CN104004783B - 一种提高棉花转基因效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种提高棉花转基因效率的方法，所述方法含有以下步骤：a.采用农杆菌介导法将含有目的基因的植物表达载体侵染棉花无菌苗茎尖，将侵染后的棉花茎尖置于共培养培养基上进行共培养；b.共培养后，将棉花茎尖转入筛选培养基上培养；所述共培养培养基与筛选培养基中均含有浓度为0.3mg/L的KT和浓度为0.2mg/L的IAA。利用本发明方法进行无菌苗培养时间2‑3天，共培养2天，筛选培养15‑20天，生根培养20天，转化周期不超过2个月，且经筛选后阳性转化率能达到8％。
Description
技术领域
本发明涉及棉花转基因技术领域，具体地说，涉及一种提高棉花转基因效率的方法。
背景技术
利用基因工程技术对棉花进行遗传改良已取得重要进展。1987年Umbeck等首次报道通过农杆菌介导法将抗卡那霉素基因转入棉花(Umbeck P.Genetically transformed cotton(Gosspium hirsutum L.)Plants.Bio/Teehnology,1987,5:263～266)。传统的遗传转化方法转化周期长、植株再生的基因型依赖性强、再生苗畸形率高、移栽成活率低，成为限制棉花转基因育种研究的瓶颈。
棉花茎尖具有直接分化再生的特点，一经转化就可以在适当培养条件下诱导叶、根的形成而获得转基因植株。农杆菌介导的茎尖转化方法不仅能够解决基因型依赖性问题，还可缩短转化周期和提高移栽成活率。Renfroe等利用棉花茎尖分生组织获得再生植株以来，国内外很多学者也相继利用茎尖分生组织获得了棉花再生植株(RenfroeMH&Smith RH.Isolation and culture of cotton protoplasts.Proc.Beltwide Cotton Prod.Conf.,Natl.Cotton Council,Memphis,1986,TN:79–80)
吕素莲等利用棉花茎尖遗传转化方法将胆碱脱氢酶基因betA和突变的乙酞乳酸合成酶基因als成功转入到3个棉花优良品种中，并获得了抗除草剂氯磺隆和耐盐性提高的转基因植株及后代(吕素莲等.农杆菌介导的棉花茎尖遗传转化及转betA植株的产生.高技术通讯，2004，11:20-25.)。但该技术方案主要是体外茎尖转化法，没有经过棉花细胞和组织培养过程，嵌合体几率增加，不能稳定遗传，后代不符合孟德尔遗传规律。然而，许多经过了细胞和组织培养的棉花转基因方法(如通过下胚轴转化的方法)，由于下胚轴要经过愈伤组织的诱导及分化，转化周期较长，一般6-9个月(刘明月，农杆菌介导棉花遗传转化体系优化，2011，第9页)，且受转化受体基因型的限制。还有一些茎尖为受体的基因枪转化方法，但较农杆菌转化方法而言，费用高，且有瞬时表达和嵌合体现象发生。有其他农杆菌介导的茎尖转化方法表明，从共培养到获得抗性株需3-4个月，周期较长(徐大伟等，2011年，中国农学通报)。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种缩短棉花转化周期，提高棉花转基因效率的方法。
为了实现本发明目的，本发明首先提供一种提高棉花转基因效率的方法，所述方法含有以下步骤：
a.采用农杆菌介导法将含有目的基因的植物表达载体侵染棉花无菌苗茎尖，将侵染后的棉花茎尖置于共培养培养基上进行共培养；
b.共培养后，将棉花茎尖转入筛选培养基上培养；
所述共培养培养基与筛选培养基中均含有浓度为0.3mg/L的激动素(KT)和浓度为0.2mg/L的吲哚-3-乙酸(IAA)。
进一步地，侵染后的棉花茎尖置于共培养培养基上在21℃下暗培养48小时。
进一步地，共培养后将棉花茎尖转入筛选培养基上培养12-15d后，将生根和叶片正常的植株转入生根培养基。
进一步地，所述棉花无菌苗茎尖的培养方法为：将棉籽剥壳后露出棉仁，在无菌环境中用75％的酒精消毒1min，0.1％升汞消毒12min，再用无菌水清洗3-4次后，加入无菌水置于100rpm摇床中28℃培养至吸胀露白，置于种苗培养基上，28℃下暗培养2-3d后，将棉花无菌苗去掉子叶及叶原基，露出生长点并用解剖刀划伤生长点，留取子叶下部约0.5～1.0cm部分成为棉花无菌苗茎尖。
本发明还提供了一种提高棉花转基因效率的共培养培养基，所述共培养培养基含有0.3mg/L KT和0.2mg/L IAA。
进一步地，所述共培养培养基含有MSB5、200μM乙酰丁香酮、30g/L葡萄糖和2.4g/L植物凝胶。
MSB5是指MS无机盐和B5有机物。
本发明还提供了一种提高棉花转基因效率的筛选培养基，所述筛选培养基含有0.3mg/L KT和0.2mg/L IAA。
