CN104094841B - 茄科枸杞属短柄枸杞组织培养及快速繁殖方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种茄科枸杞属短柄枸杞组织培养及快速繁殖方法，以解决引进枸杞的繁殖问题。该方法包括如下步骤：外殖体处理、初代培养、继代培养、生根培养、炼苗以及移栽，发明的优点如下：A、本发明中对茄科枸杞属短柄枸杞（Lycium？brevipes）进行继代培养时，仅使用了6-苄氨基腺嘌呤与吲哚-3-乙酸配比，极大地降低了激素积累对多次继代的影响，同时也降低了成本。B、本发明以1:1的泥炭与蛭石作为炼苗移栽基质，配比简单，基质质量轻，在移栽试验中表现良好，有较高的移栽成活率。C、本发明为后期对本土枸杞的改良以及应用起到了巨大的作用。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养领域，具体涉及茄科枸杞属短柄枸杞（Lyciumbrevipes）组织培养及快速繁殖方法。
背景技术
茄科枸杞属短柄枸杞（Lyciumbrevipes）是从美国引进的茄科枸杞属植物，主要分布在墨西哥西部和加利福利亚的索诺兰沙漠等地区，它主要产在沙漠和海岸地带，在美国西北部也用作绿化；其进化程度高于我国的枸杞，在生殖进化上，已经由雌雄同体和自交不亲和的二倍体进化到自交亲和的多倍体阶段，而我国仍处在自交不亲和的二倍体进化阶段。该种枸杞的引进对于我国枸杞的种质资源的改良有很大的意义。该种枸杞引进后面临的首要问题是进行扩大繁殖。
发明内容
本发明的目的是提供一种茄科枸杞属短柄枸杞组织培养及快速繁殖方法，以解决引进枸杞的繁殖问题。
本发明技术方案如下：本发明种子为茄科枸杞属短柄枸杞（Lyciumbrevipes）购于美国的S&SSEEDS,INC.联系方式为P.O.BOX1275CARPINTERIAAVECARPINTERIA,CA93013,USA。
一种茄科枸杞属短柄枸杞（Lyciumbrevipes）组织培养方法，具体步骤如下：
A、外殖体处理采用茄科枸杞属短柄枸杞（Lyciumbrevipes）幼嫩茎段作为外殖体，剪去叶片，留少量叶柄，每2-3个芽剪成一段，将茎段洗去污渍，后用水冲洗干净，冲洗时间为5-10min，然后将其放入超净工作台中,进行消毒，消毒后剪去茎段两端，放于培养皿中备用；
优选的，消毒的最佳方案如下：先用75%酒精振荡消毒5s，再用0.1%升汞溶液消毒6分钟—6分10秒，最后用无菌水清洗3-4次；
B、初代培养
以MS培养基为基础培养基，添加不同类型的激素及数量进行初代培养。通过初代培养可以获得所繁育物种的无菌材料。这一阶段的培养效果依植物种类及培养基成分而异，可能形成一个芽或多个芽。
优选的，添加0.05mg/L的萘乙酸（NAA）、3%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8。培养条件为光强为3000lx全光照24h，温度为：22℃，湿度为70%RH。
C、继代培养
在初代培养的基础上获得的芽苗数量不多，还需进一步扩大繁殖，才能发挥组织培养快速繁殖的优势。
通过对L.brevipes的最佳培养基的筛选，培养材料为初代培养获得的单苗或丛芽，以MS为基本培养基，添加6-苄氨基腺嘌呤与吲哚-3-乙酸。
优选的，继代培养基主要成分以及培养条件如下：以MS培养基为基础培养基，添加0.05mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.05mg/L的吲哚-3-乙酸、1.5%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8。培养条件为光强为3000lx全光照24h，温度为22℃，湿度为70%RH。增殖系数最高，生长最旺盛。
D、生根培养
继代培养扩大繁殖后进行生根诱导获得完整再生的植株。
生根培养以1/2的MS为基本培养基，加入不同浓度的IAA。
优选的，生根培养基主要成分以及培养条件：以1/2的MS培养基为基础培养基，添加0.05mg/L的IAA、1.5%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8。培养条件为光强为3000lx下12h光暗交替，温度为22℃，湿度为70%RH。
E、炼苗以及移栽
炼苗：将生根的组培苗从培养室中取出，到与移栽条件相同的环境中闭瓶炼苗5-7天，
移栽：在移栽前对基质进行高温灭菌。移栽时将炼好苗的植株完整的取出，放入水中洗净根上的培养基，将苗子移栽到装有基质的花盆中，浇透水后，覆膜。
优选的，最适宜的炼苗移栽基质以1:1的泥炭与蛭石的混合物，移栽前对基质用0.1%多菌灵浇透，移栽时将炼好苗的植株的根部浸入0.1%多菌灵和0.1g/LNAA的混合溶液中浸泡10min。
