CN101736028B

CN101736028B - 一种以大豆子叶节为受体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法

Info

Publication number: CN101736028B
Application number: CN 200810181514
Authority: CN
Inventors: 程云清; 刘剑锋; 赵桂兰; 陈智文
Original assignee: Jilin Normal University
Current assignee: Jilin Normal University
Priority date: 2008-11-20
Filing date: 2008-11-20
Publication date: 2011-11-16
Anticipated expiration: 2028-11-20
Also published as: CN101736028A

Abstract

一种以大豆子叶节为受体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法，应用于生物技术和现代农业技术领域。本发明在传统的子叶节转化基础上，以不依赖组织培养的转化方法对大豆的遗传转化进行完善。在筛选有效的大豆子叶节再生系统的基础上，突出了不依赖组织培养的转化体系。通过常规大豆品种的转化验证，在田间栽培情况下进行直接转化，可促进转化部位丛生芽的萌发与生长。通过叶片喷施或涂抹，可有效对阳性枝进行筛选。阳性植株不需要经过生根过程，于转化后5个月可以直接获得转基因后代，很大程度上提高了大豆遗传转化效率，显著缩短了大豆遗传转化的周期。该转基因方法将改变大豆遗传转化难的现状，促进大豆遗传转化的研究和产业化发展。

Description

一种以大豆子叶节为受体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法

技术领域

本发明属于植物转基因技术领域，具体涉及提高转基因大豆遗传转化效率的方法。

背景技术

大豆遗传转化目前已成为许多难转化植物的模式植物。目前，大豆遗传转化方法较为广泛认可和应用的主要是根癌农杆菌介导的子叶节转化系统。目前已经商业化的几个转基因大豆品种主要来源于该系统。但是该系统的生根和炼苗两个阶段非常费力费时，而且移栽的成活率非常低，仅为10％左右，而且从转化到产生T1代所用的周期长，约需6-8个月的时间，这严重制约了大豆遗传转化的研究和发展。本项发明的一种以大豆子叶节为受体不依赖于组织培养的大豆转基因的新方法，可以避开生根和炼苗两个阶段，从转化到产生T1代所需的时间仅需要4-5个月的时间，显著地缩短了转基因植株产生时间，因为不需依赖组织培养，减少了接种，继代等多个步骤，极大的节约了人力、物力和财力。

发明内容

本发明的目的是提供一套以大豆子叶节为受体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法。其特征在于：利用带有目的基因和选择标记基因的农杆菌或DNA直接转化缓冲液，对大豆的子叶节部位进行转化。转化植物受体为仅去掉大豆顶芽的萌发5-7天的大豆幼苗。该子叶节被转化后依旧培养在培养基质中，依靠胚根吸收水分和矿质元素。转化产生的T₀代分枝，依赖选择标记物质进行筛选，去除阴性枝条，对获得的阳性枝条进行培养至产生种子。

本发明的主要技术方案如下：

a不依赖于组织培养的大豆转化系统：选取籽粒饱满的大豆种子，播种到培养钵或田间。5-7d后大豆出苗，小心用手术刀将大豆的顶芽和腋芽去除干净，造成锲形伤口，然后顺着脉络方向轻划5-6刀。用含有目的基因和选择性性标记基因的农杆菌或DNA的转化缓冲溶液对大豆子叶节部位进行侵染。

b子叶节部分转化和建立芽诱导的适宜的条件：侵染后的子叶及子叶节部位用黑色袋罩好保湿，避光培养，培养温度为20-25℃，5-8天丛生芽生成，此时去掉黑色袋，置光下进行常规培养。

c经过10-15天培养后，芽体伸长长出1-3片叶片后，利用选择标记物质对叶片进行喷施或涂抹。2-3天后去除阴性的不定芽，选择标记物质筛选阳性的枝条进行常规培养。

d提取存留的大豆枝条嫩叶总DNA和种子总DNA，用PCR方法检测转基因大豆植株当代和T1代种子的转化特征。

该转化方法是将农杆菌或DNA转化缓冲液直接滴加到灭菌过的脱脂棉上至脱脂棉被转化缓冲液饱和，将脱脂棉置于大豆的子叶节部位进行侵染，还包括将带有下胚轴，胚根和子叶的受体整个置于转化缓冲液中完成侵染。为提高缓冲液的附着程度，转化缓冲液中可添加表面活性剂物质；为提高转转化效率，一般在转化缓冲液中添加乙酰丁香酮类物质；为提高转化后丛生芽的分化效率，转化缓冲液中可添加6-BA，2，4-D等植物生长调节物质。

去掉顶芽的幼苗受体利用农杆菌或DNA溶液进行侵染时，该受体可以从培养基质中取出完成转化，然后重新移栽到培养基质中，也可以将受体不从培养基质中取出就地转化。转化后的受体依旧依赖于幼苗的胚根吸收水分和矿质元素。

