CN105918121B - 一种利用走马胎叶片快速繁殖种苗的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属植物栽培技术领域，涉及一种利用走马胎叶片快速繁殖种苗的方法，包括叶片诱导分化不定芽、不定芽继代增殖、壮苗、生根诱导、移栽和管理过程。本发明工艺流程简单，以走马胎叶片为外植体进行组织培养，可以在短时间获得大量可用于生产栽培的种苗，且获得的种苗生理年龄一致，生长整齐，适合工厂化育苗和规模化栽培，为走马胎人工种植产业的发展提供技术支持。

Description

一种利用走马胎叶片快速繁殖种苗的方法

技术领域

本发明属植物栽培技术领域，涉及一种走马胎种苗的繁殖方法，具体是一种利用走马胎叶片直接诱导分化不定芽，通过不定芽继代增殖、壮苗、生根诱导、移栽等过程，获得大量种苗的繁殖方法。

背景技术

走马胎(Ardisia gigantifolia stapf.)又名大叶紫金牛，为紫金牛科(Myrsinaceae)紫金牛属(Ardisia)植物。常绿、直立灌木，分布于我国云南、江西、福建、广东、广西等省(区)。多生于海拔1300m以下的山谷、溪旁的疏、密林下潮湿处。走马胎的根茎及全株具有祛风湿壮筋骨、活血化瘀、消肿止痛、止血生肌等功效，可治疗类风湿关节炎，筋骨疼痛、跌打损伤、产后瘀血、半身不遂等。作为一种民间常用中草药，随着近年来需求量的与日俱增，走马胎野生资源已日趋枯竭，有些分布点已经很难见到走马胎的踪影。为满足市场需求，人工种植势在必行，批量种苗繁殖已成为亟待解决的问题。

在自然条件下，走马胎种苗通常利用种子繁殖，也有采用扦插繁殖的方法。据科研人员多年研究发现，走马胎开花座果率不到5％，且野生资源分散，成熟时间不一致，造成了种子采集困难等问题，而且种子萌芽需要的时间较长，不利于种苗大量快速繁育；扦插繁殖耗费植物材料较多，繁殖效率较低，所以，播种和扦插都不能作为走马胎种苗批量繁殖的方法。

植物组织培养具有原材料需求量少、不受时间和地点限制、繁殖系数高、可保持母本优良性状等特点，在植物种苗繁育上广泛应用。石云平等人采用走马胎种子无菌播种获得无菌植株后，以无菌植株的茎段和芽进行愈伤组织诱导，再通过愈伤组织分化成芽的途径获得不定芽。唐凤鸾等人选取生长饱满的种子，经过特殊处理促进种子的萌发获得幼芽，再切取幼芽胚轴接入不定芽诱导培养基中获得不定芽。虽然石云平、唐凤鸾等人均采用组织培养技术繁育走马胎种苗，利用少量的材料即可生产大量性状一致的种苗，但都存在同样的缺点：(1)都以种子为起始材料，因此取材受季节限制；(2)种子的萌发时间较长，从取材到获得再生植株需要的时间长，使用激素种类较多，步骤比较繁琐。

发明内容

本发明的目的是提供一种利用走马胎叶片快速繁殖种苗的方法，利用走马胎叶片进行组织培养，可以在短时间内生产大量走马胎种苗，所得种苗性状一致，生长整齐，适合工厂化育苗和规模化栽培。

本发明所采用的技术方案：

一种利用走马胎叶片快速繁殖种苗的方法，包括叶片诱导分化不定芽、不定芽继代增殖、壮苗、生根诱导、移栽和管理过程，其步骤如下：

1、叶片诱导分化不定芽及增殖过程

取幼嫩的走马胎叶片，清洗消毒后用无菌纸吸干水分，然后沿与叶脉垂直方向切成0.5～1.0㎝×1.0～2.0㎝的小块接种于诱导培养基上诱导分化不定芽，培养温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1；培养8天后，开始在叶片切口处叶片表面分化不定芽，培养30天后，将分化出不定芽的叶片细切成含有2～4个不定芽的小块后再接种于新鲜诱导培养基进行继代增殖培养，直至形成丛芽。所述诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加6-BA 0.8～2.0mg/L、IBA0.3～1.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8。

2、壮苗培养过程

由于不定芽在继代增殖培养基上继代增殖形成丛芽后，芽苗不易长高。将丛芽切割成小丛后转接到壮苗培养基上进行壮苗培养。所述壮苗培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加6-BA 0.2～0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L、10％椰子水，pH5.8。

