CN113881698B - 一种利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法 - Google Patents

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Abstract

一种利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法，使用国产大麦品种‘花22’作为受体材料，通过：1)大麦小孢子提取、诱导培养；2)农杆菌侵染大麦小孢子愈伤组织；3)筛选转化后的愈伤组织；4)分化培养及壮苗培养步骤，选定合适的侵染条件，在分化阶段使用抗除草剂基因作为筛选标记，成功建立了农杆菌侵染大麦小孢子愈伤组织转基因体系，获得转基因阳性植株，阳性率在77％以上。

Description

一种利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法。
背景技术
转基因技术已经在很多植物中应用，转基因技术的应用使得植物分子生物学获得了飞速的发展。而转基因技术和基因编辑技术结合，可以定向培育抗病、抗逆、优质高产的作物品种。因此，发展和改良已有的转基因技术是必要的。
大麦是世界第四大禾谷类作物，其环境适应性强，种植范围广。目前，大麦已完成全基因组测序，这将极大的推动大麦分子生物学的发展。而大量的目标基因功能研究的开展，需要大麦转基因技术的支持。
植物小孢子(Microspore)是由花粉母细胞经减数分裂后形成的四分体产生的单倍体性细胞，在离体胁迫条件下可以由原有的配子体发育途径转向孢子体发育途径，经胚胎发育形成完整植株。
在已经报道的大麦转化方法中，幼胚转化需要大量的工时。而小孢子是单细胞形态，单次分离分析获得大量的植物小孢子，经过体外培养后获得大量的、均一的胚性愈伤，并且这种愈伤具有极强的分化能力，是优良的转基因受体。
OttoI等(transformation using embryogenic pollen cultures.Methods MolBiol.2015；1223:85-99)报道了一种农杆菌转化大麦小孢子的方法，其操作复杂，将农杆菌和小孢子愈伤在液体培养基长期共培养，污染很难控制，该方法仅局限在极少数的国外大麦品种中，而且使用潮霉素作为筛选标记基因，不利于再生植株的快速鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法，使用国产大麦品种‘花22’作为受体材料，选定合适的侵染条件，在分化阶段使用抗除草剂基因作为筛选标记，成功建立了农杆菌侵染大麦小孢子愈伤组织转基因体系，获得转基因阳性植株，阳性率在77％以上。
一种利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法，包括以下步骤：
1)大麦小孢子提取、诱导培养
选取穗中部小花小孢子发育处于单核早-中期的大麦花22幼穗，取花苞游离小孢子，接入大麦小孢子诱导培养基中培养19-21天，再转至固体诱导培养基中进行继代培养；
2)农杆菌侵染大麦小孢子愈伤组织
待愈伤组织生长至3-5mm时，进行农杆菌转化：将载体pCambia1305.1-bar转入农杆菌菌株LBA4404，将农杆菌扩繁至OD600＝0.6-0.8，侵染小孢子愈伤组织；
侵染时使用45-55kPa负压处理3次，每次50-70s，之后摇床继续侵染25-35min，移至共培养基培养2-4天；
其中，所述共培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加麦芽糖80-100g/L、KT 0.4-0.6mg/L、2,4-D 0.8-1.2mg/L、MES 0.976g/L、乙酰丁香酮90-110mg/L和L-半胱氨酸600-1100mg/L，pH5.8；
3)筛选转化后的愈伤组织
完成步骤2)的浸染后转入诱导筛选培养基，使用双丙氨膦对愈伤组织进行筛选，筛选12-15天，筛选出阳性愈伤组织；
其中，所述筛选培养基以N6培养基为基本培养基，添加麦芽糖80-100g/L、KT 0.4-0.6mg/L、2,4-D 0.8-1.2mg/L、MES 0.976g/L、双丙氨膦3-8mg/L、特美汀Timentin 200-600mg/L和植物凝胶3-5g/L；
4)分化培养及壮苗培养