不依赖于培养的子叶节转化技术提高转基因大豆遗传转化效率的方法中，将新叶用选择性标记物质进行筛选时，可以用选择性标记物质对产生的枝条进行喷施筛选，也可以直接涂抹筛选。但一定要保护好子叶及其以下末转化的部分。对于选择标记阴性的枝条要即时去除，以有更多的营养物质提供给阳性的枝条生长发育至产生T1代种子。

对于选择标记物质筛选阳性的枝条，提取DNA和RNA进行分子标记，检测枝条的转化特征。

本发明的优点和效果如下：

1)目前大豆是公认的难转化作物，制约大豆遗传转化效率的因素主要是大豆的分化效率低和大豆转化植株生根难，炼苗移栽成活率低。目前提高大豆遗传转化效率主要集中在提高大豆的分化效率上，但是大豆分化效率的提高幅度不是很明显，而针对大豆转化植株生根困难，移栽成活低这个限制因素，虽然有人做了大量的工作，但是目前还没有好的办法来克服。通常只能通过提高大豆的分化效率来获得足够多的转化植株，以保证转基因大豆的获得，但因为大豆的分化主要依赖于组织培养，转化成本增高，而且无疑增加了大豆遗传转化的工作量。本项发明就不依赖于组织培养的转化方法在植株上进行丛生芽的诱导，在获得丛生芽之后直接进行抗性筛选，因为保持了转化受体的根系和茎段，通过筛选获得完整的转化植株，成功的克服了大豆遗传转化中的限制性的因素。应用该种转化技术优势非常明显，首先，不依赖于组织培养，节约了诱芽成本和劳动力；同时该转化方法减少了生根和炼苗的步骤，提高了转化植株的成活率；应用直接转化技术缩短了大豆遗传转化周期，比原来依赖组织培养的子叶节转化6-8个月，可以短短到4-5个月，至少节省1-3个月的时间；

直接转化没有对大豆转化植株产生遗传突变等负面影响，能够正常的开花结实。大豆直接转化植株，T0代更接近于实生苗，获得的T1代种子结实饱满、种子数量多，便于对T1代种子的筛选和分析。

附图说明：

图1是双元载体pCAMBIA 3301的结构图。

实施例一

利用不依赖于组织培养的子叶节转化法获得抗除草剂的转基因植株

1)材料：大豆品种铁丰31，收于吉林师范大学实验田。

2)菌株和质粒：农杆菌菌株EHA105为吉林师范大学生态环境研究所保存，转化载体为CaMV 35S为启动子，将带有抗除草剂基因(bar基因)的pCAMBIA 3301植物双元表达载体(由吉林省农业科学院赵桂兰研究员馈赠)，导入根癌农杆菌菌株EHA 105，作为基因工程菌转化大豆子叶节。图1是双元载体的结构图。

3)种苗的获得：将大豆种子播种到土壤基质中，5-7天后待子叶变绿展开后，用手术刀去净顶芽和腋芽，然后顺着脉络方向划5-6刀，约3-4mm长，0.5mm深。

4)从农杆菌EHA105-pCAMBIA 3301平板中挑取单菌落接种到3ml YEB液体培养基中培养，待生长到OD＝0.6左右时，离心4000rpm，10min，收集菌体，待用。

5)转化缓冲液：1/2MS+0.25mg/LGA₃+1.67mg/L6-BAP+3％蔗糖+40mg/L乙酰丁香酮，pH5.4，菌体用1ml转化缓冲液进行悬浮，离心，收集菌体，重悬两次，菌体的转化缓冲液悬浮液用作转化用。

6)将转化缓冲液直接滴加到灭菌过的脱脂棉上至脱脂棉被转化缓冲液饱和，将脱脂棉置于大豆的子叶节部位进行侵染，侵染后的子叶及子叶节部位用黑色袋罩好保湿，避光培养，培养温度为20-25℃，5-8天丛生芽生成，此时去掉黑色袋，置光下进行常规培养。

7)10-20天后，待芽体长出1-3片叶片时，将0.5％Basta除草剂用脱脂棉均匀涂抹于叶片的表面，一周后观察叶片状态，叶片黄化枯焦斑点的，则为阴性枝，去除阴性枝，保留阳性枝。提取转化材料嫩叶和T1代种子DNA进行PCR扩增，初步证明外源基因已经整合到大豆基因组中。

8)应用直接转化技术缩短了大豆遗传转化周期，比原来依赖组织培养的子叶节转化6-7个月，可以短短到4个月，至少节省2-3个月的时间。

9)直接转化没有对大豆转化植株产生遗传突变等负面影响，能够正常的开花结实。

转化大豆实生苗127株，共获得Basta阳性T0代植株8株，获得的172粒T1代种子结实饱满。

实施例二

GUS基因通过不依赖于组织培养的子叶节转化方法转化大豆

1)材料：大豆品种铁丰31，收于吉林师范大学实验田。

2)菌株和质粒：农杆菌菌株LBA4404-PBI121为吉林师范大学生态环境研究所保存，双元载体pBI121-GUS，含有35s启动子，GUS报告基因，卡拉霉素为选择抗性基因。

