CN108085334B - 一种改良的农杆菌转化大麦小孢子方法 - Google Patents

一种改良的农杆菌转化大麦小孢子方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种改良的农杆菌转化大麦小孢子方法。具体而言，本发明提供一种农杆菌转化大麦小孢子的方法，所述方法包括以每1×105个小孢子1.0×106～2.0×106个农杆菌的接种浓度用农杆菌侵染小孢子30～60小时的步骤。本发明还涉及采用所述农杆菌转化大麦小孢子的方法制备大麦小孢子愈伤组织以及再生植株的方法。本发明通过降低农杆菌接种量，减少培养基更换次数，减少农杆菌和小孢子共培养时间，使农杆菌转化小孢子技术操作更加简单、省时、省钱。

Description

一种改良的农杆菌转化大麦小孢子方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种改良的农杆菌转化大麦小孢子方法。
背景技术
常规育种方法主要是对自然突变产生的优良基因和重组体的选择和利用，通过随机和自然方式来积累优良基因，或者采用人工杂交的方法，进行优良基因在不同品种之间的重组而实现遗传改良。随着分子生物学的发展，能和传统育种方法互补的分子育种手段应运而生。转基因方法可以在短时间内定向培育出抗病抗逆性强、产量高、品质好的作物品种，并且抗病虫害的品种可以减少化学农药的使用，符合生态环境保护的长远利益。
大麦是世界第四大禾谷类作物，生长周期短，环境适应性强，种植范围广。近年来，大麦已完成全基因组测序，并建成高密度遗传图谱，这将推动大麦重要基因的定位和克隆。随着大麦基因组信息的不断完善，需要对大量的目标基因开展功能研究。大麦转基因技术是实现基因功能验证的重要一环，同时将成为作物育种的重要方法。
植物小孢子(Microspore)是由花粉母细胞经减数分裂后形成的四分体产生的单倍体性细胞，在离体胁迫条件下可以由原有的配子体发育途径转向孢子体发育途径，经胚胎发育形成完整植株。利用这一单倍体性细胞培养体系进行基因转化，可快速通过染色体加倍可以快速纯合、稳定下来，同时可以获得高频再生植株。因此，小孢子是优良的转基因受体。Kumlehn等(2006)报道了一种农杆菌转化大麦小孢子的方法，但是其操作复杂，转化需要多种培养基；耗时较长，小孢子和农杆菌共培养需要一个月。
发明内容
本发明第一方面提供一种农杆菌转化大麦小孢子的方法，所述方法包括以每1×105个小孢子1.0×106～2.0×106个农杆菌的接种浓度用农杆菌侵染小孢子30～60小时的步骤。
在一个或多个实施方案中，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.0×106～1.5×106个农杆菌。
在一个或多个实施方案中，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.3×106～1.4×106个农杆菌。
在一个或多个实施方案中，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液使用15～25μL的含1.5×106～2.5×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
在一个或多个实施方案中，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液添加18～22μL的含1.8×106～2.3×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
在一个或多个实施方案中，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液添加18～22μL的含1.9×106～2.1×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
在一个或多个实施方案中，接种前，将所述小孢子悬浮液室温暗培养10天，加入乙酰丁香酮至终浓度为90～110mg/L，然后接种农杆菌。
在一个或多个实施方案中，用诱导培养基配制所述小孢子悬浮液，其中，所述诱导培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有70～110g/L麦芽糖、0.3～0.6mg/LKT、0.8～1.2mg/L 2,4-D、0.960～0.985g/L MES、300～500mg/L水解干酪素和1400～1800mg/L谷氨酰胺，pH为5.6～6.0。
在一个或多个实施方案中，所述诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L水解干酪素及1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8。
本发明第二方面提供一种制备大麦小孢子愈伤组织的方法，所述方法包括：
(1)以每1×105个小孢子1.0×106～2.0×106个农杆菌的接种浓度用农杆菌侵染小孢子30～60小时；
(2)清洗步骤(1)的小孢子；和
(3)用含头孢噻肟钠、氨苄青霉素和乙酰丁香酮的诱导培养基室温培养步骤(2)获得的所述小孢子9天。
在一个或多个实施方案中，每1.5mL的含1×105个小孢子的小孢子悬浮液使用15～25μL的含1.0×106～2.0×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