将筛选出的阳性愈伤组织转入分化培养基进行分化培养，分化芽长至2-4cm时将其转移至壮苗培养基进行壮苗培养，获得再生植株，使用PAT/bar速测试纸检测；
其中，所述分化培养基以2/3MS为基本培养基，添加麦芽糖28-32g/L、6-BA 0.5-0.6mg/L、KT 1.5-2.0mg/L、NAA 0.04-0.06mg/L、特美汀Timentin200-600mg/L、双丙氨膦1.5-2.5mg/L和植物凝胶3-5g/L。
优选地，步骤2)中侵染时使用50kPa负压处理3次，每次50-70s，之后摇床继续侵染30min，移至共培养基培养3天。
又，步骤1)所述诱导培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加麦芽糖80-100g/L、KT 0.4-0.6mg/L、2,4-D 0.8-1.2mg/L、MES 0.976g/L，pH5.8。
进一步，步骤2)中所述共培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加麦芽糖90g/L、KT 0.5mg/L、2,4-D 1.0mg/L、MES0.976g/L、100mg/L乙酰丁香酮、800mg/L L-半胱氨酸，pH5.8。
又，步骤3)中所述筛选培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加麦芽糖90g/L、KT 0.5mg/L、2,4-D 1.0mg/L、MES0.976g/L、水解酪蛋白400mg/L、双丙氨膦5mg/L、特美汀Timentin 400mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8。
进一步，步骤4)所述分化培养基以2/3MS为基本培养基，添加麦芽糖30g/L、6-BA0.5mg/L、KT 1.5mg/L、NAA 0.05mg/L、特美汀Timentin 400mg/L、双丙氨膦2mg/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8。
又，步骤4)所述壮苗培养基以1/2MS为基本培养基，添加蔗糖28-32g/L、NAA 0.04-0.06mg/L、多效唑4.0-6mg/L、琼脂5-6g/L、特美汀Timentin 400mg/L、双丙氨膦5mg/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8。
本发明中，将大麦小孢子在诱导培养基中培养19-21天，再转至添加了植物凝胶的固体诱导培养基中进行继代培养，在固体培养基上愈伤组织与空气接触较多，受到的胁迫更低，生长更快。
在大麦小孢子愈伤组织长至3-5mm时，以农杆菌侵染大麦小孢子的愈伤组织，若愈伤组织过小，不容易操作；若愈伤组织过大，后期分化能力会降低，所以选择3-5mm时的愈伤进行侵染；在侵染时，采用45-55kPa负压处理，侵染效率达到最大，若继续降低压强，侵染效率无明显增加，并且愈伤受到伤害较大。
本发明在筛选出阳性愈伤组织后进行分化，配制的分化培养基可以强烈抑制非转化愈伤组织的分化，而阳性愈伤组织可以正常分化。其中，添加的特美汀Timentin浓度范围为200-600mg/L，能最大程度上抑制农杆菌的生长，而同时不对愈伤分化产生较大影响；添加1.5-2.5mg/L的双丙氨膦能强烈抑制大麦小孢子非转化愈伤的分化，同时能够部分抑制阳性愈伤的分化，最终提高分化绿芽的阳性率。
本发明在诱导培养基、共培养基、筛选培养基、分化培养基以及壮苗培养基中除选取了合适的基本培养基外，添加麦芽糖作为碳源，KT和2,4-D作为生长激素用于促进愈伤组织的形成，添加的MES是缓冲剂，维持细胞生长正常PH值；添加的双丙氨膦在不同阶段都是抑制并杀死非转化细胞的生长，使得转化细胞能够正常的生长。
本发明转化时使用抗除草剂基因phosphinothricin acetyltransferase(bar)基因作为筛选标记，除草剂的作用机理是抑制谷氨酰胺合成酶活性使组织不能合成谷氨酰胺，如果培养基中含有谷氨酰胺，除草剂的作用就表现不出来，因此，在诱导培养基中去除谷氨酰胺成份。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明通过对国内大麦材料‘花22’的农杆菌侵染过程进行研究，以除草剂进行筛选，在分化阶段使用抗除草剂基因作为标记，能够有效地筛选小孢子愈伤组织，减少农杆菌侵染后筛选时间，再生植株能够可以使用检测试纸快速进行阳性鉴定，使农杆菌转化小孢子技术操作更加简单、省时、省钱，可应用于大麦基因功能研究、基因编辑和基因工程育种。
