CN104017823B - 一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法，步骤如下：(1)制被待转化菌液；(2)制备转化后下胚轴；(3)初步筛选植株芽；(4)中度筛选植株芽；(5)深度筛选植株芽；(6)将深度筛选植株芽经培养后，制得转化植株。通过采用本发明所述的依次增加筛选压力的筛选方式，可以在丛生芽诱导的初始阶段除去大部分没有转化成功的丛生芽，以后每次继代培养都可去掉部分变白的假阳性植株，不仅节约了时间、大大降低了后期的工作量，而且能够保证最后得到的绿色植株绝大部分都是真正的阳性植株。

Description

一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法

技术领域

本发明涉及一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法，属于作物育苗技术领域。

背景技术

花生是我国重要的油料作物和经济作物，具有非常重要的经济价值。自上世纪40年代以来，逐步开始了花生组织培养研究，建立多种花生组培再生体系。自1994年Eapen和George首次报道获得花生转基因植株以来，有关进行花生遗传转化的研究也有不少成功的报道。

虽然花生的遗传转化取得了一定的进展，能够通过农杆菌介导的方法获得转基因花生再生植株，但是花生转化与再生频率较低，不能满足运用基因工程进行大规模花生遗传育种的需要。究其原因有以下几点：(1)转化效率受基因型影响较大：不同基因型花生的转化效率差异显著。(2)不同的花生外植体再生植株频率差异显著：目前已经成功获得再生植株的花生外植体主要是幼苗或萌发种子的下胚轴、幼叶和子叶，其中以下胚轴再生植株频率较高，周期较短。(3)转化效率低，转化植株假阳性较多，从而大大增加了后期的工作量，但收获甚少。(4)再生植株生根十分困难。人们想出了多种方法、配制了多个配方来解决这个问题，其中嫁接是较为成功的一种方法，但是嫁接苗成活率不是很高，且可能会有作为砧木的野生花生小芽混入。

目前常用的筛选转化假阳性植株的方法为向培养基中加入卡那霉素(Kan)。如中国专利文献CN103004585A(申请号201210534830.3)公开了一种利用卡那霉素快速筛选菊花转基因植株的方法，包括以下几个步骤：(1)确定菊花叶盘不定芽分化Kan筛选浓度、菊花茎段生根Kan筛选浓度以及Kan溶液浸泡筛选浓度和观察时间；(2)对菊花转化植株进行分化再生阶段和生根阶段的筛选得到生根株系；再将生根株系经Kan溶液浸泡筛选后得到转基因菊花Kan抗性株系；(3)转基因菊花的PCR验证：根据转基因载体中的35S启动子序列设计引物对筛选的转基因菊花Kan抗性株系进行PCR扩增，验证载体片段是否插入菊花基因组。但上述方法应用于花生转化植株假阳性筛选过程中，由于先培养再进行筛选，从而导致大量假阳性植株经过了培养阶段，导致工作量增加。

花生遗传转化的过程可以分为4个阶段：丛生芽诱导、伸长、筛选和生根，通常都是在筛选阶段施加选择压力进行选择，但是这个过程一般只有1月左右，时间短，导致产生大量假阳性植株；如果增加筛选时间，又会延长整个遗传转化周期。而且由于诱导和伸长阶段无选择压力，需要把所有的丛生芽都进行继代培养，工作量很大。

发明内容

本发明针对目前花生遗传转化中转化植株假阳性较多的问题，提供了一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法。

术语解释：

IBA：吲哚丁酸；NAA：萘乙酸；GA3：赤霉素GA3；Kan：卡那霉素；Cef：头孢曲松钠；VB₁：维生素B₁；6-BA：6-苄氨基腺嘌呤；

本发明技术方案如下：

一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法，步骤如下：

(1)挑取转染具有卡那抗性重组质粒或具有卡那抗性质粒的待转化的农杆菌单菌落接种于含卡那霉素(Kan)和利福平的YEP液体培养基中，培养至对数生长期，经固液分离，收集菌体沉淀，经液体MS基本培养基重悬，制得待转化菌液；