在一个或多个实施方案中，接种前，将所述小孢子悬浮液室温暗培养10天，加入乙酰丁香酮至终浓度为90～110mg/L，然后接种农杆菌。
在一个或多个实施方案中，用诱导培养基配制所述小孢子悬浮液，其中，所述诱导培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有70～110g/L麦芽糖、0.3～0.6mg/LKT、0.8～1.2mg/L 2,4-D、0.960～0.985g/L MES、300～500mg/L水解干酪素和1400～1800mg/L谷氨酰胺，pH为5.6～6.0。
在一个或多个实施方案中，所述诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L水解干酪素及1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)中，用制备小孢子悬液所用的诱导培养基清洗小孢子1～4次。
在一个或多个实施方案中，步骤(3)中，所述诱导培养基中，头孢噻肟钠的浓度为90～110mg/L，氨卞青霉素的浓度为90～110mg/L，乙酰丁香酮的终浓度为90～110mg/L。
本发明第三方面提供一种制备大麦再生植株的方法，所述方法包括如本发明第二方面所述制备获得大麦小孢子的愈伤组织，用分化培养基培养所述愈伤组织，从而获得再生植株的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基以2/3MS培养基为基础，添加有20～40g/L的麦芽糖、0.3～0.7mg/L的6-BA、1.3～1.7mg/L的KT、0.03～0.07mg/L的NAA和4.5～6.5g/L的琼脂，90～110mg/L的头孢噻肟钠，90～110mg/L的氨卞青霉素，和90～110mg/L的乙酰丁香酮，pH为5.6～6.0。
在一个或多个实施方案中，所述分化培养基为2/3MS，添加有30g/L的麦芽糖、0.5mg/L的6-BA、1.5mg/L的KT、0.05mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂，100mg/L的头孢噻肟钠，100mg/L的氨苄青霉素和100mg/L乙酰丁香酮，pH 5.8。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括待分化芽长至2～4cm时将其转移至壮苗培养基的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述壮苗培养基以1/2MS配制，添加有10～40g/L的蔗糖，0.02-0.08mg/L的NAA，2.0-10.0mg/L的多效唑(MET)，90～110mg/L的头孢噻肟钠的浓度为和90～110mg/L的氨卞青霉素，pH为5.5～6.2。
本发明的壮苗培养基以1/2MS配制，添加20～40g/L的蔗糖、0.03～0.07mg/L的NAA、3.0～5.0mg/L的多效唑和4.5～6.5g/L的琼脂，pH为5.6～6.0。
在某些实施方案中，壮苗培养基为1/2MS，添加30g/L的蔗糖、0.05mg/L的NAA、4.0mg/L的多效唑和5.5g/L的琼脂，pH为5.8。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括：待再生苗长6～8cm时进行炼苗的步骤。
本发明第四方面提供一种用于制备大麦小孢子愈伤组织的培养物，所述培养物含有大麦小孢子、农杆菌和诱导培养基，其中，所述培养物中，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.0×106～2.0×106个农杆菌。
在一个或多个实施方案中，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.0×106～1.5×106个农杆菌。
在一个或多个实施方案中，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.3×106～1.4×106个农杆菌。
在一个或多个实施方案中，所述培养物中，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液添加15～25μL的含1.5×106～2.5×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
在一个或多个实施方案中，所述培养物中，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液添加18～22μL的含1.8×106～2.3×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
在一个或多个实施方案中，所述培养物中，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液添加18～22μL的含1.9×106～2.1×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
在一个或多个实施方案中，所述诱导培养基为N6基本培养基，但铁盐浓度加倍，添加有70～110g/L麦芽糖、0.3～0.6mg/L KT、0.8～1.2mg/L 2,4-D、0.960～0.985g/L MES、300～500mg/L水解干酪素和1400～1800mg/L谷氨酰胺，pH为5.6～6.0。