3)种苗的获得：将于5月1日将大豆种子播种到土壤基质中，5-7天后待子叶变绿展开后，用手术刀去净顶芽和腋芽，然后顺着脉络方向划5-6刀，约3-4mm长，0.5mm深。

4)从农杆菌LBA4404-PBI121-GUS平板中挑取单菌落，接种于含有抗生素的YEB培养基中，于28℃和250rpm条件下摇动培养至生长对数期(菌液吸光度OD55O为1.8-2.0)；③将培养好的菌液在5000rpm条件下离心10min，然后菌体重新悬浮于转化缓冲液中(1/2MS液体培养基+200pmol/L乙酰丁香酮)+1.67mg/L6-BAP+0.01％的Dow corning Q2-5211+40mmol/L的CaCl₂)，pH5.4，稀释后的菌液浓度约2×10⁸cfu/ml

5)将菌液转化缓冲液直接滴加到灭菌过的脱脂棉上至脱脂棉被转化缓冲液饱和，将脱脂棉置于大豆的子叶节部位进行侵染，侵染后的子叶及子叶节部位用黑色袋罩好保湿，避光培养，培养温度为20-25℃，5-8天丛生芽生成，此时去掉黑色袋，置光下进行常规培养。

6)10-20天后，待芽体长出1-3片叶片时，将100mg/mL卡拉霉素用棉花均匀涂抹于叶片的表面，一周后观察叶片状态，叶片有黄化枯焦斑点的，则为阴性枝，去除阴性枝，保留阳性枝。

7)剪取阳性植株的叶片少许置于PCR管中，利用X-gluc对阳性叶片进行染色，然后置于37℃培养箱中1-12个小时，通过乙醇脱色后，于体视显微镜下观察记录GUS基因的表达情况。

8)借助于这种转基因方法对105株大豆幼苗进行转化，一个月后对T0代丛生枝进行检测，结果有5株表现为卡拉霉素抗性，其中有4株表现为GUS染色阳性，去除阴性枝，保留抗卡拉霉素和GUS染色阳性枝条，于2007年10月2日收获T1代种子，平均每个阳性T0代植株收获种子21粒，通过不依赖于组织培养的大豆子叶节转化方法，将大豆遗传转化周期缩短至不到5个月的时间。

对T₁代种子播种后，得到57株抗卡拉霉素和GUS染色阳性的T1代植株。

Claims

1.一种以大豆子叶节为受体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法，其特征在于采用了以下步骤：

a.不依赖组织培养的大豆转化系统：选取籽粒饱满的大豆种子，播种到培养钵或田间，5-7d后大豆出苗，小心用手术刀将大豆的顶芽和腋芽去除干净，造成锲形伤口，然后顺着脉络方向轻划5-6刀，用含有目的基因和选择标记基因的农杆菌的转化缓冲溶液对大豆子叶节部位进行侵染；

b.建立共培养和芽诱导的适宜的条件：侵染后的子叶及子叶节部位用黑色袋罩好保湿，避光培养，培养温度为20-25℃，5-8天丛生芽生成，此时去掉黑色袋，置光下进行常规培养；

c.经过10-15天培养后，芽体伸长长出1-3片叶片后，利用一定浓度的选择标记物质对叶片进行喷施或涂抹，2-3天后去除阴性的不定芽，选择标记物质筛选阳性的枝条进行常规培养；

d.提取存留的大豆枝条嫩叶总DNA和种子总DNA，用PCR方法检测转基因大豆植株当代和T1代种子的转化特征。

2.按权利要求1所述的一种以大豆子叶节为受体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法，其特征是带有下胚轴、胚根和子叶的子叶节作为转化受体，子叶节受体被转染后移种到培养基质后能够依靠其根系完成植株吸收无机成分完成整个生长的需要。

3.权利要求2所述的以大豆子叶节为受体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法，其中子叶节转化受体利用农杆菌的转化缓冲溶液进行侵染时，该受体可以从培养基质中取出完成转化，然后重新移栽到培养基质中，也可以将受体不从培养基质中取出就地转化。

4.权利要求1所述的一种以大豆子叶节为受体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法，包括将农杆菌的转化缓冲溶液直接滴加到灭菌过的脱脂棉上至脱脂棉被转化缓冲溶液饱和，将脱脂棉置于大豆的子叶节部位进行侵染，或者将带有下胚轴，胚根和子叶的受体整个置于转化缓冲溶液中完成侵染。

5.权利要求1所述的一种以大豆子叶节为受体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法，其中转化缓冲溶液中添加表面活性剂物质以提高缓冲溶液的附着程度。

6.权利要求1所述的一种以大豆子叶节为受体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法，其中转化缓冲溶液中添加乙酰丁香酮以提高转化效率。

7.权利要求1所述的一种以大豆子叶节为受体不依赖组织培养的大豆遗传转化新方法，其中转化缓冲溶液中添加植物生长调节物质以提高转化后丛生芽的分化效率。