CN114747487B - 一种走马胎组培工厂化育苗专用培养基、制备方法及育苗方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种走马胎组培工厂化育苗专用培养基、制备方法及育苗方法，其中，该专用培养基成分每升中包括50ml母液A、10ml母液B、1ml母液C、1ml母液D、1ml母液E、10ml母液F、1000mg聚乙烯吡咯烷酮K‑30、20ml纳米银C溶液、30g蔗糖、7g卡拉胶。本发明实现了从外植体诱导到试管苗移栽出圃185～205天，生产周期短；外植体诱导期50～65天，诱导率88～92％；增殖、壮芽和生根周期50～60天，增殖率4～5倍、生根率95～98％，成苗率94～96％，污染率2～3％，褐化率2～4％，塑料大棚移栽80d，移栽存活率94～98％，高12～15cm。已生产出组培苗52680株，为林下仿野生规模化种植提供了大量的优质种苗，解决当前种苗严重不足的现状。

Description

一种走马胎组培工厂化育苗专用培养基、制备方法及育苗 方法

技术领域

本发明属于植物栽培技术领域，具体涉及一种走马胎组培工厂化育苗专用培养基、制备方法及育苗方法。

背景技术

走马胎(Ardisia gigantifolia stapf)，别名血枫、山鼠、山猪药、走马风等，紫金牛科(Myrsinaceae)紫金牛属(Ardisia)。多年生直立常绿小灌木。通常高1～3m；根粗壮，外皮黄棕色，内皮黄色。叶通常集生于枝顶，互生，纸质，阔椭圆形或长椭圆形，长20～45cm，宽8～20cm，顶端渐尖，基部渐狭而成一短柄，边缘有整齐的细锯齿，背面通常紫红色，有时淡绿色。春夏开花。圆锥花序顶生，长20～30cm；花白色或淡紫红色；萼5裂，裂片近三角形，长约1.5mm；花冠5深裂，裂片卵状长圆形，长3～4mm；雄蕊5枚，着生于花冠裂片的基部并与其对生；子房上位，花柱线形。果球形，成熟时红色，具细长的柄。多生长于山谷、溪旁的林下潮湿处。

走马胎其干燥根及根茎是我国传统中药材，药用历史悠久，具有很高的药用价值，是一种药用和观赏价值极高的野生植物。主要分布于广西、广东、江西和福建等地，具有很大的开发潜力。走马胎味辛、性温，具有祛风湿、壮筋骨和活血祛痕的功效，广泛应用于跌打损伤、风湿骨痛、产后血痕和痈疽溃疡的治疗。走马胎主要药用化学成分为三萜皂苷类、岩白菜素类、香豆素类、甾醇类和挥发油类等，其中三萜皂苷类和岩白菜素类在抗肿瘤、抗氧化、抗血栓等方面具有重要意义，也是目前研究的热点。走马胎也是民间食疗的原材料，其保健产品的开发正在不断扩展。目前，市场上的走马胎主要来源于野生采挖，随着需求量的增大，导致货源紧缺，而过度的采挖使野生资源日益缺乏、枯竭，所以急需开展走马胎的人工种植。生产上以自然采摘的走马胎种子作为种源，多混杂，极易造成质量不稳定。随着植物组织培养技术的普及，多种名贵中草药种苗已由植物工厂进行快速繁殖，如岗梅、铁皮石斛、牛大力等。利用走马胎嫩叶为外植体，诱导出愈伤组织和不定芽分化途径的培养方法已成功，但局限于实验室的研究，而且这种方法培养出的种苗极容易产生变异。而利用走马胎优质种苗的茎段为外植体，开展工厂化生产走马胎种苗还未见报道。

本发明采用走马胎优质植株萌发的嫩枝枝段为外植体，进行外植体诱导、增殖和生根培养基筛选试验研究，并以此为基础进行优化，创新性地建立了一套走马胎组培工厂化生产育苗生产技术流程和一种集外植体诱导、增殖、壮芽生根培养合为一体的专用培养基，该培养基还同时解决了走马胎工厂化生产育苗各环节培养过程中容易出现的严重内生菌和褐化问题，应用于组培工厂化育苗已生产出组培苗52680株，为林下仿野生规模化种植提供了大量的优质种苗，解决当前种苗严重不足的现状。