(2)切取花生幼苗的下胚轴，浸入步骤(1)制得的待转化菌液中进行转化，然后移至B培养基中，黑暗条件下共培养2～3天，经质量浓度为1％的头孢水溶液浸泡后，无菌水冲洗、晾干，制得转化后下胚轴；

所述的B培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入0.6～0.8mg NAA和7.5～8.5mg6-BA；

(3)将步骤(2)制得的转化后下胚轴移至C培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得初步筛选植株芽；

所述的C培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入0.6～0.8mg NAA、7.5～8.5mg6-BA、200～250mg Cef和50～75mg Kan；

(4)将步骤(3)挑取的初步筛选植株芽移至D培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得中度筛选植株芽；

所述的D培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入2.0～3.0mg GA3、2.0-3.0mg6-BA、200～250mg Cef和90～100mg Kan；

(5)将步骤(4)制得的伸长植株芽移至E培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得深度筛选植株芽；

所述的E培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入2.0～3.0mg GA3、2.0～3.0mg6-BA、200～250mg Cef和110～120mg Kan；

(6)将步骤(5)制得的深度筛选植株芽移至F培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，制得转化植株；

所述的F培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入IBA0.6～0.7mg、NAA0.1～0.2mg、GA3 1.0～1.5mg、肌醇80～100mg、VB₁1.0～1.2mg，pH5.8。

根据本发明优选的，所述的MS基本培养基为本领域常规培养基，组分如下：

NH₄NO₃，1.65g/L；KNO₃，1.9g/L；CaCl₂·2H₂O，0.44g/L；MgSO₄·7H₂O，0.37g/L；KH₂PO₄，0.17g/L；KI，0.83mg/L；H₃BO₃，6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；FeSO₄·7H₂O，27.8mg/L；肌醇，100mg/L；甘氨酸，2mg/L；盐酸硫胺素，0.1mg/L；盐酸吡哆醇，0.5mg/L；烟酸，0.5mg/L；蔗糖，30g/L；琼脂，7.2g/L。

根据本发明优选的，所述步骤(1)的含卡那霉素(Kan)和利福平的YEP液体培养基为在YEP液体培养基的基础上每升加入如下组分：

卡那霉素(Kan)50mg，利福平50mg。

所述的YEP液体培养基每升组分如下：蛋白胨，10g；酵母提取物，10g；NaCl，5g，NaOH调节pH至7.2，高压灭菌20min。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的培养，步骤如下：

在27～28℃、180～220rpm振荡培养40～50h，然后转至新的含Kan50mg/L和利福平50mg/L的YEP培养基中，27～28℃、180～220rpm振荡培养2～3h。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的固液分离条件如下：在6000～7000rpm的条件下离心4～6分钟。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的卡那抗性重组质粒为在pROK II质粒中插入功能基因片段获得的重组质粒。

根据本发明优选的，所述步骤(2)的花生幼苗按如下方法培育：

将花生种子在体积百分比为75％的乙醇溶液中浸泡1分钟，取出，然后浸入质量百分比为0.1％的升汞溶液中20分钟，取出，然后用无菌水冲洗漂洗4～5次，去除种皮，置于A培养基中，于25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养3～5天。

根据本发明进一步优选的，所述的A培养基的成分为除琼脂外，其他成分的含量均为MS基本培养基的一半。

所述的液体MS基本培养基为在MS基本培养基的基础上去除琼脂成分获得。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的转化时间为20～30min。

有益效果

本发明从花生种子生芽诱导阶段就开始筛选直到最后的深度筛选，约3个月时间，逐步除去假阳性植株，工作量也在逐步递减。通过采用本发明所述的依次增加筛选压力的筛选方式，可以在丛生芽诱导的初始阶段除去大部分没有转化成功的丛生芽，以后每次继代培养都可去掉部分变白的假阳性植株，不仅节约了时间、大大降低了后期的工作量，而且能够保证最后得到的绿色植株大部分都是真正的阳性植株。