3、生根诱导过程

经壮苗培养的不定芽长到2～3cm高时，单株切取，接种于生根培养基上进行生根培养，培养10d后，开始从切口处产生不定根，培养1个月后形成良好根系，获得完整植株。所述生根培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加NAA 0.1～0.5mg/L、IBA0.2～1.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH 5.8。

4、移栽和管理过程

A.移栽：将生根苗连瓶放置在控温大棚中炼苗，一周后将苗移出培养瓶外，洗净小苗根部的培养基，在600倍液的多菌灵溶液中浸泡30s～1min后，移栽到经多菌灵溶液消毒好的栽培基质上；

B.栽培基质配比及处理：分别取草炭土、椰糠和河沙，按体积比计：草炭土：椰糠：河沙＝3～5：2～4：1的比例混匀，用多菌灵溶液淋透后盖上薄膜捂3～5d后揭开，用清水淋透后种苗；

C.管理：移栽7～10d后，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％左右，然后逐渐降低到70％；空气湿度90％以上，然后逐渐降低到60％～70％；遮阴60％～70％，然后逐渐减少到30％；在控温大棚中培育6～8个月，待植株生长至高15～20cm，具有5～6片展开叶片时，可定植到田间；

D.施肥：15～20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾后，并用清水淋洗，每7d施肥1次；

E.病虫害防治：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。

本发明工艺流程简单，以走马胎叶片为外植体直接诱导分化不定芽，不定芽经继代增殖、壮苗、不定芽生根、移栽等过程，可以在短时间获得大量可用于生产栽培的种苗，且获得的种苗生理年龄一致，生长整齐，适合工厂化育苗和规模化栽培，为走马胎人工种植产业的发展提供技术支持。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,或按照制造厂商所建议的条件。

一、走马胎种苗繁殖

实施例一

1、叶片诱导分化不定芽过程

采集幼嫩的走马胎叶片，清洗消毒后用无菌纸吸干水分，然后沿与叶脉垂直方向切成0.5㎝×1.0㎝的小块50块，接种于诱导培养基(MS+6-BA 0.8mg/L+IBA0.3mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上诱导分化不定芽，培养温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1；培养10天左右，开始在叶片切口处叶片表面分化不定芽，培养30天后，每块叶片分化不定芽数为5～20个，将分化出不定芽的叶片细切成含有3个不定芽的小块100块，然后再接种于新鲜诱导培养基进行继代增殖培养，直至形成丛芽。

2、壮苗培养过程

将丛芽切割成小丛后转接到壮苗培养基(MS+6-BA 0.2mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L+10％椰子水上进行壮苗培养，pH值为5.8)上进行壮苗培养。

3、生根诱导过程

经壮苗培养的不定芽长到2～3cm高时，单株切取200株，接种于生根培养基(MS+NAA 0.1mg/L+IBA0.2mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8。)上进行生根培养，培养10d后，开始从切口处产生不定根，培养1个月后形成良好根系，获得完整植株。

4、移栽和管理过程

A.移栽：将150株根系完整的生根苗连瓶放置在控温大棚中炼苗，一周后将苗移出培养瓶外，洗净小苗根部的培养基，在600倍液的多菌灵溶液中浸泡30s～1min后，移栽到经多菌灵溶液消毒好的栽培基质上；

B.栽培基质配比及处理：分别取草炭土、椰糠和河沙，按体积比计：草炭土：椰糠：河沙＝3：2：1的比例混匀，用多菌灵溶液淋透后盖上薄膜捂4d后揭开，用清水淋透后种苗；

C.管理：移栽8d后，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％左右，然后逐渐降低到70％；空气湿度90％以上，然后逐渐降低到60％～70％；遮阴60％～70％，然后逐渐减少到30％；在控温大棚中培育6～8个月，待植株生长至高15～20cm，具有5～6片展开叶片时，可定植到田间；

D.施肥：15～20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾后，并用清水淋洗，每7d施肥1次；

E.病虫害防治：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。

实施例二

1、叶片诱导分化不定芽过程

采集幼嫩的走马胎叶片，清洗消毒后用无菌纸吸干水分，然后沿与叶脉垂直方向切成0.7㎝×1.5㎝的小块50块，接种于诱导培养基(MS+6-BA 1.5mg/L+IBA0.6mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上诱导分化不定芽，培养温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1；培养8天左右，开始在叶片切口处叶片表面分化不定芽，培养30天后，每块叶片分化不定芽数为8～23个，将分化出不定芽的叶片细切成含有2个不定芽的小块100块，然后再接种于新鲜诱导培养基进行继代增殖培养，直至形成丛芽。

