CN106718854A - 一种筛选独角金内酯不敏感突变体的方法 - Google Patents

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张丰琪
马霓
张春雷
胡超
万林
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Abstract

本发明公开了一种筛选独角金内酯不敏感突变体的方法，步骤是：（1）处理野生型拟南芥种子：A、称取种子，用蒸馏水冲洗；B、加入甲基磺酸乙酯，在通风厨中混匀；C、将处理后的甲基磺酸乙酯倒入氢氧化钠中，再清洗种子；D、清洗后的种子放入琼脂溶液中，用移液枪移入土壤中生长；（2）独角金内酯不敏感突变体的筛选：A、种子成熟后收获，取种子放入离心管中，用漂白剂溶液消毒后放进冰箱；B、用移液枪将种子播种于含有独角金内酯的AT培养基上；C、播种后的培养皿照光，放在黑暗条件下生长；D、选取长根系拟南芥突变体单株，将拟南芥单株移栽至土壤中。操作简便，筛选周期短，能快速高效地筛选出对独角金内酯不敏感的拟南芥突变体。

Description

一种筛选独角金内酯不敏感突变体的方法
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，更具体涉及一种筛选独角金内酯不敏感突变体的方法，用甲基磺酸乙酯对野生型拟南芥种子进行处理，后代种子用一定浓度独角内酯为选择压，筛选根系长度不敏感的突变体。该发明为植物激素敏感差异材料的筛选提供了技术参考。
背景技术
EMS是甲基磺酸乙酯，属于烷化剂诱变最常用的一种，诱变率很高。99％以上的突变都是碱基C至T的突变，所以导致CG配对变为TA配对。EMS突变材料可用于正向遗传学及反向遗传学研究。突变的频率取决于基因在基因组的位置及处理条件。目前已通过该诱变方法筛选出油菜C18不饱和脂肪酸突变体(Lee et al.,2014)，黄瓜突变体(Wang et al.,2014)等，但高浓度(0.9％)EMS会显著降低大豆突变体的筛选率(Koornneef et al.,1982)。
植物激素对植株生长发育、器官建成、产量形成等具有重要的作用(Ghanem etal.,2011)。独角金内酯(strigolactones,SLs)是一种产生于植物根部的类胡萝卜素衍生物,具有刺激寄生植物种子萌发和促进丛枝菌根真菌菌丝分枝的作用(Xie et al.,2010；Foo and Reid,2013)。科学家通过对拟南芥和水稻等模式植物的研究，发现独角金内酯通过抑制侧芽的生长在株型建成中发挥关键调控作用(Gemez-Roldan et al.,2008；Elizabeth et al.,2009；Jiao et al.,2010)，独角金内酯也调控根系发育和构型(Kapulnik et al.,2014)，通过信号转导协调地上和地下部植株生长(Koltai 2011；Koltai and Beveridge,2013),增加植株对逆境胁迫的抗性(Ha et al.,2014)。
虽然独角金内酯是目前研究的热点，但存在两个问题：其一，相对于生长素、赤霉素、脱落酸、细胞分裂素、乙烯利5大类激素，对独角金内酯的研究是近年来的研究热点，主要是缺乏突变体材料；其二，经文献查询，国内外尚没有和本技术专利相似的专利技术或非专利文献公开或使用，也就是缺乏创造突变体的技术。本团队成员经过2年的研究，优化了独角金内酯突变体的筛选方法，从而为后续遗传学、生理学、分子生物学研究提供了材料基础。所以，该技术具有独创性，先进性，不仅能筛选出拟南芥突变体材料，而且对作物突变体的筛选方法提供了借鉴。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种筛选独角金内酯不敏感突变体的方法，包括有效筛选独角金内酯不敏感突变体所需要的遗传变异材料的制备、试剂的准备、植株形态指标，处理条件等的问题。该方法操作简便，筛选周期短，能快速高效地筛选出对独角金内酯不敏感的拟南芥突变体。此外，也为筛选其它植物激素敏感或不敏感突变体提供了技术参考。
为了实现上述的目的，本发明通过以下技术方案来实现：
其技术构思是：具体操作分三步，即基础材料的制备(野生型种子用EMS处理)，突变体的筛选、突变体的验证。每一过程都有清楚详细的步骤，提高了筛选效率和成功率。
一种筛选独角金内酯不敏感突变体的方法，其步骤是：
(1)EMS处理野生型拟南芥种子：
A、称取1年以内收获的拟南芥种子0.2g,用0.1％(重量比)吐温15(Tween15)处理14－16分钟，再用蒸馏水(dH2O)冲洗至无气泡为止；
B、加入15－45mL甲基磺酸乙酯(EMS)(0.1％－0.3％)，在通风厨中充分混匀8－16小时；
C、将处理后的甲基磺酸乙酯(EMS)倒入新配制的0.5M氢氧化钠(NaOH)中过夜后倒掉，再将种子放入50mL蒸馏水(dH2O)中清洗2－4小时；
D、清洗后的种子放入100mL 0.08－0.12％(重量比)琼脂(Agar)溶液中，用移液枪移入土壤中生长；
(2)独角金内酯不敏感突变体的筛选：
A、种子成熟后收获，7－10天后取0.2g种子放入50mL大离心管中，准备数管，分别用50％(体积比)漂白剂溶液消毒后放进4℃冰箱，同时准备pH为5.8－6.2的AT培养基(请见表1AT培养基配比)，培养基中放入配制好的独角金内酯至终浓度40μM，取直径为12厘米的培养皿数个，每个培养皿中倒入50mL；
B、72小时后用移液枪将种子播种于含有独角金内酯的AT培养基上(请见表1AT培养基配比)，每管播种到一个培养皿中，轻轻摇动使种子均匀分布于表面；
C、播种后的培养皿照光1－2小时，放在21－23℃黑暗条件下生长70－74小时；