本发明的侵染过程中，确定最适的负压处理为45-55kPa，侵染效率高；在分化阶段使用抗除草剂基因作为筛选标记，在选定的双丙氨膦和Timentin浓度范围内，愈伤组织的污染能得到有效控制，并且阳性愈伤能分化出绿芽，有效降低了假阳性植株的产生，最终成功获得转基因阳性植株，阳性率为77％以上。
附图说明
图1为本发明实施例中的pCambia1305.1-bar载体结构图。
图2为本发明实施例中不同压强处理花22小孢子愈伤侵染效率的差异。
图3为本发明实施例中不同浓度双丙氨膦对花22小孢子愈伤分化的影响。
图4为本发明实施例中不同浓度Timentin筛选花22小孢子愈伤分化绿芽数统计。
图5为本发明实施例中再生植株试纸条鉴定结果，箭头表示阳性条带。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法
1.大麦小孢子的提取、培养
大麦材料‘花22’种植于人工气候室，植株培养条件为：温度晚上18℃，白天20℃；湿度65％；12小时光照，12小黑暗。
选取中部小花小孢子发育处于单核早-中期的大麦穗子，剪去叶片，保留上部两片叶子基部约1.5cm，用干净的湿纱布包好幼穗，放入保鲜袋中保湿，标明取材日期和数量等，放入4℃冰箱中进行2～4周低温预处理。
取经过低温处理的材料花苞游离小孢子，小孢子游离参照陆瑞菊等方法(秋水仙碱对大麦离体培养小孢子存活与成苗的影响，植物生理学报，2001，27(2)：135～140)。
每个试管接4个穗子的花苞，加入12ml提取液，其中提取液中含有：甘露醇60g/L、CaCl2 1.1g/L、MES 0.976g/L和秋水仙碱20mg/L，pH 5.8，用高速分散器超速旋切。
把旋切好的悬浮液用300目筛网过滤，滤液以700rpm，5min低速离心，重复3次，收集小孢子，收集到的小孢子用上述提取液于25℃、黑暗中预处理2d后再纯化培养小孢子。
培养前小孢子用诱导培养基洗涤1次，密度调节至1.0×105/m1，取1.5ml小孢子悬浮液接种于培养皿(30×15mm)中，Parafilm封口，25℃，暗培养，其中，所述诱导培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加麦芽糖90g/L、KT 0.5mg/L、2,4-D 1.0mg/L、MES0.976g/L，pH5.8。
培养至19-21天时将愈伤移至固体诱导培养基继代培养。
其中，所述固体诱导培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加麦芽糖90g/L、KT 0.5mg/L、2,4-D 1.0mg/L、MES 0.976g/L植物凝胶3g/L，pH5.8。
2.农杆菌侵染大麦小孢子愈伤组织
待愈伤组织生长至3-5mm时，进行农杆菌转化，将载体pCambia1305.1-bar(图1)转入农杆菌菌株LBA4404中，使用YEB培养基将农杆菌扩繁至OD600＝0.6-0.8，其中，YEB培养基中含有牛肉膏5g/L、酵母提取物1g/L、蛋白胨5g/L、蔗糖5g/L和MgSO4·H2O 0.5g/L，PH 7.0。
将扩繁后的农杆菌于3000rpm离心5min，去上清，重复三次。使用小孢子诱导培养基将农杆菌稀释到OD600＝0.6-0.8，将约200个‘花22’小孢子愈伤组织接种至40ml农杆菌进行侵染，其中，诱导培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加麦芽糖90g/L、KT0.5mg/L、2,4-D 1.0mg/L、MES 0.976g/L，pH5.8。
侵染时，设置不同真空度组别，分别使用100kPa、70kPa、60kPa、50kPa、40kPa负压处理不同组的愈伤组织，每次1min，共3次，100rpm摇床继续侵染30min。