在一个或多个实施方案中，所述诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L的水解干酪素及1600mg/L的谷氨酰胺，pH5.8。
在一个或多个实施方案中，所述诱导培养基为N6基本培养基，但铁盐浓度加倍，添加有70～110g/L麦芽糖、0.3～0.6mg/L KT、0.8～1.2mg/L 2,4-D、0.960～0.985g/L MES、300～500mg/L的水解干酪素、1400～1800mg/L的谷氨酰胺、90～110mg/L的头孢噻肟钠，90～110mg/L的氨卞青霉素和90～110mg/L的乙酰丁香酮，pH为5.6～6.0。
在一个或多个实施方案中，所述诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L的水解干酪素及1600mg/L的谷氨酰胺，100mg/L的头孢噻肟钠，100mg/L的氨卞青霉素和100mg/L的乙酰丁香酮，pH5.8。
本发明对农杆菌转化大麦小孢子技术做出改良。通过降低农杆菌接种量，减少培养基更换次数，减少农杆菌和小孢子共培养时间，使农杆菌转化小孢子技术操作更加简单、省时、省钱。这项改良技术可应用于大麦基因功能研究、基因编辑和基因工程育种。
附图说明
图1：不同菌量农杆菌侵染花30小孢子19天时愈伤形成情况。
图2：HvSERK1过量表达载体构建。
图3：HvSERK1基因转化花30小孢子T0代再生植株PCR分子鉴定阳性结果。泳道1、16为Marker，泳道1为水空白对照，泳道2-14、17-28再生植株，泳道29位阴性对照，泳道15、30为包含目的基因的质粒，泳道10、12、13、27为阳性转化植株。
具体实施方式
本发明优化了农杆菌转化大麦小孢子的方法，接种不同菌量农杆菌菌液侵染小孢子，通过观察愈伤形成量确定了最适的侵染菌量；农杆菌侵染时不改变培养基配方，侵染后共培养时间缩短至9天，最终获得一批转基因阳性植株。
具体而言，本发明农杆菌转化大麦小孢子的方法包括以每1×105个小孢子1.0×106～2.0×106个农杆菌的接种浓度用农杆菌侵染小孢子30～60小时的步骤。在某些优选实施方案中，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.0×106～1.5×106个农杆菌。在某些优选实施方案中，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.3×106～1.4×106个农杆菌。在某些实施方案中，侵染时间为40～55小时。在其它实施方案中，侵染时间为45～50小时。
更具体而言，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液使用15～25μL的含1.5×106～2.5×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。在某些优选实施方案中，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液使用18～22μL的含1.8×106～2.3×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。在某些优选实施方案中，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液使用18～22μL的含1.9×106～2.1×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
可用诱导培养基配制所述小孢子悬浮液。本发明所用的诱导培养基以N6培养基为基本培养基。常规的N6培养基的成分基本如下表1所示，不同厂商或文献所记载的不同成分的浓度或许有些许差别，但其功能都大致相同：
表1：N6培养基的配方(单位：mg/L)
N<sub>6</sub>大量元素：
(NH<sub>4</sub>)<sub>2</sub>SO<sub>4</sub> 463
KNO<sub>3</sub> 2830
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O 166
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 185
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub> 400
N<sub>6</sub>微量元素：
H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub> 1.6
KI 0.83
MnSO<sub>4</sub>·4H<sub>2</sub>O 4.4
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 1.5
N<sub>6</sub>铁盐：
Na<sub>2</sub>EDTA 37.3
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O 27.8
N<sub>6</sub>有机元素：
盐酸硫胺素 1.0
盐酸吡多辛 0.5
甘氨酸 2.0
烟酸 0.5
