CN101176427A - 一种以大豆子叶节再生植株的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于农业生产技术领域。是一种以大豆子叶节为外植体进行大豆器官发生和植株再生的方法。本发明在传统组织培养的基础上，以大豆子叶节为外植体进行器官发生途径再生系统的完善，在筛选有效的大豆种子消毒技术的基础上，突出了各种培养基成分的改进与优化，通过常规大豆品种的组织培养验证，可有效促进丛生芽的诱导、伸长和生根，提高无菌苗的质量和丛生芽的分化率，能够很好实现多数品种子叶节器官发生和植株再生过程，为大豆遗传转化和分子改良提供了坚实的技术支撑，对我国大豆高效育种和健康生产将具有重要的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于农业生产技术领域。是一种以大豆子叶节为外植体进行大豆器官发生和植株再生的方法。
技术背景
大豆植株再生系统是实现大豆基因遗传转化的先决条件。良好的大豆植株再生系统应该具有高效的种子消毒技术、适宜的种子萌发培养基和丛生芽诱导培养基、伸长培养基、生根培养基以及必要的无菌苗驯化培养技术等。从20世纪80年代初，人们选择了幼胚、幼胚子叶或胚轴为外植体，用异常高浓度的植物生长调节物质，建立了大豆的体细胞胚胎发生和器官发生再生系统。随后用成熟胚子叶、子叶节、初生叶和初生叶节等相继获得了较高频率的源于不定芽的再生植株，80年代末期原生质体培养获得突破。研究表明，不同的外植体再生频率差异较大，其中以子叶节的再生频率较高，是进行大豆植株再生培养最有效的途径和方法。目前，已有很多关于大豆子叶节再生植株的报道(Owens，1985；Mauto，1995；Trick，1997，1998；苏彦辉，1999；周思军，2000)。
虽然大豆植株再生系统中外植体的来源已比较明确，但是在组织培养过程对种子消毒、器官发生过程中各种培养基的应用还比较混乱，对植株再生频率也产生了很大的影响。无菌苗的获得离不开有效的种子消毒方法，常用的消毒剂有次氯酸钠、过氧化氢和升汞等，在大豆组织培养中以应用升汞和次氯酸钠居多。在组织培养过程中，尤其重要的是培养基的选择及其激素的添加，这对外植体丛生芽诱导、伸长和生根都有重要的影响，是决定外植体器官发生和植株再生的关键环节。在萌发培养基中，一般要添加6-BA以提高无菌苗的质量。在丛生芽诱导培养基中要添加适宜配比的6-RA和GA3，以促进子叶节不定芽诱导分化和伸长。在伸长培养基中要添加6-BA、Glu、GA3和ZT以提高丛生芽的伸长率。而在生根培养基中也要添加IBA或NAA，以提高丛生芽的生根能力。所有这些激素添加与否以及剂量的大小对无菌苗的生长和丛生芽诱导、伸长和生根产生重要的调节作用。因此，要建立完善的子叶节器官发生途径再生系统，必须在相应培养基中添加必要的生长激素，并确定合理添加浓度。
为此，我们针对上述问题，对大豆子叶节器官发生途径再生系统进行完善和优化，研究出本发明。
发明内容
本发明从以上技术背景出发，以大豆子叶节作为外植体进行大豆器官发生和植株再生研究，包括无菌苗的获得、子叶的获得、丛生芽的诱导、伸长、生根和驯化，直至植株结荚成熟的整个过程。具体操作程序如下：
a.无菌苗的获得
取表面洁净的大豆种子用自来水冲洗15min后，放入70％乙醇溶液中处理50s，0.1％HgCl2溶液中处理5min，然后取出用无菌水洗4-5次，接到萌发培养基中。萌发培养基为B5-A盐、B5-B盐、MS-C盐、B5有机物、3％蔗糖、0.8％琼脂粉、2.0mg/L6-BA，pH值为5.8。培养条件为：温度25±1℃，光周期16/8h。
b.子叶节的获得
取萌发5-7d子叶鲜绿、子叶节处膨大的大豆无菌苗，在子叶节下3-4mm处切去下胚轴，纵向切开子叶，去顶芽、侧芽和种子根，每株无菌苗可获得来两个子叶节外植体。
c.丛生芽的诱导将子叶按近轴面朝上插入添加1.7mg/L 6-BA和0.2mg/L GA3的诱导培养基中培养。诱导培养基的基本成分为MS无机物、B5有机物和500mg/L谷氨酰胺。培养条件为：温度25±1℃，光周期16/8h。
d.丛生芽的伸长
待丛生芽可见时，将外植体转入芽伸长培养基，转接时切去子叶及下胚轴基部的老化组织，每10d继带一次。培养条件为：温度25±1℃，光周期16/8h。芽伸长的培养基为B5盐、MS-C、B5-D、0.1mg/L IAA、10mg/L硝酸银、3％蔗糖、0.8％琼脂粉，0.34mg/L 6-BA、50mg/L Glu、0.5mg/L AG3、0.5mg/L ZT，pH值为5.8。
e.丛生芽的生根与驯化