优选的，枸杞组培苗移栽初期，由于苗木幼嫩，必须设置遮阳网，光强度为全光照时的30%。前两日遮光密封保湿培养。第三日开始每日通风，通风时间逐日加长，同时逐渐增加光强，直到全天开放。适时浇水，隔日喷少量0.1%多菌灵溶液，7天后喷1/4MS营养液。待幼苗成活后逐渐全光照。
发明的优点如下：
A、本发明中对茄科枸杞属短柄枸杞（Lyciumbrevipes）进行继代培养时，仅使用了6-苄氨基腺嘌呤（6-BA）与吲哚-3-乙酸（IAA）配比，极大地降低了激素积累对多次继代的影响，同时也降低了成本。
B、本发明以1:1的泥炭与蛭石作为炼苗移栽基质，配比简单，基质质量轻，在移栽试验中表现良好，有较高的移栽成活率。
C、本发明为后期对本土枸杞的改良以及应用起到了巨大的作用。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的具体实施过程，但不以任何方式限制本发明。
实施例1
A、外殖体处理
采集茄科枸杞属短柄枸杞（Lyciumbrevipes）幼嫩茎段作为外殖体，剪去叶片，留少量叶柄，每2-3个芽剪成一段，将茎段用洗衣粉水洗去污渍，后用自来水冲洗干净，冲洗时间为5-10min。然后将其放入超净工作台中,进行消毒，消毒后剪去茎段两端，放于培养皿中备用。
B、初代培养
每次处理接种30瓶，外殖体接种后每隔7天记录一次生长状况。
以MS培养基为基础培养基，添加0.05mg/L的NAA、3%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8。培养条件为光强为3000lx全光照24h，温度为22℃，湿度为70%RH。不定芽生长的比例达到86.7%。
C、继代培养
培养材料为初代培养获得的单苗或丛芽，以MS培养基为基础培养基，添加0.05mg/L的6-BA、0.05mg/L的吲哚-3-乙酸（IAA）、1.5%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8。培养条件为光强为3000lx，24h全光照，温度为22℃，湿度为70%RH。此条件增殖系数最高，生长最旺盛。每次处理接种30瓶，每7天观察并记录幼苗的增殖效果。
D、生根培养
生根培养基主要成分以及培养条件：以1/2MS培养基为基础培养基，添加0.05mg/L的IAA、1.5%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8。培养条件为光强为3000lx下12h光暗交替，温度为22℃，湿度为70%RH。
E、炼苗以及移栽
炼苗：将生根的组培苗从培养室中取出，到与移栽条件相同的环境中闭瓶炼苗5-7天，让组培苗逐渐适应外界条件。
实施例2
对实施例1炼苗后的产品进行移栽：最适宜的炼苗移栽基质以1:1的泥炭与蛭石混合配制效果最佳，移栽前对基质进行高温灭菌。冷却后装盆，准备移栽，移栽前对基质用0.1%多菌灵浇透，移栽时将炼好苗的植株完整的从锥形瓶中取出，放入水中洗净根上的培养基，将根部浸入0.1%多菌灵和0.1g/LNAA的混合溶液中浸泡10min。将苗子移栽到装有基质的花盆中，浇透水后，覆膜。
枸杞组培苗移栽初期，由于苗木幼嫩，必须设置遮阳网，光强度为全光照时的30%左右。
前两日遮光密封保湿培养。第三日开始每日通风，通风时间逐日加长，同时逐渐增加光强，直到全天开放。适时浇水，隔日喷少量0.1%多菌灵溶液，7天后喷1/4的MS营养液，待幼苗成活后逐渐全光照。15d后统计成活率，移栽成活率在85%以上。
实施例3与实施例1不同之处在于，步骤A消毒的具体方案如下：先用75%酒精振荡消毒5s，再用0.1%升汞溶液消毒6min，最后用无菌水清洗3-4次。
实施例4与实施例1不同之处在于，步骤A消毒的具体方案如下：先用75%酒精振荡消毒5s，再用0.1%升汞溶液消毒6min10s，最后用无菌水清洗3-4次。该方案效果最佳，正常生长的比例可达85%。
试验
试验一、考察用0.1%升汞消毒为6min，并且用75%酒精消毒，看消毒时间对初代培养生长的影响：
将准备好的材料先用75%酒精分别消毒4s、5s、6s、7s、8s；再用0.1%升汞溶液消毒6min，后用无菌水冲洗3-4遍。再剪去嫩茎两端接种，每瓶接种1个，每处理接种30瓶。接入培养基中，统计污染、干枯和正常生长的个数，结果见表1。
由表1可以得出，当0.1%升汞溶液消毒6min并且用75%的酒精消毒5s较好，萌发率达50%。
试验二、考察用75%酒精消毒5s并用0.1%升汞的不同消毒时间看对初代培养生长情况的影响
将准备好的材料，先用75%酒精消毒5s；再用0.1%升汞溶液消毒不同时间，后用无菌水冲洗3-4遍。再剪去嫩茎两端接种，每瓶接种1个，每处理接种20瓶。接入培养基中，统计污染、干枯和正常生长的个数，结果见表2。
由表2可以得出，当用0.1%升汞溶液消毒6min10s并且用75%的酒精消毒5s最好，萌发率达85%。
