CN110073976A - 一种组培大豆种子的消毒方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种组培大豆种子的消毒方法，包括清洗、酒精消毒、过氧化氢消毒、无菌水浸泡的过程。本发明利用一定浓度的过氧化氢代替常规的升汞、次氯酸钠等消毒方法，降低了对环境的污染，节省了消毒的时间，而且，促进了种子的萌发，使无菌苗的获得时间缩短，降低了种子受污染的几率。

Description

一种组培大豆种子的消毒方法

技术领域

本发明涉及种子消毒技术领域，更具体地说是涉及一种组培大豆种子的消毒方法。

背景技术

大豆是我国重要的经济作物和粮食作物，同时是一种典型的双子叶植物。其种子为人类提供了丰富的蛋白，高质量的植物油、矿物质和微生素等资源。但是随着环境不断恶化，干旱和土壤盐渍化等非生物逆境严重制约大豆的生产，严重致使大豆产量和品质受到极大影响。因此开展作物抗逆机理研究，改善作物抗性和品质对提高我国的大豆安全具有重要的意义。通过挖掘和克隆非生物逆境相关耐逆基因，同时将目标基因进行遗传转化，对大豆耐逆性选育提供一定的参考价值。利用不同大豆材料筛选出具有愈伤诱导、再生能力较好的品系，为后续基因转化研究积累相关的技术。大豆组培的第一步是种子的消毒，然后获得无菌苗。

目前，大豆组培获得无菌苗的消毒方法主要有四种：氯气消毒、次氯酸钠消毒、升汞消毒法和二次消毒法。由于氯气是剧毒气体，对实验装置的气密性要求很高，研究表明，这个方法对种子消毒效果不彻底，同时对氯气的浓度和消毒时间的控制不统一。次氯酸钠消毒大豆的浓度目前还没有统一的标准，升汞法由于汞的剧毒性以及对环境的污染在国际上已经被淘汰。二次消毒法过程太繁琐，且时间很长。

因此，如何提供一种环境友好且消毒简单、彻底的对大豆种子消毒的方法是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种组培大豆种子的消毒方法，利用一定浓度的过氧化氢代替常规的升汞、次氯酸钠等消毒方法，降低了对环境的污染，节省了消毒的时间，而且，促进了种子的萌发，使无菌苗的获得时间缩短，降低了种子受污染的几率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种组培大豆种子的消毒方法，包括下述步骤：

1)选取长势一致、表面干净的大豆种子，用无菌水浸泡2-5min，捞出、清洗，备用；

2)将所述步骤1)得到的大豆种子置于75％酒精中浸泡1-2min；

3)将所述步骤2)中得到的大豆种子置于装有13％-17％的H₂O₂溶液的容器中浸泡0.5-2h，期间，将盛有大豆种子和H₂O₂溶液的容器置于摇床上连续振荡；

4)将所述步骤3)中的大豆种子用无菌水清洗3-4次，然后在无菌水中浸泡16-18h，得到消毒的大豆种子。

以上技术方案达到的技术效果是：利用过氧化氢对大豆种子进行消毒，在对种子消毒完毕后，还可以对培养器皿直接消毒；过氧化氢作为废液处理后，相对于常规的种子消毒剂升汞、次氯酸钠等，对环境的污染小。此消毒方法不仅节省时间、消毒彻底，还能够促进大豆种子萌发，缩短了育苗的时间，是一种高效、环保、省时的消毒方法；消毒的大豆种子去除种皮，置于萌发培养基上培养，只需4天，即可获得无菌苗。

作为本发明优选的技术方案，所述步骤1)中清洗的过程为：将用无菌水浸泡的大豆种子在无菌水下冲洗1-3min。

以上技术方案达到的技术效果是：经过无菌水浸泡过的大豆种子表面可能残留有杂质或微生物，经过无菌水冲洗后，可有效去除种子表面的微生物及杂质。

作为本发明优选的技术方案，所述步骤3)中摇床的振荡频率为180-200r/min。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种组培大豆种子的消毒方法，利用浓度为13-17％的过氧化氢对种子进行消毒，节省了消毒的时间，减小了消毒剂对环境的污染，促进了种子的萌发，降低了种子在组培过程中受污染的几率。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明邯豆5号大豆种子经实施例3的处理方法处理后得到的无菌苗的示意图；

