菌接种至LB培养基100mL+卡那霉素50mg/L+利福平25mg/L中，摇菌至OD600＝0.7，对收集的菌体进行清洗，并通过侵染培养基重悬菌体，制得农杆菌侵染液；侵染培养基为WPM+AS 200μmol/L+糖30g/L。
S3：农杆菌侵染
将S1中预培养后的嫩叶置于农杆菌侵染液中侵染；
S4：共培养
将S3中侵染后的嫩叶晾干并接种至共培养培养基进行培养；共培养培养基为WPM+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.22mg/L+AS 200μmol/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L，于22℃培养2d，光照2000lux。
S5：选择培养
对S4中共培养后的嫩叶放入无菌水中清洗4遍，然后用含有200mg/mL的TMT的无菌水浸泡，最后放在无菌滤纸上晾干，将处理后的嫩叶接种至选择培养基进行培养；选择培养基为WPM+IBA 0.4mg/L+6-BA0.22mg/L+卡那霉素50mg/L+特美汀200mg/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L。
S6：继代培养
将S5中选择培养基上已分化的不定芽取出，接种至继代培养几种进行培养；继代培养基为WPM+IBA 0.4mg/L+卡那霉素50mg/L+特美汀200mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L，pH为6.5，培养时间25-30d。
S7：炼苗及移栽
炼苗的温度为23℃、光照2000lux、湿度50％。移栽要求：基质要高温灭菌，防止组培苗受到病虫侵害的影响，提高组培苗的抵抗力。此外，在移栽后穴盘上覆盖塑料薄膜以防水分散失，在移栽初期相对湿度为80％以上，以后慢慢降低，浇灌无菌营养液。
采用上述方法对150株外植体进行转化，获得22个转基因株系，转化率为14.67％，转基因幼苗如图2(b)所示。
实施例3
S1：预培养
选择净皮甜石榴的组培继代石榴植株的嫩叶接种至预培养培养基；
其中组培继代石榴植株的制备方法如下：将石榴枝条进行茎尖脱毒接种至WPM+IBA0.6mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L+活性炭0.8g/L培养基中，每40d继代一次，并选择第二代继代植株；预培养基为WPM+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.22mg/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L，培养时间为3d。
S2：农杆菌侵染液的制备
将携带石榴矮化基因PgCYP734A1的农杆菌接种至LB培养基100mL+卡那霉素50mg/L+利福平25mg/L中，摇菌至OD600＝0.8，对收集的菌体进行清洗，并通过侵染培养基重悬菌体，制得农杆菌侵染液；侵染培养基为WPM+AS 200μmol/L+糖30g/L。
S3：农杆菌侵染
将S1中预培养后的嫩叶置于农杆菌侵染液中侵染；
S4：共培养
将S3中侵染后的嫩叶晾干并接种至共培养培养基进行培养；共培养培养基为WPM+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.22mg/L+AS 200μmol/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L，于28℃培养3d，光照5000lux。
S5：选择培养
对S4中共培养后的嫩叶放入无菌水中清洗4-5遍，然后用含有200mg/mL的TMT的无菌水浸泡，最后放在无菌滤纸上晾干，将处理后的嫩叶接种至选择培养基进行培养；选择培养基为WPM+IBA0.6mg/L+6-BA0.22mg/L+卡那霉素50mg/L+特美汀200mg/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L。
S6：继代培养
将S5中选择培养基上已分化的不定芽取出，接种至继代培养几种进行培养；继代培养基为WPM+IBA 0.6mg/L+卡那霉素50mg/L+特美汀200mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L，pH为6.5，培养时间30d。
S7：炼苗及移栽
炼苗的温度为27℃、光照5000lux、湿度80％。移栽要求：基质要高温灭菌，防止组培苗受到病虫侵害的影响，提高组培苗的抵抗力。此外，在移栽后穴盘上覆盖塑料薄膜以防水分散失，在移栽初期相对湿度为80％以上，以后慢慢降低，浇灌无菌营养液。