表1示出了适合作为本发明诱导培养基的基础培养基的N6培养基的基础配方。应理解，不同文献、不同市售N6培养基的配方可能有些许不同，但都可用于实施本发明。更具体而言，可对表1中的各成分的浓度做出适当的变动，例如有大约5％(例如3％左右、2％左右、1％左右，或更低的变动范围)或更低的变动，由此配制得到的培养基仍然具有所需的生物学功能，仍能用于实施本发明。
适用于本发明配制小孢子悬浮液的诱导培养基为N6基本培养基，但铁盐浓度加倍，添加有70～110g/L麦芽糖、0.3～0.6mg/L KT、0.8～1.2mg/L 2,4-D、0.960～0.985g/LMES、300～500mg/L水解干酪素和1400～1800mg/L谷氨酰胺，pH为5.6～6.0。
在某些实施方案中，该诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L水解干酪素及1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8。
农杆菌可以是本领域在农杆菌转化大麦小孢子中常用的各种农杆菌，例如Aglo菌株。
在某些实施方案中，接种前，将小孢子悬浮液室温暗培养10天，加入乙酰丁香酮至终浓度为90～110mg/L后接种农杆菌。
小孢子可通过以下方式获得。例如，可从大田或种植于人工气候室的大麦材料选取中部小花，其小孢子发育处于单核早期、中期的穗子，放入冰箱冷藏10～30天，通常是15～25天，例如15天左右。冷藏的温度可以在0～8℃范围之间，例如可以为3～8℃。通常可在约4℃冷藏。
穗子先消毒，例如用饱和的漂白粉溶液消毒10～20min，无菌水冲洗2～4次。每个离心管中接入3～5个穗子的花药，倒入10～15ml的提取液，用高速分散器超速(例如3000～4000rpm)旋切，300目筛网过滤，滤液低速(例如500～800rpm)离心，重复2～3次，收集小孢子。
适用于本发明的提取液可以是55～65g/L、优选60g/L的甘露醇溶液，添加有1.0～1.2g/L、优选1.1g/L的CaCl2，0.960～0.985g/L、优选0.976g/L的2-(N-吗啡啉)乙磺酸(MES)和15～30mg/L、优选20mg/L的秋水仙碱，pH 5.6～6.0，优选5.8。
在某些实施方案中，所述提取液是60g/L的甘露醇溶液，添加1.1g/L CaCl2、0.976g/L MES和20mg/L秋水仙碱，pH 5.8。
提取获得的游离小孢子可先置于所述提取液中，于室温(23～28℃，优选25±1℃)、黑暗中预处理36～54小时，然后再用前文所述的用于配制小孢子悬浮液的诱导培养基洗涤小孢子，然后加入该诱导培养基，将小孢子的密度调节至合适的范围，例如1.0×105/m1，之后，取适量小孢子悬浮液(如1.5ml)接种于培养皿(如30×15mm)中，Parafilm封口，室温下暗培养10天，然后可如前文所述接种农杆菌。
采用本发明农杆菌转化大麦小孢子的方法，可在不改变培养基配方的情况下将侵染后共培养时间缩短至9天，获得小孢子愈伤组织。
因此，本发明也提供一种制备大麦小孢子愈伤组织的方法，所述方法包括：
(1)以每1×105个小孢子1.0×106～2.0×106个农杆菌的接种浓度用农杆菌侵染小孢子30～60小时；
(2)清洗步骤(1)的小孢子；和
(3)用含头孢噻肟钠、氨苄青霉素和乙酰丁香酮的诱导培养基室温培养步骤(2)获得的所述小孢子最多9天；
从而制备得到大麦小孢子愈伤组织。
本发明方法中，步骤(1)可采用前文所述的农杆菌转化大麦小孢子的方法进行。
在某些实施方案中，步骤(2)中，用制备小孢子悬浮液所用的诱导培养基清洗小孢子1～4次。
在某些实施方案中，步骤(3)中的诱导培养基为配制小孢子悬浮液所用的诱导培养基，添加有90～110mg/L的头孢噻肟钠，90～110mg/L的氨卞青霉素，和90～110mg/L的乙酰丁香酮。
可利用采用本发明所述方法制备得到的愈伤组织制备大麦再生植株。因此，本发明也提供一种制备大麦再生植株的方法，所述方法包括如本发明所述制备获得大麦小孢子的愈伤组织，用分化培养基培养所述愈伤组织，从而获得再生植株的步骤。
通常在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下在分化培养基中分化胁迫培养25～30天，直至分化出绿色再生植株。
本发明中，分化培养基以2/3MS培养基为基础，添加有20～40g/L的麦芽糖、0.3～0.7mg/L的6-BA、1.3～1.7mg/L的KT、0.03～0.07mg/L的NAA和4.5～6.5g/L的琼脂，90～110mg/L的头孢噻肟钠，90～110mg/L的氨卞青霉素，和90～110mg/L的乙酰丁香酮，pH为5.6～6.0。
在某些实施方案中，分化培养基为2/3MS，添加有30g/L的麦芽糖、0.5mg/L的6-BA、1.5mg/L的KT、0.05mg/L的NAA、5.5g/L的琼脂，100mg/L的头孢噻肟钠，100mg/L的氨苄青霉素和100mg/L乙酰丁香酮，pH 5.8。
用于配制本发明的分化培养基的MS培养基的配方如下表2所示(单位：mg/L)：
表2
Figure BDA0001155084990000101
Figure BDA0001155084990000111