图2附图为本发明晋豆19号大豆种子经实施例3的处理方法处理后得到的无菌苗的示意图；

图3附图为本发明晋豆37号大豆种子经实施例3的处理方法处理后得到的无菌苗的示意图；

图4附图为本发明中黄13号大豆种子经实施例3的处理方法处理后得到的无菌苗的示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种组培大豆种子的消毒方法，包括下述步骤：

1)选取长势一致、表面干净的大豆种子，用无菌水浸泡5min，捞出、在无菌水下冲洗1min，备用；

2)将所述步骤1)得到的大豆种子置于75％酒精中浸泡2min；

3)将所述步骤2)中得到的大豆种子置于装有13％的H₂O₂溶液的容器中浸泡2h，期间，将盛有大豆种子和H₂O₂溶液的容器置于摇床上在180r/min下连续振荡；

4)将所述步骤3)中的大豆种子用无菌水清洗3次，然后在无菌水中浸泡18h，得到消毒的大豆种子。

实施例2

1)选取长势一致、表面干净的大豆种子，用无菌水浸泡2min，捞出、在无菌水下冲洗3min，备用；

2)将所述步骤1)得到的大豆种子置于75％酒精中浸泡1min；

3)将所述步骤2)中得到的大豆种子置于装有17％的H₂O₂溶液的容器中浸泡0.5h，期间，将盛有大豆种子和H₂O₂溶液的容器置于摇床上在190r/min下连续振荡；

4)将所述步骤3)中的大豆种子用无菌水清洗4次，然后在无菌水中浸泡16h，得到消毒的大豆种子.

实施例3

1)选取长势一致、表面干净的大豆种子，用无菌水浸泡3min，捞出、在无菌水下冲洗2min，备用；

2)将所述步骤1)得到的大豆种子置于75％酒精中浸泡1.5min；

3)将所述步骤2)中得到的大豆种子置于装有15％的H₂O₂溶液的容器中浸泡1h，期间，将盛有大豆种子和H₂O₂溶液的容器置于摇床上在200r/min下连续振荡；

4)将所述步骤3)中的大豆种子用无菌水清洗4次，然后在无菌水中浸泡17h，得到消毒的大豆种子。以邯豆5号、晋豆19号、晋豆37号及中黄13号四个品种的大豆种子按照本实施例的方式进行处理，每个阶段的大豆萌发情况见附图1-4。

实施例4

1)选取长势一致、表面干净的大豆种子，用无菌水浸泡3min，捞出、在无菌水下冲洗2min，备用；

2)将所述步骤1)得到的大豆种子置于75％酒精中浸泡1.5min；

3)将所述步骤2)中得到的大豆种子置于装有15％的H₂O₂溶液的容器中浸泡0.5h，期间，将盛有大豆种子和H₂O₂溶液的容器置于摇床上在200r/min下连续振荡；

4)将所述步骤3)中的大豆种子用无菌水清洗4次，然后在无菌水中浸泡17h，得到消毒的大豆种子。

实施例5

1)选取长势一致、表面干净的大豆种子，用无菌水浸泡3min，捞出、在无菌水下冲洗2min，备用；

2)将所述步骤1)得到的大豆种子置于75％酒精中浸泡1.5min；

3)将所述步骤2)中得到的大豆种子置于装有15％的H₂O₂溶液的容器中浸泡2h，期间，将盛有大豆种子和H₂O₂溶液的容器置于摇床上在200r/min下连续振荡；

4)将所述步骤3)中的大豆种子用无菌水清洗4次，然后在无菌水中浸泡17h，得到消毒的大豆种子。

萌发试验：选用邯豆5号、晋豆19号、晋豆37号及中黄13号四个大豆品种，其中邯豆5号、晋豆19号和晋豆37号由山西省农业科学院小麦研究所提供，中黄13号购自运城市圣丰种业，均按照实施例1-5中的处理方进行试验，各获得消毒的大豆种子300粒，去皮，分别接种在相同的萌发培养基中培养，萌发培养基的组成为MSB5+2mg/L6-BA+2％蔗糖+0.6％琼脂，PH＝5.8，每组萌发试验重复3次，统计种子萌发四天后的无菌苗数目和受污染数目的平均值。结果见表一；