附图说明

图1花生‘鲁花14’丛生芽的初步筛选照片；

图2花生‘鲁花14’植株芽的中度筛选照片；

图3花生‘鲁花14’植株芽的深度筛选照片；

图4花生‘鲁花14’转化苗生根后的照片；

图5‘鲁花14’转基因花生植株PCR检测的电泳结果照片；

图中：M，DL2000；1，阴性对照；2-9，转基因植株；10，水对照；11，阳性对照。

图6花生‘丰花1号’丛生芽的初步筛选照片；

图7花生‘丰花1号’植株芽的中度筛选照片；

图8花生‘丰花1号’植株芽的深度筛选照片；

图9花生‘丰花1号’转化苗生根后的照片；

图10‘丰花1号’转基因花生植株PCR检测的电泳结果照片；

图中：M，DL2000；1，阴性对照；2，阳性对照；3-9，转基因植株；10，水对照。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

实施例1

农杆菌菌株：LBA4404，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司有售。

植物表达载体：pROK II，该载体上含有nptII基因，可以赋予转基因植株卡那抗性。北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司有售。

花生品种“鲁花14”青岛嘉华种业有限公司有售。

MS基本培养基，组分如下：

NH₄NO₃，1.65g/L；KNO₃，1.9g/L；CaCl₂·2H₂O，0.44g/L；MgSO₄·7H₂O，0.37g/L；KH₂PO₄，0.17g/L；KI，0.83mg/L；H₃BO₃，6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；FeSO₄·7H₂O，27.8mg/L；肌醇，100mg/L；甘氨酸，2mg/L；盐酸硫胺素，0.1mg/L；盐酸吡哆醇，0.5mg/L；烟酸，0.5mg/L；蔗糖，30g/L；琼脂，7.2g/L。

所述的液体MS基本培养基为在MS基本培养基的基础上去除琼脂成分获得。

A培养基：除琼脂外，所有成分为MS基本培养基的一半。

B培养基：在MS培养基的基础上每升加入0.7mg NAA和8.0mg6-BA；

C培养基：在MS培养基的基础上每升加入0.7mg NAA、8.0mg6-BA、250mg Cef和75mg卡那霉素(Kan)；

D培养基：在MS培养基的基础上每升加入2.0mg GA3、2.0mg6-BA、250mg Cef和100mg卡那霉素(Kan)；

E培养基：在MS培养基的基础上每升加入2.0mg GA3、2.0mg6-BA、250mg Cef和112.5mg卡那霉素(Kan)；

F培养基：在MS培养基的基础上每升加入IBA0.7mg、NAA0.1mg、GA3 1.0mg、肌醇100mg、VB₁1.0mg，pH5.8。

所述的YEP液体培养基每升组分如下：蛋白胨，10g；酵母提取物，10g；NaCl，5g，NaOH调节pH至7.2，高压灭菌20min。

一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法，步骤如下：

1、将花生种子置于无菌三角瓶中，先加入体积百分比为75％乙醇浸泡1分钟，取出，浸入质量百分比为0.1％的升汞溶液，灭菌20分钟，取出，然后用无菌水冲洗漂洗4-5次。去除种皮，置于A培养基中，于25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养3天，制得花生幼苗；

2.挑取转染具有卡那抗性质粒的待转化的农杆菌单菌落接种于含有50μg/mlKan、50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养2天；取适量加入新的YEP培养基(含50μg/ml Kan、50μg/ml利福平)中，培养3h至对数生长期，将菌液在6,000rpm下离心6分钟收集菌体，倒掉上清，用MS液体培养基重悬菌体，制得待转化菌液；

3.切取花生幼苗的下胚轴，放入待转化菌液中浸泡20min，取出，在滤纸上晾干，然后移到B培养基中，黑暗条件下共培养2天后，用质量浓度为1％的头孢水溶液浸泡胚轴10min，用无菌水冲洗4遍，取出并在滤纸上晾干，制得转化后下胚轴；