MS可自行按上述配方配制，也可向Sigma等化学试剂公司购买成品。2/3MS培养基则是将MS培养基的大量元素减少1/3，而微量元素、铁盐和有机元素不变。然后根据本文所述配方配制本文的2/3MS诱导培养基。本领域技术人员将理解，可对上述表3所示的浓度作出适当的变动，例如有大约5％或更低(例如3％左右、2％左右、1％左右，或更低的变动范围)的变动，由此配制得到的培养基仍然具有所需的生物学功能，仍能用于实施本发明。例如，以肌醇为例，每升MS培养基中可含有大约95-105mg的肌醇(5％的变动幅度)。其它成分的浓度也如此变动。此外，2/3MS诱导培养基中的成分也可使用功能和性质相同或相似的成分加以替换。
同样地，本发明的诱导培养基也可自行按上述配方配制，或者可向Sigma等化学试剂公司购买获得N6培养基成品，然后根据本文所述配方配制本文的诱导培养基。
在某些实施方案中，本发明方法还包括待分化芽长至2～4cm时将其转移至壮苗培养基的步骤。通常，在室温(例如23～28℃，优选25±1℃)，每天10～12小时光照的条件下进行25～30天的生根壮苗培养。
本发明的壮苗培养基以1/2MS配制，添加20～40g/L的蔗糖、0.03～0.07mg/L的NAA、3.0～5.0mg/L的多效唑和4.5～6.5g/L的琼脂，pH为5.6～6.0。
在某些实施方案中，壮苗培养基为1/2MS，添加30g/L的蔗糖、0.05mg/L的NAA、4.0mg/L的多效唑和5.5g/L的琼脂，pH为5.8。
在某些实施方案中，本发明的方法还包括：待再生苗长6～8cm时进行炼苗的步骤。可采用本领域常规的手段进行炼苗。
本发明在某些方面也提供一种用于制备大麦小孢子愈伤组织的培养物，所述培养物含有大麦小孢子、农杆菌和诱导培养基，其中，所述培养物中，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.0×106～2.0×106个农杆菌。在某些优选实施方案中，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.0×106～1.5×106个农杆菌。在某些优选实施方案中，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.3×106～1.4×106个农杆菌。
更具体而言，所述培养物中，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液添加15～25μL的含1.5×106～2.5×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。在某些优选实施方案中，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液添加18～22μL的含1.8×106～2.3×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。在某些优选实施方案中，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液添加18～22μL的含1.9×106～2.1×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
所述培养液中的诱导培养基如前文所述。在某些实施方案中，所述诱导培养基为N6基本培养基，但铁盐浓度加倍，添加有70～110g/L麦芽糖、0.3～0.6mg/L KT、0.8～1.2mg/L 2,4-D、0.960～0.985g/L MES、300～500mg/L水解干酪素和1400～1800mg/L谷氨酰胺，pH为5.6～6.0。
在某些实施方案中，所述诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L的水解干酪素及1600mg/L的谷氨酰胺，pH5.8。
在其它实施方案中，所述诱导培养基为N6基本培养基，但铁盐浓度加倍，添加有70～110g/L麦芽糖、0.3～0.6mg/L KT、0.8～1.2mg/L 2,4-D、0.960～0.985g/L MES、300～500mg/L的水解干酪素、1400～1800mg/L的谷氨酰胺、90～110mg/L的头孢噻肟钠，90～110mg/L的氨卞青霉素和90～110mg/L的乙酰丁香酮，pH为5.6～6.0。
在某些实施方案中，所述诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L的水解干酪素及1600mg/L的谷氨酰胺，100mg/L的头孢噻肟钠，100mg/L的氨卞青霉素和100mg/L的乙酰丁香酮，pH5.8。
下文将以大麦为例对本发明进行描述。应理解，在不偏离本发明精神和范围的情况下可对本发明做出各种修改和变动。且也可采用本发明的方法用于其它禾谷类作物，并能产生相同的效果。以下实施例仅仅是阐述性的，本发明的范围由本申请的权利要求加以限定。如无特别说明，本发明所用的百分比为重量体积百分比。此外，应理解，上述各培养基中各成分的优选范围可任意组合，只要其能实现本发明的发明目的即可。
实施例1：农杆菌侵染大麦花30小孢子接菌量的选择
大麦材料花30种植于人工气候室，植株培养条件为：温度晚上18℃，白天20℃；湿度65％；12小时光照，12小黑暗。选取中部小花小孢子发育处于单核早-中期的大麦穗子，剪去叶片(保留上部两片叶子基部约1.5cm)，用干净的湿纱布包好幼穗，放入保鲜袋中保湿，标明取材日期和数量等，放入4℃冰箱中进行2～4周低温预处理。