发明内容

针对上述问题，本发明提供了一种走马胎组培工厂化育苗专用培养基、制备方法及育苗方法。

本发明采用的技术方案为：

一种走马胎组培工厂化育苗专用培养基，该专用培养基成分每升中包括48～52ml母液A、8～12ml母液B、0.8～1.2ml母液C、0.8～1.2ml母液D、0.8～1.2ml母液E、8～12ml母液F、900～1100mg聚乙烯吡咯烷酮K-30、15～25ml纳米银C溶液、25～35g蔗糖、6.5～7.5g卡拉胶。

优选的，该专用培养基成分每升中包括50ml母液A、10ml母液B、1ml母液C、1ml母液D、1ml母液E、10ml母液F、1000mg聚乙烯吡咯烷酮K-30、20ml纳米银C溶液、30g蔗糖、7g卡拉胶。

优选的，所述的母液A包括8.25g/L硝酸氨、28.5g/L硝酸钾、2.55g/L磷酸二氢钾、6.6g/L氯化钙、5.55g/L硫酸镁；

所述的母液B包括2.78g/L硫酸亚铁和3.73g/L乙二胺四乙酸二钠盐；

所述的母液C包括0.25g/L目酸钠、22.3g/L硫酸锰、8.6g/L硫酸锌、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴、6.2g/L硼酸；

所述的母液D包括0.5g/L6-BA；

所述的母液E包括0.2g/LIAA；

所述的母液F包括10g/L肌醇、0.4g/L甘氨酸、0.1g/L盐酸硫胺素、0.05g/L盐酸吡哆辛、0.05g/L烟酸、0.5g/L抗坏血酸。

一种走马胎组培工厂化育苗专用培养基的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：准备好母液A、母液B、母液C、母液D、母液E、母液F及操作工具，按照顺序放置在培养基配制台上；

步骤2：按照要求用量准备好聚乙烯吡咯烷酮K-30、纳米银C溶液、蔗糖和卡拉胶；

步骤3：培养瓶和瓶盖先用自来水冲洗洁净后放入稀释1000倍的纳米银C溶液浸泡10min.晾干待用；

步骤4：将准备好的聚乙烯吡咯烷酮K-30、蔗糖和卡拉胶放入洁净的不锈钢锅里；

步骤5：按照用量要求量取母液A、母液B、母液C、母液D、母液E、母液F和纳米银C溶液，放入容量瓶并加入纯净水定容；

步骤6：将定容好的母液倒入不锈钢锅内并放到电磁炉上加热，加热过程中不断搅拌，直至卡拉胶和蔗糖完全溶解；

步骤7：上述各类成分充分混合并完全溶解后的混合溶液，采用1NNaOH或1NHCl溶液调整PH到5.8；

步骤8：按容器的容积和培养要求，用烧杯将培养基分装到培养瓶，分装时注意不要把培养基粘附到瓶口和内壁上；

步骤9：把分装好培养基的培养瓶盖上盖，集中放入高压灭菌锅高温121℃灭菌20min,待压力降为0后，打开灭菌锅锅盖，取出培养基放入培养基储藏室存放冷却备用。

一种走马胎组培工厂化育苗方法，包括以下步骤：

步骤S1：外植体准备

5～6月或10～11月，取生长健壮、无病虫害、存放在塑料大棚15天以上并经外植体预处理的走马胎优良母株新萌发的嫩枝，去除叶片，用75％酒精抹擦干净后，切成5～7cm长的枝段；

步骤S2：外植体消毒无菌操作

在超净工作台上，将切取的枝段放入75％酒精湿润50～60s后取出，用0.1％的HgCl溶液灭菌4min，用无菌水冲洗2次，再用0.1％的HgCl溶液灭菌3min，用无菌水冲洗5次，将消毒好的枝段切成长约2～3cm，带有1～2个叶芽的小段作为外植体进行叶芽诱导；