2、壮苗培养过程

将丛芽切割成小丛后转接到壮苗培养基(MS+6-BA 0.3mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L+10％椰子水上进行壮苗培养，pH值为5.8)上进行壮苗培养。

3、生根诱导过程

经壮苗培养的不定芽长到2～3cm高时，单株切取200株，接种于生根培养基(MS+NAA 0.3mg/L+IBA0.5mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8。)上进行生根培养，培养10d后，开始从切口处产生不定根，培养1个月后形成良好根系，获得完整植株。

4、移栽和管理过程

A.移栽：将150株根系完整的生根苗连瓶放置在控温大棚中炼苗，一周后将苗移出培养瓶外，洗净小苗根部的培养基，在600倍液的多菌灵溶液中浸泡30s～1min后，移栽到经多菌灵溶液消毒好的栽培基质上；

B.栽培基质配比及处理：分别取草炭土、椰糠和河沙，按体积比计：草炭土：椰糠：河沙＝5：2：1的比例混匀，用多菌灵溶液淋透后盖上薄膜捂4d后揭开，用清水淋透后种苗；

C.管理：移栽9d后，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％左右，然后逐渐降低到70％；空气湿度90％以上，然后逐渐降低到60％～70％；遮阴60％～70％，然后逐渐减少到30％；在控温大棚中培育6～8个月，待植株生长至高15～20cm，具有5～6片展开叶片时，可定植到田间。

D.施肥：15～20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾后，并用清水淋洗，每7d施肥1次；

E.病虫害防治：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。

实施例三

1、叶片诱导分化不定芽过程

采集幼嫩的走马胎叶片，清洗消毒后用无菌纸吸干水分，然后沿与叶脉垂直方向切成0.8㎝×1.8㎝的小块50块，接种于诱导培养基(MS+6-BA 2.0mg/L+IBA 1.0mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上诱导分化不定芽，培养温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1；培养8天左右，开始在叶片切口处叶片表面分化不定芽，培养30天后，每块叶片分化不定芽数为8～25个，将分化出不定芽的叶片细切成含有2个不定芽的小块100块，然后再接种于新鲜诱导培养基进行继代增殖培养，直至形成丛芽。

2、壮苗培养过程

将丛芽切割成小丛后转接到壮苗培养基(MS+6-BA 0.5mg/L+NAA 0.1mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L+10％椰子水上进行壮苗培养，pH值为5.8)上进行壮苗培养。

3、生根诱导过程

经壮苗培养的不定芽长到2～3cm高时，单株切取200株，接种于生根培养基(MS+NAA 0.5mg/L+IBA1.0mg/L+蔗糖30g/L+卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8)上进行生根培养，培养10d后，开始从切口处产生不定根，培养1个月后形成良好根系，获得完整植株。

4、移栽和管理过程

A.移栽：将150株根系完整的生根苗连瓶放置在控温大棚中炼苗，一周后将苗移出培养瓶外，洗净小苗根部的培养基，在600倍液的多菌灵溶液中浸泡30s～1min后，移栽到经多菌灵溶液消毒好的栽培基质上；

B.栽培基质配比及处理：分别取草炭土、椰糠和河沙，按体积比计：草炭土：椰糠：河沙＝5：4：1的比例混匀，用多菌灵溶液淋透后盖上薄膜捂4d后揭开，用清水淋透后种苗；

C.管理：移栽8d后，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％左右，然后逐渐降低到70％；空气湿度90％以上，然后逐渐降低到60％～70％；遮阴60％～70％，然后逐渐减少到30％；在控温大棚中培育6～8个月，待植株生长至高15～20cm，具有5～6片展开叶片时，可定植到田间；

D.施肥：15～20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾后，并用清水淋洗，每7d施肥1次；

E.病虫害防治：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。

二、种苗繁殖效果鉴定

1.走马胎叶片分化效果鉴定

为鉴定走马胎叶片分化及增殖效果，对上述实施例的分化及增殖情况进行观察，统计叶片分化数、增殖数，计算分化率、增值系数，结果见表1。

表1走马胎叶片分化及增殖情况

上述叶片分化及增殖效果表明，本发明以改良的MS培养基进行诱导分化不定芽，分化率可达100％，且后续增殖效果明显，增殖系数达到8.0以上，具有较好的分化率和增殖系数。