随后将愈伤组织放置在3层滤纸上吸干菌液，移至共培养基培养3天后做GUS染色，其中，共培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加添加麦芽糖90g/L、KT 0.5mg/L、2,4-D 1.0mg/L、MES 0.976g/L、乙酰丁香酮100mg/L和L-半胱氨酸800mg/L，pH5.8。
结果如图2所示，压强为50kPa时，蓝色愈伤数量较多，表明侵染效率较高，而压强为40kPa时，蓝色愈伤数量和50kPa时无明显差异，为了降低对愈伤的伤害，最终选择使用45-55kPa做转化。
3.筛选转化后的愈伤组织
完成浸染后将愈伤组织转入筛选培养基，使用双丙氨膦对愈伤组织进行筛选，筛选12-15天，筛选出阳性愈伤组织。
其中，筛选培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加麦芽糖90g/L、KT0.5mg/L、2,4-D 1.0mg/L、MES0.976g/L、双丙氨膦5mg/L、特美汀Timentin 400mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8。
4.分化培养及壮苗培养
筛选分化培养基中不同浓度的双丙氨膦、Timentin对小孢子愈伤分化的影响：
将筛选出的阳性愈伤组织转入筛选分化培养基进行分化培养，其中，筛选分化培养基以2/3MS为基本培养基，添加麦芽糖30g/L、6-BA0.5mg/L、KT 1.5mg/L、NAA 0.05mg/L、琼脂5.5g/L、不同浓度的双丙氨膦或不同浓度Timentin、植物凝胶3g/L，pH 5.8。
关于筛选分化培养基中双丙氨膦浓度对小孢子愈伤分化的影响：
将继代培养后长至3-5mm的‘花22’小孢子愈伤组织转入含有不同浓度双丙氨膦：0mg/L、1mg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L的筛选分化培养基，在光照下培养1周，分化结果如图3所示。
由图3可见，和未添加双丙氨膦时每皿分化出约20个绿芽相比，添加2mg/L-6mg/L培养基中小孢子愈伤均未分化出绿芽，双丙氨膦优选浓度为1.5-2.5mg/L，浓度过高，会严重降低愈伤分化率。
关于筛选分化培养基中抗生素浓度对小孢子愈伤分化的影响
将继代培养后长至3-5mm的‘花22’小孢子愈伤组织转入含有不同浓度Timentin：0mg/L、200mg/L、400mg/L、600mg/L、800mg/L的筛选分化培养基，在光照下培养1周，结果见图4。
由图4可见，和未添加Timentin相比，添加200mg/L-600mg/L培养基中小孢子愈伤分化情况无显著差异，而添加800mg/L培养基中绿芽显著减少，说明在分化阶段添加Timentin的浓度合适浓度范围为200-600mg/L。
因此，确定的最优分化培养基：以2/3MS为基本培养基，添加麦芽糖30g/L、6-BA0.5mg/L、KT 1.5mg/L、NAA 0.05mg/L、琼脂5.5g/L、Timentin 400mg/L和双丙氨膦2mg/L，pH5.8。
将筛选出的阳性愈伤组织转入最优的分化培养基进行分化培养，待分化芽长至2-4cm时将其转移至壮苗培养基进行壮苗培养，获得9棵再生植株，使用PAT/bar速测试纸检测。
其中，所述壮苗培养基以1/2MS为基本培养基，添加蔗糖30g/L、NAA 0.05mg/L、多效唑4.0mg/L、琼脂5.5g/L、Timentin 400mg/L、双丙氨膦5mg/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8。
取再生植株叶片，研磨成浆，使用PAT/bar速测试纸(上海佑隆生物科技有限公司)检测，结果表明pCambia1305.1-bar成功转入花22小孢子(图5)，转化率约为77.8％。

Claims (7)

1.一种利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法，包括以下步骤：
1)大麦小孢子提取、诱导培养
选取穗中部小花小孢子发育处于单核早-中期的大麦‘花22’幼穗，取花苞游离小孢子，接入大麦小孢子诱导培养基中培养19-21天，再转至固体诱导培养基中进行继代培养；
2)农杆菌侵染大麦小孢子愈伤组织
待愈伤组织生长至3-5mm时，进行农杆菌转化，将载体pCambia1305.1-bar转入农杆菌菌株LBA4404，将农杆菌扩繁并稀释至OD600＝0.6-0.8，侵染小孢子愈伤组织；