试验三、考察培养基激素及配比对L.brevipes不定芽增殖情况的影响（见表3）
通过表3说明如下：
1.通过不同配比的初代培养基的比较，在添加0.1mg/L的IAA（吲哚乙酸）培养基中容易形成愈伤组织，但是也能诱导产生一定数量的不定芽，产生的数量明显低于无激素或低激素水平，且差异显著；
2.在0.05mg/L的NAA的培养基中发生分化率较高，不定芽的发生数量最多，与无激素和0.1mg/L的IAA相比达到极显著水平；
3.用0.1mg/L的NAA或者用0.05mg/L的NAA加0.05mg/L的6-BA差异不显著。
本实验表明初代培养不定芽增殖最佳培养基为MS添加0.05mg/L的NAA。
试验四、以1/2的MS为基本培养基，加入不同浓度IAA对生根率的影响
生根培养基主要成分以及培养条件：以1/2MS培养基为基础培养基，添加IAA、1.5%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8。培养条件为光强为3000lx下12h光暗交替，温度为22℃，湿度为70%RH。
以继代培养后的无菌茎段为材料，添加不同种类及浓度生根激素进行生根培养，生根培养每次处理接种25瓶，经常观察并记录产生15d后生根瓶数，统计见表4。
由表4可以得出，在添加0.05mg/L的IAA的情况下，生根率最高，达到88%（每次处理接种25瓶，4次处理则生根瓶数为88瓶），须根数量最多，根系状态最适宜移栽。
Claims (5)
1.一种茄科枸杞属短柄枸杞组织培养及快速繁殖方法，其特征在于该方法包括如下步骤：
A、外殖体处理采用茄科枸杞属短柄枸杞（Lyciumbrevipes）幼嫩茎段作为外殖体，剪去叶片，留少量叶柄，每2-3个芽剪成一段，将茎段洗去污渍，后用水冲洗干净，冲洗时间为5-10min，然后将其放入超净工作台中,进行消毒，消毒后剪去茎段两端，放于培养皿中备用；
B、初代培养
以MS培养基为基础培养基进行初代培养；
C、继代培养
培养材料为初代培养获得的单苗或丛芽，以MS为基本培养基，添加6-苄氨基腺嘌呤与吲哚-3-乙酸；
D、生根培养
生根培养以1/2的MS为基本培养基；
E、炼苗以及移栽
炼苗：将生根的组培苗从培养室中取出，到与移栽条件相同的环境中闭瓶炼苗5-7天；
移栽：移栽时将炼好苗的植株完整的取出，放入水中洗净根上的培养基，将苗子移栽到装有基质的花盆中，浇透水后，覆膜；
所述步骤B的培养过程为以MS培养基为基础培养基，添加0.05mg/L的萘乙酸、3%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8，培养条件为光强为3000lx全光照24h，温度为：22℃，湿度为70%RH；
所述步骤C继代培养如下：以MS培养基为基础培养基，添加0.05mg/L的6-苄氨基腺嘌呤、0.05mg/L的吲哚-3-乙酸、1.5%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8；培养条件为光强为3000lx全光照24h，温度为22℃，湿度为70%RH；
所述步骤D培养：以1/2的MS培养基为基础培养基，添加0.05mg/L的吲哚-3-乙酸、1.5%蔗糖和4g琼脂，使用NaOH或HCl将培养基pH值调至5.8；培养条件为光强为3000lx下12h光暗交替，温度为22℃，湿度为70%RH。
2.根据权利要求1所述的茄科枸杞属短柄枸杞组织培养及快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤A消毒方案如下：先用75%酒精振荡消毒5s，再用0.1%升汞溶液消毒6分钟—6分10秒，最后用无菌水清洗3-4次。
3.根据权利要求1所述的茄科枸杞属短柄枸杞组织培养及快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤E中炼苗移栽基质为1:1的泥炭与蛭石的混合物，移栽前对基质用0.1%多菌灵浇透，移栽时将炼好苗的植株的根部浸入0.1%多菌灵和0.1g/L的NAA混合溶液中浸泡10min。
4.根据权利要求3所述的茄科枸杞属短柄枸杞组织培养及快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤E中组培苗移栽初期，设置遮阳网，光强度为全光照时的30%。
5.根据权利要求4所述的茄科枸杞属短柄枸杞组织培养及快速繁殖方法，其特征在于：所述步骤E移栽前两日遮光密封保湿培养，第三日开始每日通风，通风时间逐日加长，同时逐渐增加光强，直到全天开放；适时浇水，隔日喷少量0.1%多菌灵溶液，7天后喷1/4的MS营养液，待幼苗成活后逐渐全光照。
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