经过低温处理的材料取花苞游离小孢子，小孢子游离参照陆瑞菊等方法(陆瑞菊、黄剑华等，“秋水仙碱对大麦离体培养小孢子存活与成苗的影响”，植物生理学报，2001，27(2)：135～140)。每个试管接4个穗子的花苞，加入12ml提取液(甘露醇60g/L+CaCl2 1.1g/L+MES 0.976g/L+秋水仙碱20mg/L，pH 5.8)，用高速分散器超速旋切。把旋切好的悬浮液，用300目筛网过滤，滤液以700rpm，5min低速离心，重复3次，收集小孢子。
收集到的小孢子用提取液于25℃、黑暗中预处理2天后再纯化培养小孢子。培养前小孢子用诱导培养基(表1所示的N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L水解干酪素+1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8)洗涤1次，密度调节至1.0×105/m1，取1.5ml小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)中，Parafilm封口，25℃，暗培养。
培养至10天时培养液中加入乙酰丁香酮至终浓度为100mg/L，接种不同体积(2uL\20uL\40uL)的OD600＝0.8农杆菌(Aglo菌株，可参见Fang Y D、Akula C、Altpeter F.，2012，Agrobacterium-mediated barley(Hordeum vulgare L.)transformation using greenfluorescent protein as a visual marker and sequence analysis of the T-DNA::barley genomic DNA junctions，Journal of plant physiology，159，1131-1138)，侵染48小时。不同体积农杆菌侵染的小孢子使用诱导培养基清洗3次。每皿小孢子加入1.5ml诱导培养基(表1所示的N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L水解干酪素+1600mg/L谷氨酰胺，头孢噻肟钠100mg/L，氨苄青霉素100mg/L，乙酰丁香酮至终浓度为100mg/L)。25℃培养至19天时统计不同浓度农杆菌侵染的小孢子后的愈伤产量。
结果表明，2uL(约2×105个)农杆菌侵染花30小孢子后，19天时每皿平均愈伤为3个/视野；20uL(约2×106个)农杆菌侵染花30小孢子后，19天时每皿平均愈伤为20个/视野；40uL(约4×106个)农杆菌侵染花30小孢子后，19天时每皿平均愈伤为4个/视野。表明20uL农杆菌液为最适合浓度(图1)。
实施例2：HvSERK1基因的克隆
把大麦品种花30种子播于培养皿中发芽，露白后移栽到盆钵。待三叶期，取大麦叶片保存在-70℃冰箱内保存备用。用TRIZOL(Invitrogen)提取大麦叶片的总RNA。利用PrimeScriptTM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)将2μg的总RNA合成cDNA。
根据NCBI网站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上大麦基因BAK03316设计引物对P1(ATGGCTGCGTCGCCGGAGATGC，SEQ ID NO：1)和P2(TTACCTCGGGCCGGACAGCTCCACC，SEQ IDNO：2)，以上述cDNA为模板进行PCR扩增，获得BAK03316基因的全长。以该基因为例，构建农杆菌载体转化大麦品种花30小孢子。
实施例3：BAK03316基因农杆菌正义载体构建
以BAK03316基因cDNA为模板，使用引物对BAK03316-BamHI-F(AAAAGATCTATGGCTGCGTCGCCGGAGAT，SEQ ID NO：3)和BAK03316-SpeI-R(AAATCTAGACCTCGGGCCGGACAGCTCCA，SEQ ID NO：4)进行PCR扩增，回收扩增片段。用BamHI和SpeI对扩增产物进行双酶切，将酶切产物插入到BamHI和SpeI双酶切后的载体pHB(Zhou YY,Sun W,Chen J F,Tan H,Xiao Y,Li Q,Ji Q,Gao S H,Chen L,Chen S L,Zhang L,ChenW S.(2016).SmMYC2a and SmMYC2b played similar but irreplaceable roles inregulating the biosynthesis of tanshinones and phenolic acids in Salviamiltiorrhiza.Scientific reports,6:22852)，将BAK03316置于35S启动子后面的多克隆位点处。由此将目标基因BAK03316克隆到强启动子35S的下游，获得表达载体pHB:BAK03316(图2)。
经测序验证，表明载体构建成功。
实施例4：农杆菌转化BAK03316于大麦花30小孢子
如实施例1所述收集大麦花30的小孢子，用提取液于25℃、黑暗中预处理2天后再纯化培养小孢子。培养前小孢子用诱导培养基(表1所示的N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L水解干酪素+1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8)洗涤1次，密度调节至1.0×105/m1，取1.5ml小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)中，Parafilm封口，25℃，暗培养。