进一步地，所述筛选培养基含有MSB5、200mg/L头孢霉素(cef)、80mg/L卡那霉素(kan)、15g/L葡萄糖、15g/L蔗糖、2.4g/L植物凝胶。
本发明还提供了前述共培养培养基和筛选培养基在提高棉花转基因效率中的应用。
本发明的有益效果在于：
本发明通过设置不同的激素(组合)，优化了农杆菌介导的茎尖转化技术体系，使转化周期缩短，转化率提高。利用本发明方法进行无菌苗培养时间2-3天，共培养2天，筛选培养15-20天，生根培养20天，转化周期不超过2个月，且经筛选后阳性转化率能达到8％。
目前能够获得再生植株的基因型多数为生产上淘汰的老品种，直接利用的价值不大，获得的转基因材料要通过杂交和多代回交，才能够在生产上利用，大大降低了转基因育种的利用价值。本发明采用的冀棉14农艺性状较传统的易转化的老品种好。
本发明中获得的转基因植株易生根，且易直接移栽，成活率达99％以上。移栽时土也不需要灭菌，较转基因苗的嫁接及直接移栽灭菌土省力又省时。
本申请选用生长2-3天的无菌苗茎尖为外植体，保证外植体的较强分裂和转化能力。外植体的侵染时间也影响转化率，侵染时间过长易引起后续实验中的污染，侵染时间过短又造成转化率低，因此本案中侵染15-20min，能保证较高的转化率。
附图说明
图1为本发明实施例中茎尖转化过程图；
其中，a.无菌苗；b.去掉子叶的茎尖；c.茎尖生长点；d.共培养；e.筛选初期；f.筛选后期；g.生根后炼苗；h.炼苗后移栽所述方法。
图2为本发明实施例中再生植株DNA的PCR扩增电泳检测图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1提高棉花转基因效率
1材料和方法
1.1试验材料
本试验供试材料为陆地棉(G.hirsutum L.)品种：冀棉14。
转化菌株：根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404。
转化基因GbAPX来自本实验室构建的受黄萎病菌(Verticilliumdahliae)胁迫的海岛棉品种Pima90-53根组织转录组文库。
1.2主要试剂与药品
乙酰丁香酮、植物凝胶(phytagel)、植物生长调节剂(IAA和KT)、卡那霉素及头孢霉素。
PCR引物主要由生工生物工程有限公司合成。
1.3试验方法
1.3.1培养基制备
根据表1制备所需培养基。
表1试验所用的培养基
1.3.2无菌苗培养
棉籽用小钳子剥壳后露出棉仁，在超净工作台上用75％的酒精消毒1min，0.1％升汞消毒12min，用无菌水清洗3-4次，加入适量无菌水，置摇床(100rpm，28℃)培养24h吸胀露白，置于种苗培养基上，28℃下暗培养2-3d。
无菌苗去掉子叶及叶原基，露出生长点，留取子叶下部约0.5～1.0cm部分用于转化。
1.3.3农杆菌菌液的制备
将已经构建好的GbAPX基因在固体LB培养基上涂板，28℃暗培养48h后，挑取单克隆接种到含有卡那霉素100mg/L、链霉素100mg/L的液体LB培养基中振荡培养(28℃)至菌液的OD值至0.8～1.0，3500r/min离心5min，倒掉上清液，菌体用液体共培养基(此处的液体共培养基是表1中的共培养培养基除去琼脂phytagel)重悬后用于侵染15～20min，侵染前加入200μmol/L的乙酰丁香酮(AS)。
1.3.4共培养及筛选培养
将侵染后的茎尖转入共培养培养基21℃暗培养48h后，转入筛选培养基培养12～15d后，将生根和叶片正常的植株转入生根培养基。
1.3.5转基因植株的获得与PCR检测
待生根培养基中的植株长到约5cm时揭膜炼苗，取再生植株幼嫩叶片，采用CTAB法进行植株总DNA的提取，并利用跨载体引物进行扩增。
扩增引物为：P-F：TGGGCGGTCGTTCTAGATC；
P-R：GGGCGCAGTTCTTCTCGG。
反应体系为20μl体系，包括10×buffer、dNTP、MgCl2、P-F引物、P-R引物、taq酶、模板DNA和ddH2O。
反应程序为：94℃预变性10min，94℃变性45s，56℃退火45s，72℃延伸1min；循环30次；最后72℃延伸10min，4℃保存。
对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(1％)，并在凝胶成像系统中观察拍照。
2结果与分析
2.1再生植株的获得
种子经过消毒处理后，种于萌发培养基上，共得到100颗无菌苗(图1-a)。将无菌苗从萌发培养基中移出来，切除两片子叶及叶原基，露出生长点(图1-b、1-c)。用解剖刀将茎尖组织划伤，放入备好的重悬液中，在摇床上(28℃，100rpm)侵染15～20min，插入共培养基中进行暗培养48h(图1-d)，转入筛选培养基，培养15d即可以明显看出转化效果。