侵染时使用45-55kPa负压处理3次，每次50-70s，之后摇床继续侵染25-35min，移至共培养基培养2-4天；
其中，所述共培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加麦芽糖80-100g/L、KT0.4-0.6mg/L、2,4-D 0.8-1.2mg/L、MES 0.976g/L、乙酰丁香酮90-110mg/L、L-半胱氨酸600-1100mg/L，pH5.8；
3)筛选转化后的愈伤组织
完成步骤2)的浸染后转入筛选培养基，使用双丙氨膦对愈伤组织进行筛选，筛选12-15天，筛选出阳性愈伤组织；
其中，所述筛选培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加麦芽糖80-100g/L、KT0.4-0.6mg/L、2,4-D 0.8-1.2mg/L、MES 0.976g/L、双丙氨膦3-8mg/L、特美汀Timentin200-600mg/L，植物凝胶3-5g/L；
4)分化培养及壮苗培养
将筛选出的阳性愈伤组织转入分化培养基进行分化培养，分化芽长至2-4cm时将其转移至壮苗培养基进行壮苗培养，获得再生植株，使用PAT/bar速测试纸检测；
其中，所述分化培养基以2/3MS为基本培养基，添加麦芽糖28-32g/L、6-BA 0.5-0.6mg/L、KT 1.5-2.0mg/L、NAA 0.04-0.06mg/L、特美汀Timentin 200-600mg/L、双丙氨膦1.5-2.5mg/L、植物凝胶3-5g/L。
2.根据权利要求1所述利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法，其特征在于，步骤2)中侵染时使用50kPa负压处理3次，每次50-70s，之后摇床继续侵染30min，移至共培养基培养3天。
3.根据权利要求1所述利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法，其特征在于，其中，步骤1)所述诱导培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加麦芽糖80-100g/L、KT0.4-0.6mg/L、2,4-D 0.8-1.2mg/L、MES 0.976g/L，pH5.8。
4.根据权利要求1所述利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法，其特征在于，步骤2)中所述共培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加麦芽糖90g/L、KT 0.5mg/L、2,4-D 1.0mg/L、MES0.976g/L、100mg/L乙酰丁香酮、800mg/L L-半胱氨酸，pH5.8。
5.根据权利要求1所述利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法，其特征在于，步骤3)中所述筛选培养基以N6培养基为基本培养基，铁盐加倍，添加麦芽糖90g/L、KT 0.5mg/L、2,4-D 1.0mg/L、MES0.976g/L、双丙氨膦5mg/L、特美汀Timentin 400mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8。
6.根据权利要求1所述利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法，其特征在于，步骤4)所述分化培养基以2/3MS为基本培养基，添加麦芽糖30g/L、6-BA 0.5mg/L、KT 1.5mg/L、NAA 0.05mg/L、特美汀Timentin 400mg/L、双丙氨膦2mg/L、植物凝胶3g/L，pH 5.8。
7.根据权利要求1所述利用农杆菌转化大麦小孢子愈伤组织的方法，其特征在于，步骤4)所述壮苗培养基以1/2MS为基本培养基，添加蔗糖28-32g/L、NAA 0.04-0.06mg/L、多效唑4.0-6mg/L、琼脂5-6g/L、特美汀Timentin 400mg/L、双丙氨膦5mg/L、植物凝胶3g/L，pH5.8。
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