4.将转化后下胚轴移到C培养基中，于25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养20天，可陆续从下胚轴的顶端生出大量的丛生芽，其中大部分丛生芽都是白化的，这些都是没有转化成功的丛生芽(图1)；只有少数丛生芽为绿色植株，为准阳性丛生芽(图1)。由于C培养基中含有Kan，可以除去大部分没有转化成功的丛生芽，挑取绿色植株芽，制得初步筛选植株芽；

5.将得到的初步筛选植株芽转移到D培养基上，培养20天，由于D培养基中含有较高含量的Kan，又使得部分假阳性丛生芽白化而被除去(图2)。该培养基中还含有GA3，可以使丛生芽伸长，挑取绿色植株芽，制得中度筛选植株芽；

6.将中度筛选植株芽转移到E培养基上培养20天，该培养基中含有更大量的Kan，又可以除去部分白化的假阳性植株(图3)，挑取绿色植株芽，制得深度筛选植株芽；

7.将深度筛选植株芽转移到F培养基上诱导生根，经过20天时间就可以生出大量正常的、健壮的根系(图4)，正常移栽，成活率可达90％以上，制得转化植株；

8.阳性植株的分子生物学检测

提取移栽成活的转化植株的叶片中的DNA，用NPTⅡ基因的引物NptII-F/R进行扩增，引物序列如下：

Npt II-F：5'ATACCGTAAAGCACGAGGAAG3'，

Npt II-R：5'TGACTGGGCACAACAGACAAT3'；

扩增体系：0.2ml EP管中，20μl PCR反应体系：

扩增程序：94℃5min，94℃30Sec，50℃30Sec，72℃40Sec。30循环后，72℃延伸10min，4℃保存。

扩增目的片段长度为672bp，与阳性对照扩增片段大小一致，而野生对照花生不能扩增得到此片段(图5)。由图5可以看出，最后得到的绿色植株大部分为阳性植株。

经统计，阳性植株含量为84％。

实施例2

农杆菌菌株：LBA4404，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司有售。

植物表达载体：pCAMBIA2301，该载体上含有nptII基因，可以赋予转基因植株卡那抗性。还含有报告基因GUS。北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司有售。

花生品种“丰花1号”山东祥丰种业有限责任公司有售。

MS基本培养基，组分如下：

NH₄NO₃，1.65g/L；KNO₃，1.9g/L；CaCl₂·2H₂O，0.44g/L；MgSO₄·7H₂O，0.37g/L；KH₂PO₄，0.17g/L；KI，0.83mg/L；H₃BO₃，6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；FeSO₄·7H₂O，27.8mg/L；肌醇，100mg/L；甘氨酸，2mg/L；盐酸硫胺素，0.1mg/L；盐酸吡哆醇，0.5mg/L；烟酸，0.5mg/L；蔗糖，30g/L；琼脂，7.2g/L。

所述的液体MS基本培养基为在MS基本培养基的基础上去除琼脂成分获得。

A培养基：除琼脂外，所有成分为MS基本培养基的一半。

B培养基：在MS培养基的基础上每升加入0.7mg NAA和8.0mg6-BA；

C培养基：在MS培养基的基础上每升加入0.7mg NAA、8.0mg6-BA、250mg Cef和75mgKan；

D培养基：在MS培养基的基础上每升加入2.0mg GA3、2.0mg6-BA、250mg Cef和100mg Kan；

E培养基：在MS培养基的基础上每升加入2.0mg GA3、2.0mg6-BA、250mg Cef和112.5mg Kan；

F培养基：在MS培养基的基础上每升加入IBA0.7mg、NAA0.1mg、GA3 1.0mg、肌醇100mg、VB₁1.0mg，pH5.8。

所述的YEP液体培养基每升组分如下：蛋白胨，10g；酵母提取物，10g；NaCl，5g，NaOH调节pH至7.2，高压灭菌20min。

一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法，步骤如下：

1.将花生种子置于无菌三角瓶中，先加入体积百分比为75％乙醇浸泡1分钟，取出，浸入质量百分比为0.1％的升汞溶液，灭菌20min，取出，然后用无菌水冲洗漂洗4-5次。去除种皮，置于A培养基中，于25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养3天，制得花生幼苗；