表一

由表一可知：随着15％H₂O₂消毒时间的延长，萌发的大豆数目越多，在灭菌1小时时全部萌发，达到最大值；随着时间的再次延长，萌发受到抑制，大豆萌发的数目减少。

实施例6

设置12个对比例，每个对比例重复3次，分别为：选用邯豆5号、晋豆19号、晋豆37号及中黄13号四个大豆品种各300粒，分别按照实施例3中步骤1)、步骤2)及步骤4)的处理方式进行，且每个大豆品种设置三种消毒方式：30％的H₂O₂消毒0.5h、30％的H₂O₂消毒1h、30％的H₂O₂消毒2h，将得到的消毒的大豆种子接种到实施例5中的萌发培养基中，观察大豆种子萌发四天后，无菌苗的数目和受污染数目。结果见表二；

表二

由表二可知：浓度为30％H₂O₂随着灭菌时间的延长，大豆种子萌发抑制程度加深，当灭菌2小时后，将近20％左右的大豆种子受到抑制未萌发。

综上所述，选取15％H₂O₂灭菌1小时最为合适，能够保证大豆种子完全萌发。15％和30％H₂O₂各灭菌30min均有污染，且15％H₂O₂灭菌30min污染最多，其他处理均没有污染。

实施例7

设置32个对比例，每个对比例重复3次，分别为：选用邯豆5号、晋豆19号、晋豆37号及中黄13号四个大豆品种各300粒，分别按照实施例3中步骤1)、步骤2)及步骤4)的处理方式进行，将步骤3)中的消毒方式换为：每个大豆品种设置8种消毒方式分别为0.1％升汞浸泡0.5h、0.1％升汞浸泡1h、0.1％升汞浸泡2h、0.1％升汞浸泡3h、5％的次氯酸钠浸泡0.5h、5％的次氯酸钠浸泡1h、5％的次氯酸钠浸泡2h及5％的次氯酸钠浸泡3h，将得到的消毒的大豆种子接种到实施例5中的萌发培养基中，观察种子萌发四天后，无菌苗的数目和受污染数目。结果见表三；

表三

由表三可知：随着生汞和5％次氯酸钠消毒时间的增加，污染的种子越来越少，但是萌发数目越来越受抑制，在此试验品种中均没有达到完全消毒的目的。虽然之前的研究表明，这两种方法可以作为消毒大豆的主要方式。但是由于大豆的种源特性、贮藏条件等不同，表面所受的污染程度也不同。

综合表一、表二及表三，可以得出：

15％H₂O₂灭菌1h可以作为本发明大豆品种的消毒方式，较低浓度15％过氧化氢不仅能够促进萌发，还能节省时间和试剂，相对来说比较环保，是一种高效、省时、环保的消毒方式。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (3)

1.一种组培大豆种子的消毒方法，其特征在于，包括下述步骤：

1)选取长势一致、表面干净的大豆种子，用无菌水浸泡2-5min，捞出、清洗，备用；

2)将所述步骤1)得到的大豆种子置于75％酒精中浸泡1-2min；

3)将所述步骤2)中得到的大豆种子置于装有13％-17％的H₂O₂溶液的容器中浸泡0.5-2h，期间，将盛有大豆种子和H₂O₂溶液的容器置于摇床上连续振荡；

4)将所述步骤3)中的大豆种子用无菌水清洗3-4次，然后在无菌水中浸泡16-18h，得到消毒的大豆种子。

2.根据权利要求1所述的一种组培大豆种子的消毒方法，其特征在于，所述步骤1)中清洗的过程为：将用无菌水浸泡的大豆种子在无菌水下冲洗1-3min。

3.根据权利要求1所述的一种组培大豆种子的消毒方法，其特征在于，所述步骤3)中摇床的振荡频率为：180-200r/min。