步骤S3：外植体叶芽诱导

将消毒处理后的外植体接种于叶芽诱导培养基，每瓶接种一段，进行叶芽诱导培养，诱导培养条件：温度25±2℃、光照强度2000～3000Lux、光照时间10～12h；

步骤S4：继代增殖、壮芽生根无菌扩繁促长

经叶芽诱导培养基诱导培养50～60d后，外植体叶芽萌发、长高和生根。以后以50～60d为一个转接培养周期。转接时，单株切段，每段带有一个叶芽，接种至继代增殖、壮芽生根无菌扩繁促长培养基，每瓶接种6～8段，进行增殖培养，增殖培养条件：温度25±2℃、光照强度2500～3500Lux、光照时间10～12h；

步骤S5：组培种苗成苗生根炼苗培养

准备转出塑料大棚生根炼苗的增殖培养材料，接种后在接种室内当天采用食品级保鲜膜沿着瓶盖与瓶子接口处包扎2～3圈，保持瓶盖和瓶子两边各有1～1.5cm被包住，然后隔天放入炼苗塑料大棚内架子上进行炼苗及生根培养，生根培养条件：控制大棚温度20～32℃、光照强度6000～10000Lux、光照时间7～14h、湿度35～75％；

步骤S6：组培种苗成苗塑料大棚移栽

移栽基质准备与消毒、取苗冲洗、消毒分级和种苗种植。

步骤S7：试管苗栽培管理

湿度管理、光照管理、水分管理、温度和通风管理、肥分管理和病虫害防治；步骤S8：组培苗出圃

林下仿野生规模化种植或大田种植苗质量标准：(1)叶片舒展、叶色淡红绿、叶片数达到8片以上；(2)茎粗壮，株高20cm以上；(3)根系发达，植株健康，无病虫害；(4)生长正常，无扭曲现象。达到组培苗出圃标准并已移栽驯化的组培苗即可出圃进行林下仿野生规模化种植或大田种植。

步骤S3中的诱导培养基、步骤S4中的增殖培养基和步骤S5中的生根培养基均采用专用培养基。

优选的，该专用培养基成分每升中包括50ml母液A、10ml母液B、1ml母液C、1ml母液D、1ml母液E、10ml母液F、1000mg聚乙烯吡咯烷酮K-30、20ml纳米银C溶液、30g蔗糖、7g卡拉胶。

优选的，所述的母液A包括8.25g/L硝酸氨、28.5g/L硝酸钾、2.55g/L磷酸二氢钾、6.6g/L氯化钙、5.55g/L硫酸镁；

所述的母液B包括2.78g/L硫酸亚铁和3.73g/L乙二胺四乙酸二钠盐；

所述的母液C包括0.25g/L目酸钠、22.3g/L硫酸锰、8.6g/L硫酸锌、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴、6.2g/L硼酸；

所述的母液D包括0.5g/L6-BA；

所述的母液E包括0.2g/LIAA；

所述的母液F包括10g/L肌醇、0.4g/L甘氨酸、0.1g/L盐酸硫胺素、0.05g/L盐酸吡哆辛、0.05g/L烟酸、0.5g/L抗坏血酸。

优选的，在步骤S6中，移栽基质准备与消毒、取苗冲洗、消毒分级和种苗种植具体包括：

步骤S601：移栽基质准备

60％干净的泥炭土+30％蛭石+10％干净河沙混合均匀备用；

步骤S602：移栽基质消毒

准备好的基质用高锰酸钾和敌磺钠进行消毒。具体操作方法：0.2％的高锰酸钾溶液在混合基质时一边搅拌一边喷淋，使基质均匀湿润为度，裝填后隔天再用500倍的敌磺钠溶液淋透隔天使用；