培养至第10天时培养液中加入乙酰丁香酮至终浓度为100mg/L，接种20uL、OD600＝0.8的携有过量表达载体pHB:BAK03316的农杆菌(实施例3制备得到)，侵染48小时。
然后使用前述用于制备小孢子悬浮液的诱导培养基清洗3次。每皿小孢子加入1.5ml诱导培养基(表1所示的N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L水解干酪素+1600mg/L谷氨酰胺，头孢噻肟钠100mg/L，氨苄青霉素100mg/L，乙酰丁香酮至终浓度为100mg/L)。25℃培养至第19天时转入分化培养基(2/3MS+麦芽糖30g/L+6-BA 0.5mg/L+KT 1.5mg/L+NAA 0.05mg/L+琼脂5.5g/L+头孢噻肟钠100mg/L，氨苄青霉素100mg/L+乙酰丁香酮100mg/L，pH 5.8)进行分化。
待分化芽长至2-4cm时将其转移至壮苗培养基(1/2MS+蔗糖30g/L+NAA 0.05mg/L+多效唑4.0mg/L+琼脂5.5g/L+头孢噻肟钠100mg/L，氨苄青霉素100mg/L，pH 5.8)。
至再生苗长约8cm、根系较健壮时，即可开盖炼苗1-2天，最后洗去根系携带的培养基残渣便可移栽入盆钵，获得24棵再生植株。
提取所有再生植株基因组DNA，对转化植株利用载体上启动子引物P3(AGTTCATTTCATTTGGAGAGAACAC，SEQ ID NO：5)和基因内部引物P4(TAATGTTGGTCAAGGACTGTGG，SEQ ID NO：6)进行PCR扩增，以鉴定阳性植株。
PCR程序：10-50ng/μl基因组DNA模板，10μM的5’引物和3’引物各0.5μl；2.5μl 10×缓冲液；2.5μl 2.5mM的dNTP；1.5μl 25mM的Mg2+；0.25μl(5U/μl)Taq聚合酶(TaKaRa)，加水至25μl。
PCR反应条件为：94℃预变性3min；94℃45s，56℃45s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR产物经1％的琼脂糖电泳检测。
结果显示，4株可以扩增约510bp的目的条带，鉴定为阳性植株，株系编号依次为：T0-9、T0-11、T0-12、T0-23(图3)。结果表明BAK03316成功转入花30小孢子，转化率约为17％。
序列表
<110> 上海市农业科学院
<120> 一种改良的农杆菌转化大麦小孢子方法
<130> 167421
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 1
atggctgcgt cgccggagat gc 22
<210> 2
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 2
ttacctcggg ccggacagct ccacc 25
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 3
aaaagatcta tggctgcgtc gccggagat 29
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 4
aaatctagac ctcgggccgg acagctcca 29
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 5
agttcatttc atttggagag aacac 25
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 6
taatgttggt caaggactgt gg 22

Claims (22)

1.一种农杆菌转化大麦小孢子的方法，其特征在于，所述方法包括以每1×105个小孢子1.0×106～2.0×106个农杆菌的接种浓度用农杆菌侵染小孢子30～60小时的步骤。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.0×106～1.5×106个农杆菌。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.3×106～1.4×106个农杆菌。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，接种前，将含小孢子的悬浮液室温暗培养10天，加入乙酰丁香酮至终浓度为90～110mg/L，然后接种农杆菌。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液使用15～25μL的含1.5×106～2.5×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液添加18～22μL的含1.8×106～2.3×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液添加18～22μL的含1.9×106～2.1×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其特征在于，用诱导培养基配制所述小孢子悬浮液，其中，所述诱导培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有60～120g/L的麦芽糖，0.3～0.8mg/L的KT，0.4～1.2mg/L的2,4,5-T和/或2,4-D，0.965～0.985g/L的2-(N-吗啉)-乙烷磺酸，400～2500mg/L的水解干酪素和400～2500mg/L的谷氨酰胺，pH为5.5～6.2。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L 2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L水解干酪素及1600mg/L谷氨酰胺，pH5.8。