2.不定芽生根效果鉴定

为鉴定不定芽的生根效果，对上述实施例的不定芽生根情况进行观察，统计生根数，计算生根率，结果见表2。

表2不定芽的生根情况

项目	不定芽数	生根数	生根率
				实施例一	200	197	98.5％
实施例二	200	196	98.0％
				实施例三	200	200	100％

上述不定芽生根效果表明，本发明以改良的MS培养基(MS+NAA+IBA+蔗糖+卡拉胶)对不定芽进行诱导生根，在短时间内(1个月左右)诱导出完整根系，生根率达95％以上。

3.生根苗苗圃移栽效果鉴定

为鉴定生根苗的移栽成活效果，对上述实施例的生根苗苗圃移栽生长情况进行观察，统计成活数，计算生根率，结果见表3。

表3生根苗的移栽生长情况

项目	生根苗数	成活数	生根率
				实施例一	150	141	94.0％
实施例二	150	136	90.1％
				实施例三	150	139	92.7％

上述移栽效果表明，本发明以诱导出良好根系的生根苗进行苗圃移栽，以草炭土、椰糠和河沙的混合物为栽培基质，具有较高的生根苗移栽成活率，达到90％以上，可以满足批量种苗繁殖，为走马胎人工种植提供支持。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种利用走马胎叶片快速繁殖种苗的方法，其特征在于，包括叶片诱导分化不定芽、不定芽继代增殖、壮苗、生根诱导、移栽和管理过程，其步骤如下：

1)、叶片诱导分化不定芽过程

取幼嫩的走马胎叶片，清洗消毒后用无菌纸吸干水分，然后沿与叶脉垂直方向切成0.5～1.0㎝×1.0～2.0㎝的小块接种于诱导培养基上诱导分化不定芽，培养温度24～26℃，光照时间10～12h/d，光照强度20～30μmol·m^-2·s^-1；培养8天后，开始在叶片切口处叶片表面分化不定芽，培养30天后，将分化出不定芽的叶片细切成含有2～4个不定芽的小块后再接种于新鲜诱导培养基进行继代增殖培养，直至形成丛芽；所述诱导培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加6-BA 0.5～2.0mg/L、IBA0.1～1.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH值为5.8；

2)、壮苗培养过程

将丛芽切割成小丛后转接到壮苗培养基上进行壮苗培养；所述壮苗培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加6-BA 0.1～0.5mg/L、NAA 0.1mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L、10％椰子水，pH5.8；

3)、生根诱导过程

经壮苗培养的不定芽长到2～3cm高时，单株切取，接种于生根培养基上进行生根培养，培养10d后，开始从切口处产生不定根，培养1个月后形成良好根系，获得完整植株；所述生根培养基是以MS培养基为基本培养基，并添加NAA 0.1～0.5mg/L、IBA0.1～1.0mg/L、蔗糖30g/L、卡拉胶6.5g/L，pH 5.8；

4)、移栽和管理过程

A.移栽：将生根苗连瓶放置在控温大棚中炼苗，一周后将苗移出培养瓶外，洗净小苗根部的培养基，在600倍液的多菌灵溶液中浸泡30s～1min后，移栽到经多菌灵溶液消毒好的栽培基质上；

B.栽培基质配比及处理：分别取草炭土、椰糠和河沙，按体积比计：草炭土：椰糠：河沙＝3～5：2～4：1的比例混匀，用多菌灵溶液淋透后盖上薄膜捂3～5d后揭开，用清水淋透后种苗；

C.管理：移栽7～10d后，覆盖薄膜保湿，基质湿度保持80％～90％，然后逐渐降低到70％；空气湿度90％以上，然后逐渐降低到60％～70％；遮阴60％～70％，然后逐渐减少到30％；在控温大棚中培育6～8个月，待植株生长至高15～20cm，具有5～6片展开叶片时，定植到田间；

D.施肥：15～20d后幼苗生新根，晴天上午采用0.2％～0.3％尿素溶液喷雾后，并用清水淋洗，每7d施肥1次；

E.病虫害防治：利用500倍多菌灵、500倍百菌清、800倍甲霜灵复合防病，利用菊酯类杀虫剂除虫。