步骤S603：移栽基质装填

育苗容器使用54孔的塑料穴盘(6穴×9穴)。把消毒好的基质装填入塑料穴盘备用。装填基质时必须把基质稍微压实并填平。

步骤S604：组培苗出瓶与清洗

用镊子把炼好的试管苗从培养瓶轻轻地夹出(注意尽量不要伤根)，放入备好、装有干净水的塑料盆里，用干净水清洗两遍(做到基部无残留培养基，尽量少伤根、伤苗)；

步骤S605：组培苗消毒和种植

清洗干净后的组培苗用0.02％的高锰酸钾溶液浸泡5min.后取出用干净的自来水清洗一遍并把其分为三级：一级、二级、三级，按不同的级别分类进行栽植。栽植时，基质应该盖住组培苗的基部，不能盖到心部。栽植后，用手轻捏，使苗的根部与基质充分接触，并淋定根水HN-1号促根杀菌营养剂：NAA0.2mg/L+花宝1号1g/L+花宝2号1g/L+硫酸亚铁0.5mg/L+硼酸50mg/L+纳米银C溶液(2wt％)10ml/L)

优选的，在步骤S7中，栽培管理包括：

湿度管理：试管苗种植后，用搭建的简易小拱棚覆盖塑料薄膜保湿。刚种植前4d，棚内湿度保持70～80％，后逐渐打开薄膜，通风降低湿度。开始揭膜时，在晚上，并先从两边，后逐渐扩大并延长时间，第10～12天全天候打开，湿度与试管苗移栽环境一致。

光照管理：组培苗移栽塑料大棚用90％的遮阳网覆盖遮阴。

水分管理：试管苗移栽基质始终保持湿润状态。移植前4天，薄膜覆盖，不用淋水，4天后，薄膜经常打开通风降温并注意观察，发现基质表面干时及时淋水，淋水时必须采用喷淋的方式，切忌用水龙头直接对着冲淋。淋水水应做到先少后多，保证前7d基质离表面1～3cm处保持湿润状态。10d后，新根可长出，顶芽开始抽高，苗开始成活生长，淋水应保证全部基质湿润。

温度和通风管理：试管苗移栽的环境温度控制在20～32℃之间。试管苗移栽4天后开始逐天打开覆盖保湿用的塑料薄膜：先从棚的两头，渐逐扩大面积，先从晚上，渐逐延长时间，直到最后全天候完全揭开。

肥分管理和病虫害防治：试管苗移植前7天，结合淋水用HN-1号促根杀菌营养剂进行2次的喷淋施肥防病，每3天1次。试管苗长出新根并开始长高时，每7d施用一次水肥和杀菌剂。水肥配方：磷酸二氢钾、尿素、硫酸钙、硫酸镁按1：1：0.5：0.5的比例配成总浓度为3000ppm的水溶液施用；杀菌剂：甲基托布津、国光英钠、敌磺钠、国光根灵等杀菌剂配成800-1000倍溶液交替使用。如发生病害，及时清除病株，并每隔2～3天喷杀菌剂一次，连续喷施2～3次。杀菌剂必须多种交换使用，特殊情况可多种混合使用(碱性药不能与酸性药混合)并加入井冈霉素。

本发明的有益效果：

本发明解决了走马胎工厂化生产育苗各环节培养过程中严重出现的内生菌和褐化技术难题。实现了从外植体诱导到试管苗移栽出圃185～205天，生产周期短；外植体诱导期50～65天，诱导率88～92％；增殖、壮芽和生根周期50～60天，增殖率4～5倍、生根率95～98％，成苗率94～96％，污染率2～3％，褐化率2～4％，塑料大棚移栽80d，移栽存活率94～98％，高12～15cm。已生产出组培苗52680株，为林下仿野生规模化种植提供了大量的优质种苗，解决当前种苗严重不足的现状。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为走马胎优良单株；

图2为外植体消毒接种过程；

图3为外植体叶芽诱导；

图4为单株切段转接；

图5为继代增殖、壮芽生根扩繁；

图6为继代增殖、壮芽生根扩繁培养室培养；

图7为成苗生根炼苗培养；

图8为成苗塑料大棚移栽；

图9为成苗栽培管理。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。

本实施例提供了一种走马胎组培工厂化育苗专用培养基，该专用培养基成分每升中包括母液A、母液B、母液C、母液D、母液E、母液F、聚乙烯吡咯烷酮K-30、纳米银C溶液、蔗糖、卡拉胶。各个成分的具体添加量见下表。