2.转染具有卡那抗性重组质粒的待转化的农杆菌的制备步骤：将pCAMBIA2301质粒加入农杆菌LBA4404感受态中，冰浴半小时，42℃热激一分钟左右，迅速取出放到冰浴中，复苏一小时，涂抗性板，置于28℃条件下培养48h左右。

挑取转染具有卡那抗性重组质粒的待转化的农杆菌单菌落接种于含有50μg/mlKan、50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养2天；取适量加入新的YEP培养基中，培养3h至对数生长期，将菌液在6,000rpm下离心6min收集菌体，倒掉上清，用MS液体培养基重悬菌体，制得待转化菌液；

3.切取花生幼苗的下胚轴，放入待转化菌液中浸泡20min，取出，在滤纸上晾干，然后移到B培养基中，黑暗条件下共培养2天后，用质量浓度为1％的头孢水溶液浸泡胚轴10min，用无菌水冲洗4遍，取出并在滤纸上晾干，制得转化后下胚轴；

4.将转化后下胚轴移到C培养基中，于25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养20天，可陆续从下胚轴的顶端生出大量的丛生芽，其中大部分丛生芽都是白化的，这些都是没有转化成功的丛生芽(图6)；只有少数丛生芽为绿色植株，为准阳性丛生芽(图6)。由于C培养基中含有Kan，可以除去大部分没有转化成功的丛生芽，挑取绿色植株芽，制得初步筛选植株芽；

5.将得到的初步筛选植株芽转移到D培养基上，培养20天，由于D培养基中含有较高含量的Kan，又使得部分假阳性丛生芽白化而被除去(图7)。该培养基中还含有GA3，可以使丛生芽伸长，挑取绿色植株芽，制得中度筛选植株芽；

6.将中度筛选植株芽转移到E培养基上培养20天，该培养基中含有更大量的Kan，又可以除去部分白化的假阳性植株(图8)，挑取绿色植株芽，制得深度筛选植株芽；

7.将深度筛选植株芽转移到F培养基上诱导生根，经过20天时间就可以生出大量正常的、健壮的根系(图9)，正常移栽，成活率可达90％以上，制得转化植株；

8.阳性植株的分子生物学检测

提取移栽成活的转化植株的叶片中的DNA，用GUS基因的引物GUS-F/R进行扩增，引物序列如下：

GUS-F：5’AACCCCAACCCGTGAAATCAAAAAA3’

GUS-R：5’TCCCGCTAGTGCCTTGTCCAGTTGC3’

扩增体系：0.2ml EP管中，20μl PCR反应体系：

扩增程序：94℃5min，94℃30Sec，50℃30Sec，72℃45Sec。30循环后，72℃延伸10min，4℃保存。

扩增目的片段长度为680bp，与阳性对照扩增片段大小一致，而野生对照花生不能扩增得到此片段(图10)。由图10可以看出，最后得到的绿色植株大部分为阳性植株。

经统计，阳性植株含量为81％。

对比例

传统筛选方法：

农杆菌菌株：LBA4404，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司有售。

植物表达载体：pROK II，该载体上含有nptII基因，可以赋予转基因植株卡那抗性。北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司有售。

花生品种“鲁花14”青岛嘉华种业有限公司有售。

MS基本培养基，组分如下：

NH₄NO₃，1.65g/L；KNO₃，1.9g/L；CaCl₂·2H₂O，0.44g/L；MgSO₄·7H₂O，0.37g/L；KH₂PO₄，0.17g/L；KI，0.83mg/L；H₃BO₃，6.2mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025mg/L；FeSO₄·7H₂O，27.8mg/L；肌醇，100mg/L；甘氨酸，2mg/L；盐酸硫胺素，0.1mg/L；盐酸吡哆醇，0.5mg/L；烟酸，0.5mg/L；蔗糖，30g/L；琼脂，7.2g/L。