D、观察根系长度，发芽后每天可连续观察，6－8天选取长根系拟南芥突变体单株(长度与未激素处理时的野生型相当)，均能反复得到拟南芥突变体单株，然后将拟南芥单株移栽至土壤中。
(3)独角金内酯不敏感突变体的验证：
种子成熟后收获，7－10天后取30粒左右种子按同样的方法在放有独角金内酯的AT培养基中筛选，以野生型植株和未添加独角金内酯的处理为对照，根系长度与未激素处理时野生型相当的植株为候选目标植株。该方法为筛选独角金内酯不敏感拟南芥突变体提供了可能，均能反复得到拟南芥突变体单株，并为作物突变体的选育提供了技术参考。
所述的独脚金内酯(strigolactone,SL)最初是从棉花中分离鉴定出的独脚金(Striga spp.)种子萌发的信号物质。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
(1)本发明中的EMS种子处理、突变体的筛选、突变体进一步验证等方法是本人及研究团队近年来的研究结果，种子量、试剂用量及处理时间都是经反复试验、优化形成，具有独创新、实用性等特点。
(2)本发明中的独角金内酯为近年来的研究热点，在本发明中独角金内酯具有抑制根系生长的特点，分析了该植物激素对植物表型变化的影响，可以利用该材料进行后续遗传学及分子生物学研究，以发展植物激素领域理论研究成果。
(3)众所周知，突变体对理论研究具有重要的意义，获得突变体有一定的难度，本发明不仅提供了一种筛选独角金内酯突变体的方法，该方法针对于根系长度这一性状，能有效获得不同于MAX2分枝性状突变体，丰富了突变体类型，通过该方法能反复获得独角金内酯突变体。
(4)本发明不仅有助于筛选拟南芥突变体，而且对其他作物突变体的筛选提供了借鉴。筛选出的材料不仅可用于研究独角金内酯信号传导，而且为研究不同植物激素间的互作提供了材料基础。
附图说明
图1为一种独角金内酯不敏感突变体筛选示意图。
野生型拟南芥种子经EMS诱变后播种于含有40μM独角金内酯的大培养皿中，在黑暗条件下发芽3天后每天连续观察，选择长根系突变体植株。
图2为一种独角金内酯不敏感突变体验证示意图。
在初步筛选到独角金内酯不敏感突变体以后，收获其种子，种子分别在未添加独角金内酯和40μM独角金内酯条件下生长，待种子发芽7天后，植株分别平铺在AT培养基上，用Imagej软件扫描，比较根系长度，长度无显著差异表明该材料为独角金内酯不敏感突变体。在未填加独角金内酯条件下生长的植株(上)，在40μM独角金内酯条件下生长的植株(下)。
具体实施方式
本发明所用独角金内酯为GR24，是一种以在独脚金内酯Strigol为框架的基础上人工合成的化学物质，独脚金内酯类似物中最有效的一个产品。本发明首先利用EMS处理野生型拟南芥种子，以获得广泛的遗传变异，然后利用GR24抑制根系生长的特性，让诱变后的种子在高浓度选择压力下生长，与野生型植株比较根系的长度，长根系的植株为待定突变体，突变体植株收获种子再在选择压力下重复筛选一次，表型依然为长根系的植株则可能为目标突变体。
实施例1：
一种筛选独角金内酯不敏感突变体的方法，其步骤是：
(1)EMS处理野生型拟南芥种子：
A、选择在一年内收获的拟南芥种子，称取0.2g，放入50mL离心管中，用0.1％(重量比)Tween 15混合均匀(0.1g吐温15放入100mL蒸馏水中)，处理15分钟后用蒸馏水冲洗至无气泡为止；
B、加入15－45mL EMS(0.1％或0.2％或0.3％)，通常用0.2％(重量比)，必须在通风厨中操作，充分摇匀、混匀8或10或12或14或16小时；
C、将处理后的EMS倒入新配制的0.5M氢氧化钠(NaOH)中过夜后倒掉，种子放入50mL蒸馏水中混合摇匀清洗2或3或4小时；
D、漂洗后的种子移入100mL 0.1％(重量比)琼脂(Agar)中，用移液枪移入土壤中生长，每小钵(面积100cm2)1mL；
(2)独角金内酯不敏感突变体的筛选(图1)：
A、种子成熟后收获，7或8或9或10天后取0.2g种子放入50mL大离心管中，用50％(体积比)消毒液(含8.3％次氯酸钠)混合摇匀，消毒10分钟，再用蒸馏水混合摇匀清洗5或6次。消毒后放进4℃冰箱，同时配制pH为6.0的AT培养基(请见表1AT培养基配比)。因为GR24抑制根系生长，并且随浓度增加根系长度降低，培养基中入事先用DMSO溶解配制好的GR24至终浓度40μM(该浓度的选择依据独角金内酯对根系长度的抑制效果见表2)，每个培养皿中倒入50mL；
B、72小时后将种子溶于约7mL含有同样浓度GR24的AT培养基中，轻轻摇动使种子均匀分布在上述培养基表面；
C、播种后照光1或2小时后，用锡纸包裹培养皿，放在22℃黑暗条件下生长72小时；
D、用显微镜观察根系长度，可连续观察7天，每天将选择出的长根系拟南芥突变体单株，(长度与未激素处理时的野生型相当)移入到含有独角金内酯的AT培养基中单独继续生长，第7天再将所有植株移栽至土壤中，均能反复得到拟南芥突变体单株，然后将拟南芥单株移栽至土壤中，分单株移栽。
(3)独角金内酯不敏感突变体的验证：
种子成熟后收获，7或8或9或10天后取30粒左右种子按同样的方法在放有独角金内酯的培养基中筛选，以野生型和未添加独角金内酯的处理为对照，根系长度与未激素处理时的野生型相当的植株，均能反复得到拟南芥突变体单株(图2)。
表1AT培养基配方(1L)
成份 含量(g)
MS(Murashige and Skoog)粉末 4.3
蔗糖 10
琼脂粉 8
加蒸馏水至终浓度1L，pH调整至6.0，121℃消毒灭菌30分钟
表2不同浓度GR24浓度对拟南芥根系生长的影响(单位mm)
说明：研究了不同独角金内酯浓度下野生型拟南芥种子(Col)、转GUS基因的野生型种子(Col DRS:GUS)、生长素突变体(wei8-1)、乙烯利突变体(ein2-5DRS:GUS)根系的生长情况。发现随着浓度增高，根系长度下降，40μM时根系长度显著低于对照，以此作为不敏感突变体筛选的浓度。