筛选初期绝大多数的叶片生长正常(图1-e)，当筛选15d后，大多数植株生长状况较差，顶端叶片停止生长或者生长缓慢，叶片变黄、变黑，开始脱落，根系未再生或伸长较短，颜色发黑，然后停止生长并死亡，只有10颗植株(筛选后的再生率10％)生长情况较好，叶片展开，茎尖再生出新的叶片，根系再生和伸长正常，然后揭膜锻炼(图1-f、1-g)。锻炼后正常生长的植株移栽(图1-h)。
2.2再生植株的PCR检测
将成活的10颗再生植株，提取基因组DNA进行PCR检测，结果表明有以冀棉14为受体的8颗植株(再生植株中阳性率为8％)能够得到预期的753bp的目的条带(图2)。将鉴定为阳性的8颗植株从营养钵移入大田，已得T1代种子。
3结论
3.1转化周期短
本试验无菌苗培养时间2-3天，共培养2天，筛选培养15-20天，生根培养20天，转化周期不超过2个月。
3.2转化阳性率高
卡那霉素筛选后再生植株占总无菌苗的10％，阳性率为8％。
实施例2转基因棉花培养中共培养及筛选培养基的优化
操作方法同实施例1，与实施例1的不同在于：本实施例中棉花无菌苗茎尖经农杆菌侵染后置于不同激素(组合)的共培养培养基和筛选培养基上生长。具体为：
棉花无菌苗茎尖经农杆菌侵染后置于不同激素(组合)的共培养培养基和筛选培养基上，每种激素(激素组合)各2瓶，共46瓶(包括对照2瓶)，每瓶种5个茎尖。
共培养培养基为：MSB5+激素(组合)+200μmol AS+30g/L葡萄糖+2.4g/L phytagel，pH5.4；
筛选培养基为:MSB5+200mg/Lcef+80mg/L kan+葡萄糖15g/L+蔗糖15g/L+激素(组合)+0.25％Phytagel，pH5.8；
培养条件为(28±2)℃，2000lx，16h/8h(光/暗)，每3周继代1次，统计不同激素(组合)培养基上的成苗数及苗高(见表2、3、4)。
通过对不同激素(组合)下成苗数及苗高统计，结果显示在共培养培养基及筛选培养基上同时加入0.3mg/L的KT与0.2mg/L的IAA较其他浓度苗高及苗伸长长度差异极显著，有利于叶片的产生和茎尖的伸长，既能增加成苗数，又可缩短转化周期，约2个月即可移栽。
表2不同激素处理下的成苗数
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种提高棉花转基因效率的方法，其特征在于，所述方法含有以下步骤：
a.采用农杆菌介导法将含有目的基因的植物表达载体侵染棉花无菌苗茎尖，将侵染后的棉花茎尖置于共培养培养基上进行共培养；
b.共培养后，将棉花茎尖转入筛选培养基上培养；
所述共培养培养基与筛选培养基中均含有浓度为0.3mg/L的激动素和浓度为0.2mg/L的吲哚-3-乙酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，侵染后的棉花茎尖置于共培养培养基上在21℃下暗培养48小时。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，共培养后将棉花茎尖转入筛选培养基上培养12-15d后，将生根和叶片正常的植株转入生根培养基。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述棉花无菌苗茎尖的培养方法为：将棉籽剥壳后露出棉仁，在无菌环境中用75％的酒精消毒1min，0.1％升汞消毒12min，再用无菌水清洗3-4次后，加入无菌水置于100rpm摇床中28℃培养至吸胀露白，置于种苗培养基上，28℃下暗培养2-3d后，将棉花无菌苗去掉子叶及叶原基，露出生长点并用解剖刀划伤生长点，留取子叶下部0.5～1.0cm部分成为棉花无菌苗茎尖。
5.一种提高棉花转基因效率的共培养培养基，其特征在于，所述共培养培养基含有0.3mg/L激动素和0.2mg/L吲哚-3-乙酸。
6.根据权利要求5所述的共培养培养基，其特征在于，所述共培养培养基含有MSB5、200μM乙酰丁香酮、30g/L葡萄糖和2.4g/L植物凝胶。
7.一种提高棉花转基因效率的筛选培养基，其特征在于，所述筛选培养基含有0.3mg/L激动素和0.2mg/L吲哚-3-乙酸。
8.根据权利要求7所述的筛选培养基，其特征在于，所述筛选培养基含有MSB5、200mg/L头孢霉素、80mg/L卡那霉素、15g/L葡萄糖、15g/L蔗糖、2.4g/L植物凝胶。
9.权利要求5或6所述的共培养培养基在提高棉花转基因效率中的应用。
10.权利要求7或8所述的筛选培养基在提高棉花转基因效率中的应用。
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