所述的液体MS基本培养基为在MS基本培养基的基础上去除琼脂成分获得。

A培养基：除琼脂外，所有成分为MS培养基的一半。

B培养基：在MS培养基的基础上每升加入0.7mg NAA和8.0mg6-BA；

诱导培养基：在MS培养基的基础上每升加入0.7mg NAA、8.0mg6-BA、250mg Cef；

伸长培养基：在MS培养基的基础上每升加入2.0mg GA3、2.0mg6-BA、250mg Cef；

筛选培养基：在MS培养基的基础上每升加入2.0mg GA3、2.0mg6-BA、250mg Cef和100mg Kan；

F培养基：在MS培养基的基础上每升加入IBA0.7mg、NAA0.1mg、GA3 1.0mg、肌醇100mg、VB₁1.0mg，pH5.8。

所述的YEP液体培养基每升组分如下：蛋白胨，10g；酵母提取物，10g；NaCl，5g，NaOH调节pH至7.2，高压灭菌20min。

一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法，步骤如下：

1、将花生种子置于无菌三角瓶中，先加入体积百分比为75％乙醇浸泡1分钟，取出，浸入质量百分比为0.1％的升汞溶液，灭菌20分钟，取出，然后用无菌水冲洗漂洗4-5次。去除种皮，置于A培养基中，于25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养3天，制得花生幼苗；

2.挑取转染具有卡那抗性质粒的待转化的农杆菌单菌落接种于含有50μg/mlKan、50μg/ml利福平的YEP液体培养基中，28℃、200rpm振荡培养2天；取适量加入新的YEP培养基(含50μg/ml Kan、50μg/ml利福平)中，培养3h至对数生长期，将菌液在6,000rpm下离心6分钟收集菌体，倒掉上清，用MS液体培养基重悬菌体，制得待转化菌液；

3.切取花生幼苗的下胚轴，放入待转化菌液中浸泡20min，取出，在滤纸上晾干，然后移到B培养基中，黑暗条件下共培养2天后，用质量浓度为1％的头孢水溶液浸泡胚轴10min，用无菌水冲洗4遍，取出并在滤纸上晾干，制得转化后下胚轴；

4.将转化后下胚轴移到诱导培养基中，于25℃、16h光照/8h黑暗条件下培养20天，可陆续从下胚轴的顶端生出大量的丛生芽；

5.将得到的丛生芽转移到伸长培养基上，培养20天左右，丛生芽伸长长大；

6.将长大的丛生芽转移到筛选培养基上培养30天左右，由于该培养基中含有Kan，可以使部分假阳性植株白化；

7.将绿色丛生芽转移到F培养基上诱导生根，经过20天时间就可以生出大量正常的、健壮的根系，正常移栽即可；

8.阳性植株的分子生物学检测

提取移栽成活的转化植株的叶片中的DNA，用nptII基因的引物NptII-F/R进行扩增。

经统计，阳性植株含量为27％左右。

结果分析

由实施例1和对比例的筛选结果对比可以发现，由于实施例1从花生种子生芽诱导阶段就开始筛选直到最后的深度筛选，约3个月时间，筛选时间较对比例30天左右的时间长，从而极大提高了最后获得的阳性植株的含量。

由实施例1和对比例的总培养时间对比可以发现，实施例1的整个培养时间为90天左右，而对比例为100天左右，实施例1的培养时间明显缩短。

由实施例1和对比例的筛选操作工作量对比可以看出，实施例1共将实验材料转移4次，由于每步均有筛选过程，因此转移的实验材料数量不断减少，工作量逐渐减轻；而对比例也是将实验材料转移4次，但至筛选培养之前的3步转移实验材料均未减少，因此工作量较实施例1明显增加。

Claims (8)

1.一种快速有效地降低花生遗传转化植株假阳性率的筛选方法，其特征在于，步骤如下：

（1）挑取转染具有卡那抗性重组质粒或具有卡那抗性质粒的待转化的农杆菌单菌落接种于含卡那霉素和利福平的YEP液体培养基中，培养至对数生长期，经固液分离，收集菌体沉淀，经液体MS基本培养基重悬，制得待转化菌液；