采用上述方法对150株外植体进行转化，获得42个转基因株系，转化率为28.0％，转基因幼苗如图2(c)所示。
实施例4
选择白花玉石籽石榴的组培继代石榴植株的红玛瑙石榴的幼嫩茎段进行接种，且与条件均与实施例1相同。
采用上述方法对150株外植体进行转化，获得18个转基因株系，转化率为12.0％，转基因幼苗如图2(d)所示。
此外，为了解决石榴遗传转化过程中的褐化问题，申请人在本发明技术方案的基础上对共培养培养基的组分进行调整，进一步解决了褐化的问题，结果如表1和图4所示。
表1石榴叶片愈伤组织分化情况
组别 愈伤诱导激素 褐化率/％ 不定芽出芽率/％
A 0.22mg·L<sup>-1</sup>6-BA+0.4mg·L<sup>-1</sup>IBA 0±0 12.44±0.36
B 0.22mg·L<sup>-1</sup>6-BA+0.5mg·L<sup>-1</sup>IBA 0±0 53.27±0.58
C 0.22mg·L<sup>-1</sup>6-BA+0.6mg·L<sup>-1</sup>IBA 0±0 95.43±0.22
D 0.22mg·L<sup>-1</sup>6-BA+0.7mg·L<sup>-1</sup>IBA 32.18±0.11 98.36±0.17
由表1可知，采用本申请的培养基不仅解决了褐化的问题，而且还能够保证高不定芽出芽率。
以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.石榴农杆菌遗传转化的方法，其特征在于，方法步骤如下：
S1：预培养
选择组培继代石榴植株的嫩叶/茎尖/幼嫩茎段接种至预培养培养基；
S2：农杆菌侵染液的制备
将携带目的基因农杆菌接种至LB培养基100mL+卡那霉素50mg/L+利福平25mg/L中，摇菌至OD600＝0.6-0.8，对收集的菌体进行清洗，并通过侵染培养基重悬菌体，制得农杆菌侵染液；
S3：农杆菌侵染
将S1中预培养后的嫩叶/茎尖/幼嫩茎段置于农杆菌侵染液中侵染；
S4：共培养
将S3中侵染后的嫩叶/茎尖/幼嫩茎段晾干并接种至共培养培养基进行培养；
S5：选择培养
对S4中共培养后的嫩叶/茎尖/幼嫩茎段进行清洗、晾干，然后接种至选择培养基进行培养；
S6：继代培养
将S5中选择培养基上已分化的不定芽取出，接种至继代培养几种进行培养；
S7：炼苗及移栽。
2.根据权利要求1所述的石榴农杆菌遗传转化的方法，其特征在于，所述S1中组培继代石榴植株的制备方法如下：将石榴枝条进行茎尖脱毒接种至WPM+IBA0.5-0.7mg/L+琼脂6g/L+蔗糖20-30g/L+活性炭0.6-1.2g/L培养基中，每30-40d继代一次。
3.根据权利要求1所述的石榴农杆菌遗传转化的方法，其特征在于，所述组培继代石榴植株为第二代继代植株。
4.根据权利要求1所述的石榴农杆菌遗传转化的方法，其特征在于，所述S1中预培养基为WPM+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.22mg/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L，培养时间为1-4d。
5.根据权利要求1所述的石榴农杆菌遗传转化的方法，其特征在于，所述S2中侵染培养基为WPM+AS 200μmol/L+糖30g/L。
6.根据权利要求1所述的石榴农杆菌遗传转化的方法，其特征在于，所述S4中共培养培养基为WPM+IBA 0.6mg/L+6-BA 0.22mg/L+AS 200μmol/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L，于25±3℃培养2-3d，光照2000-5000lux。
7.根据权利要求1所述的石榴农杆菌遗传转化的方法，其特征在于，所述S5中选择培养基为WPM+IBA 0.4-0.8mg/L+6-BA 0.22mg/L+卡那霉素50mg/L+特美汀200mg/L+琼脂5.5g/L+糖30g/L。
8.根据权利要求1所述的石榴农杆菌遗传转化的方法，其特征在于，所述S6中继代培养基为WPM+IBA0.4-0.8mg/L+卡那霉素50mg/L+特美汀200mg/L+琼脂6g/L+蔗糖30g/L，pH为6.5，培养时间25-30d。
9.根据权利要求1所述的石榴农杆菌遗传转化的方法，其特征在于，所述S7中炼苗的温度为25±2℃、光照2000-5000lux、湿度50-80％。
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