Claims (2)

1.一种筛选独角金内酯不敏感突变体的方法，其步骤是：
(1)EMS处理野生型拟南芥种子：
A.称取1年以内收获的拟南芥种子0.2g，用0.1％重量比吐温15处理14－16分钟，再用蒸馏水冲洗至无气泡为止；
B.加入15－45mL甲基磺酸乙酯，在通风厨中充分混匀8－16小时；
C.将处理后的甲基磺酸乙酯倒入新配制的0.5M氢氧化钠中过夜后倒掉，再将种子放入50mL蒸馏水中清洗2－4小时；
D.清洗后的种子放入100mL 0.08－0.12％重量比琼脂溶液中，用移液枪移入土壤中生长；
(2)独角金内酯不敏感突变体的筛选：
A.种子成熟后收获，7－10天后取0.2g种子放入50mL大离心管中，用50％体积比漂白剂溶液消毒后放进4℃冰箱，同时准备pH为5.8－6.2的AT培养基，培养基中放入配制的独角金内酯至终浓度40μM，每个培养皿中倒入50mL；
B.72小时后用移液枪将种子播种于含有独角金内酯的AT培养基上，摇动使种子均匀分布；
C.播种后的培养皿照光1－2小时，放在21－23℃黑暗条件下生长70－74小时；
D.观察根系长度，发芽后每天连续观察，6－8天选取长根系拟南芥突变体单株，将拟南芥单株移栽至土壤中。
2.根据权利要求1所述的一种筛选独角金内酯不敏感突变体的方法，其特征在于：所述的AT培养基配方：
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CN108912074A (zh) * 2018-06-15 2018-11-30 清华大学 一种高活性的独脚金内酯衍生物及其制备与应用

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