带丛生芽长到3-4cm时，切下转入生根培养基进行培养，待丛生芽根生出并达到了3-4cm后，洗净根部的培养基，将生根的小植株移入液体生根培养基中炼苗3-5d，并打开瓶口，使无菌苗适应有菌的外界环境。然后将小植株取出移至营养钵的土壤中(蛭石∶草炭土∶细土＝1∶2∶2)培养驯化，套袋以保湿，然后逐渐降低湿度、增强光照。待小苗成活后，转入正常土壤中栽培，保持温、湿度和正常的光照直至结荚成熟。丛生芽生根培养基为1/2MSB、0.37mg/L NAA、2％蔗糖和0.8％琼脂粉，pH值为5.8。
具体实施方式
本发明在中国科学院东北地理与农业生态研究所的“大豆高维生素E合成基因遗传转化”课题中得到了应用。在课题实施过程中采用本发明对生产上应用较多的黑农35、合丰35、合丰25和绥农14等品种进行了高维生素E合成基因遗传转化研究，对于本课题的完成和高维生素E大豆育种都起到了有效的技术支撑。下面列出了大豆子叶节基因型筛选结果：
大豆子叶节基因型筛选
| 序号 | 基因型 | 外植体数(个) | 出芽外植体数(个) | 芽诱导率(％) | 总芽数(个) | 每个外植体发芽数(个) | |||
| I | II | I | II | I | II | ||||
| 123456 | 黑农35合丰35合丰25绥农10绥农14东生1号 | 333035333133 | 353234322930 | 312633282326 | 322732261825 | 926585.4894.2083.0868.3380.95 | 96126130158057 | 105131121167651 | 3.194.853.860.573.802.12 |
根据大豆子叶节基因型筛选结果可以看出，合丰25的丛生芽分化率最高，为94.20％，其次是黑农35，丛生芽分化率为92.65％，合丰35、绥农10、东生1号和绥农14丛生芽分化率分别为85.48％、83.08％、80.95％和68.33％。每个外植体的丛生芽数以合丰35最多，为4.85个，合丰25和绥农14次之，分别为3.86和3.80个，黑农35、东生1号和绥农10分别为3.19、2.12和0.57。从总体上看，应用此发明所有基因型的分化率均在60％以上，每个外植体的丛生芽数也在2-5之间，因此可以断定除了绥农10以外，其它4个品种应用子叶节作为外植体进行器官发生和植株再生是比较理想的，这与文献报道的基本上是一致的，可见本方法不仅是可行的，而且对大豆遗传改良上具有重要的推动作用。
Claims (1)
1.一种以大豆子叶节为外植体进行大豆器官发生和植株再生的方法，其特征在于采用了以下的方法与程序：
a.无菌苗的获得
取表面洁净的大豆种子用自来水冲洗15min后，放入70％乙醇溶液中处理50s，0.1％HgCl2溶液中处理5min，然后取出用无菌水洗4-5次，接到萌发培养基中，萌发培养基为B5-A盐、B5-B盐、M5-C盐、B5有机物、3％蔗糖、0.8％琼脂粉、2.0mg/L6-BA，pH值为5.8，培养条件为：温度25±1℃，光周期16/8h；
b.子叶节的获得
取萌发5-7d子叶鲜绿、子叶节处膨大的大豆无菌苗，在子叶节下3-4mm处切去下胚轴，纵向切开子叶，去顶芽、侧芽和种子根，每株无菌苗可获得来两个子叶节外植体；
c.丛生芽的诱导将子叶按近轴面朝上插入添加1.7mg/L 6-BA和0.2mg/L GA3的诱导培养基中培养，诱导培养基的基本成分为MS无机物、B5有机物和500mg/L谷氨酰胺，培养条件为：温度25±1℃，光周期16/8h；
d.丛生芽的伸长
待丛生芽可见时，将外植体转入芽伸长培养基，转接时切去子叶及下胚轴基部的老化组织，每10d继带一次，培养条件为：温度25±1℃，光周期16/8h，芽伸长的培养基为B5盐、MS-C、B5-D、0.1mg/L IAA、10mg/L硝酸银、3％蔗糖、0.8％琼脂粉，0.34mg/L 6-BA、50mg/L Glu、0.5mg/L AG3、0.5mg/L ZT，pH值为5.8；
e.丛生芽的生根与驯化
带丛生芽长到3-4cm时，切下转入生根培养基进行培养，待丛生芽根生出并达到了3-4cm后，洗净根部的培养基，将生根的小植株移入液体生根培养基中炼苗3-5d，并打开瓶口，使无菌苗适应有菌的外界环境，然后将小植株取出移至营养钵的土壤中(蛭石∶草炭土∶细土＝1∶2∶2)培养驯化，套袋以保湿，然后逐渐降低湿度、增强光照。待小苗成活后，转入正常土壤中栽培，保持温、湿度和正常的光照直至结荚成熟，丛生芽生根培养基为1/2MSB、0.37mg/L NAA、2％蔗糖和0.8％琼脂粉，pH值为5.8。
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