表一种走马胎组培工厂化育苗专用培养基(Iz)配方

上述专用培养基的制备方法，包括以下步骤：

步骤1：准备好母液A、母液B、母液C、母液D、母液E、母液F及操作工具，按照顺序放置在培养基配制台上；

步骤2：按照要求用量准备好聚乙烯吡咯烷酮K-30、纳米银C溶液、蔗糖和卡拉胶；

步骤3：培养瓶和瓶盖先用自来水冲洗洁净后放入稀释1000倍的纳米银C溶液浸泡10min.晾干待用；

步骤4：将准备的聚乙烯吡咯烷酮K-30、蔗糖和卡拉胶放入洁净的不锈钢锅里；

步骤5：按照用量要求量取母液A、母液B、母液C、母液D、母液E、母液F和纳米银C溶液，放入容量瓶并加入纯净水定容；

步骤6：将定容好的母液倒入不锈钢锅内并放到电磁炉上加热，加热过程中不断搅拌，直至卡拉胶和蔗糖完全溶解；

步骤7：上述各类成分充分混合并完全溶解后的混合溶液，采用1NNaOH或1NHCl溶液调整PH到5.8；(注释：1N表示为当量浓度N：溶液的浓度用1升溶液中所含溶质的克当量数来表示的叫当量浓度。当量浓度＝溶质的克当量数/溶液体积(升))

步骤8：按容器的容积和培养要求，用烧杯将培养基分装到培养瓶，分装时注意不要把培养基粘附到瓶口和内壁上；

步骤9：把分装好培养基的培养瓶盖上盖，集中放入高压灭菌锅高温121℃灭菌20min,待压力降为0后，打开灭菌锅锅盖，取出培养基放入培养基储藏室存放冷却备用。

本发明还提供了一种走马胎组培工厂化育苗方法，其技术路线为：不同产地采集野生种源→种质资源圃建立观察分析→优良种质确立→优良单株筛选及株群建立→组织培养工厂化生产育苗。组织培养工厂化生产育苗具体包括以下步骤：

步骤S1：准备外植体

如图1所示，5～6月或10～11月，取生长健壮、无病虫害、存放在塑料大棚15天并经外植体预处理的新萌发的嫩枝，去除叶片，用75％酒精抹擦干净后，切成5～7cm长；

步骤S2：外植体消毒无菌操作

如图2所示，将切取嫩枝的放入75％酒精继续湿润50～60s，用0.1％的HgCl溶液灭菌4min，用无菌水冲洗2次，再用0.1％的HgCl溶液灭菌3min，用无菌水冲洗5次，将消毒好的茎切成长约2.0～3.0cm，带有2～3个节间的小段；

步骤S3：外植体叶芽诱导

如图3所示，将消毒处理后的外植体接种于叶芽诱导培养基，每瓶接种一段，进行愈伤组织诱导培养，诱导培养条件：温度25±2℃；光照强度2000～3000Lux；光照时间10～12h；

外植体叶芽诱导培养基：Iz，PH5.8。

结果：外植体诱导过程转接2次，每25～33天转接1次，周期50～65天，污染率20～30％，诱导率88～92％。

表1外植体叶芽诱导不同培养基成分诱导效果对比

步骤S4：继代增殖、壮芽生根无菌扩繁促长

50～60d为转接培养周期，转接时(如图4所示)，单株切段，每段带有一个叶芽，接种至继代增殖、壮芽生根无菌扩繁促长培养基，每瓶接种6～8段，进行增殖培养，增殖培养条件：温度25±2℃；光照强度2500～3500Lux；光照时间10～12h(如图5、6所示)；

继代增殖、壮芽生根无菌扩繁促长培养基：Iz，PH5.8。

结果：转接培养周期50～60d，增殖率4～5倍、生根率95～98％，成苗率94～96％，污染率2～3％，褐化率2～4％(轻微)。

表2继代增殖不同培养基成分培养效果对比

步骤S5：组培种苗成苗生根炼苗培养

如图7所示，转出塑料大棚生根炼苗的材料，接种后在接种室内采用食品级保鲜膜沿着瓶盖与瓶子接口处包扎2～3圈，保持瓶盖和瓶子两边各有1～1.5cm被包住，然后隔天放入炼苗塑料大棚内架子上进行炼苗及生根培养，生根培养条件：控制大棚温度20～32℃、光照强度8000～15000Lux、光照时间7～14h、湿度35～85％；