（2）切取花生幼苗的下胚轴，浸入步骤（1）制得的待转化菌液中进行转化，然后移至B培养基中，黑暗条件下共培养2～3天，经质量浓度为1%的头孢水溶液浸泡后，无菌水冲洗、晾干，制得转化后下胚轴；

所述的B培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入0.6～0.8 mg NAA和7.5~8.5 mg6-BA；

（3）将步骤（2）制得的转化后下胚轴移至C培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得初步筛选植株芽；

所述的C培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入0.6～0.8 mg NAA、7.5~8.5 mg6-BA、200~250 mg Cef和50~75 mg Kan；

（4）将步骤（3）挑取的初步筛选植株芽移至D培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得中度筛选植株芽；

所述的D培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入2.0~3.0 mg GA3、2.0-3.0 mg 6-BA、200~250 mg Cef和90~100 mg Kan；

（5）将步骤（4）制得的中度筛选植株芽移至E培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，挑取绿色植株芽，制得深度筛选植株芽；

所述的E培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入2.0~3.0 mg GA3、2.0~3.0 mg 6-BA、200~250 mg Cef和110~120 mg Kan；

（6）将步骤（5）制得的深度筛选植株芽移至F培养基中，经16h光照/8h黑暗条件下培养20～30天，制得转化植株；

所述的F培养基为在MS基本培养基的基础上每升加入IBA 0.6~0.7 mg、NAA 0.1~0.2mg、GA3 1.0~1.5 mg、肌醇 80~100 mg、VB₁ 1.0~1.2 mg，pH5.8；

所述的液体MS基本培养基为在MS基本培养基的基础上去除琼脂成分获得。

2.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述的MS基本培养基组分如下：

NH₄NO₃，1.65 g/L；KNO₃，1.9 g/L；CaCl₂·2H₂O，0.44 g/L；MgSO₄·7H₂O，0.37 g/L；KH₂PO₄，0.17 g/L；KI，0.83 mg/L；H₃BO₃，6.2 mg/L；MnSO₄·4H₂O，22.3 mg/L；ZnSO₄·7H₂O，8.6 mg/L；Na₂MoO₄·2H₂O，0.25 mg/L；CuSO₄·5H₂O，0.025 mg/L；CoCl₂·6H₂O，0.025 mg/L；FeSO₄·7H₂O，27.8 mg/L；肌醇，100 mg/L；甘氨酸，2 mg/L；盐酸硫胺素，0.1 mg/L；盐酸吡哆醇，0.5 mg/L；烟酸，0.5 mg/L； 蔗糖，30 g/L；琼脂，7.2 g/L。

3.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）的含卡那霉素和利福平的YEP液体培养基为在YEP液体培养基的基础上每升加入如下组分：

卡那霉素 50 mg，利福平 50 mg；

所述的YEP液体培养基每升组分如下：蛋白胨，10 g；酵母提取物，10 g；NaCl，5 g，NaOH调节pH至7.2，高压灭菌20 min。

4.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）中的培养，步骤如下：

在27～28℃、180～220 rpm振荡培养40～50 h，然后转至新的含Kan 50 mg/L和利福平50 mg/L 的YEP培养基中，27～28℃、180～220 rpm振荡培养2～3 h。

5.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）中的固液分离条件如下：在6000～7000 rpm的条件下离心4～6 分钟。

6.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤（1）中的卡那抗性重组质粒为在pROK II质粒中插入功能基因片段获得的重组质粒。

7.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤（2）的花生幼苗按如下方法培育：

将花生种子在体积百分比为75%的乙醇溶液中浸泡1分钟，取出，然后浸入质量百分比为0.1%的升汞溶液中20分钟，取出，然后用无菌水冲洗漂洗4～5次，去除种皮，置于A培养基中，于25℃、16 h光照/8 h黑暗条件下培养3～5天；

所述的A培养基的成分为除琼脂外，其他成分的含量均为MS基本培养基的一半。

8.如权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述步骤（2）中的转化时间为20～30min。