10.一种制备大麦小孢子愈伤组织的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)如权利要求1－9中任一项所述用农杆菌转化大麦小孢子；
(2)清洗步骤(1)的小孢子；和
(3)用含头孢噻肟钠、氨苄青霉素和乙酰丁香酮的诱导培养基室温培养步骤(2)获得的所述小孢子9天；
从而获得大麦小孢子愈伤组织。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述诱导培养基为制备小孢子悬液所用的诱导培养基，添加的头孢噻肟钠的浓度为90～110mg/L，氨卞青霉素的浓度为90～110mg/L，乙酰丁香酮的终浓度为90～110mg/L。
12.一种制备大麦再生植株的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)采用权利要求10或11所述的方法制备获得大麦小孢子的愈伤组织；和
(2)用分化培养基培养所述愈伤组织；
从而获得再生植株。
13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)包括，在25±1℃，每天10～12小时光照的条件下在分化培养基中分化胁迫培养25～30天，直至分化出再生植株；和
任选地，所述方法还包括待再生苗长6～8cm时进行炼苗的步骤。
14.一种用于制备大麦小孢子愈伤组织的培养物，其特征在于，所述培养物含有大麦小孢子、农杆菌和诱导培养基，其中，所述培养物中，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.0×106～2.0×106个农杆菌。
15.如权利要求14所述的培养物，其特征在于，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.0×106～1.5×106个农杆菌。
16.如权利要求14所述的培养物，其特征在于，农杆菌的接种浓度为每1×105个小孢子1.3×106～1.4×106个农杆菌。
17.如权利要求14所述的培养物，其特征在于，所述培养物中，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液添加15～25μL的含1.5×106～2.5×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
18.如权利要求17所述的培养物，其特征在于，所述培养物中，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液添加18～22μL的含1.8×106～2.3×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
19.如权利要求17所述的培养物，其特征在于，所述培养物中，每1.5mL的含1.5×105个小孢子的小孢子悬浮液添加18～22μL的含1.9×106～2.1×106个农杆菌的农杆菌溶液侵袭所述小孢子。
20.如权利要求14－19中任一项所述的培养物，其特征在于，
所述诱导培养基为N6基本培养基，但铁盐浓度加倍，添加有70～110g/L麦芽糖、0.3～0.6mg/L KT、0.8～1.2mg/L 2,4-D、0.960～0.985g/L MES、300～500mg/L水解干酪素和1400～1800mg/L谷氨酰胺，pH为5.6～6.0。
21.如权利要求20所述的培养物，其特征在于，所述诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L的水解干酪素及1600mg/L的谷氨酰胺，pH5.8；或
所述诱导培养基为N6基本培养基，但铁盐浓度加倍，添加有70～110g/L麦芽糖、0.3～0.6mg/L KT、0.8～1.2mg/L 2,4-D、0.960～0.985g/L MES、300～500mg/L的水解干酪素、1400～1800mg/L的谷氨酰胺、90～110mg/L的头孢噻肟钠，90～110mg/L的氨卞青霉素和90～110mg/L的乙酰丁香酮，pH为5.6～6.0。
22.如权利要求20所述的培养物，其特征在于，所述诱导培养基为N6基本培养基，铁盐浓度加倍，添加有90g/L麦芽糖、0.5mg/L KT、1.0mg/L2,4-D、0.976g/L MES、400mg/L的水解干酪素及1600mg/L的谷氨酰胺，100mg/L的头孢噻肟钠，100mg/L的氨卞青霉素和100mg/L的乙酰丁香酮，pH5.8。
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