组培种苗成苗生根培养基：Iz，PH5.8。

结果：生根炼苗培养50～60d，苗壮、生根整齐，高5～7cm，生根率96～98％，成苗率95～97％，污染率2～4％，褐化率2～3％(轻微)。

表3成苗生根不同培养基成分培养效果对比

步骤S6：组培种苗成苗塑料大棚移栽

如图8所示，移栽基质准备与消毒、取苗冲洗、消毒分级和种苗种植；

移栽基质准备：60％干净的泥炭土+30％蛭石+10％干净河沙混合均匀备用；

移栽基质消毒：准备好的基质用高锰酸钾和敌磺钠进行消毒。具体操作方法：0.2％的高锰酸钾溶液在混合基质时一边搅拌一边喷淋，使基质均匀湿润为度，裝填后隔天再用500倍的敌磺钠溶液淋透隔天使用；

移栽基质装填：育苗容器使用54孔的塑料穴盘(6穴×9穴)。把消毒好的基质装填入塑料穴盘备用。装填基质时必须把基质稍微压实并填平。

组培苗出瓶与清洗：用镊子把炼好的试管苗从培养瓶轻轻地夹出(注意尽量不要伤根)，放入备好、装有干净水的塑料盆里，用干净水清洗两遍(做到基部无残留培养基，尽量少伤根、伤苗)；

组培苗消毒和种植：清洗干净后的组培苗用0.02％的高锰酸钾溶液浸泡5min.后取出用干净的自来水清洗一遍并把其分为三级：一级、二级、三级，按不同的级别分类进行栽植。栽植时，基质应该盖住组培苗的基部，不能盖到心部。栽植后，用手轻捏，使苗的根部与基质充分接触，并淋定根水HN-1号促根杀菌营养剂：NAA0.2mg/L+花宝1号1g/L+花宝2号1g/L+硫酸亚铁0.5mg/L+硼酸50mg/L+纳米银C溶液(2wt％)10ml/L)

步骤S7：组培种苗成苗栽培管理(如图9所示)

湿度管理：试管苗种植后，用搭建的简易小拱棚覆盖塑料薄膜保湿。刚种植前4d，棚内湿度保持70～80％，后逐渐打开薄膜，通风降低湿度。开始揭膜时，在晚上，并先从两边，后逐渐扩大并延长时间，第10～12天全天候打开，湿度与试管苗移栽环境一致。

光照管理：组培苗移栽塑料大棚用90％的遮阳网覆盖遮阴，光照过强，容易引起烧苗，且容易引起棚内高温，高温高湿，加上不通风，就容易引发病害，苗出现严重死亡。出圃前应增强光照，以便出圃到大田种植时更适应自然条件，更有利于走马胎的大田生长。

水分管理：基质的水分必须始终保持湿润状态，水分不能过多，否则苗很容易霉烂，茎质表面干时，才用喷雾淋湿。一般情况下，刚移植苗的前4天，由于薄膜覆盖，棚处于比较密闭状态，水分蒸发很少，不用什么淋水，4天后，由于薄膜经常打开通风降温，这时基质的水分容易蒸发，因而开始容易变干，就要注意观察，发现干时，及时淋水，淋水时必须采用喷淋的方式，切忌用水龙头直接对着冲淋。淋水水应做到先少后多，保证前7d基质离表面1～3cm处保持湿润状态(用手捏紧湿手但无水滴下)，以便促进根的生长。10d后，新根可长出，顶芽开始抽高，苗开始成活生长，淋水应保证全部基质湿润(用手捏紧湿手但无水滴下)。

温度管理：走马胎的生长温度为20～32℃，最适生长温度为24～27℃，低于18℃时生长停滞，高于32℃时，生长延慢，35℃容易引起烧苗。因此，试管苗移栽的环境温度最好控制在22～30℃之间，在这种温度时，一般10天苗开始长新根，顶芽伸长长高，10天可完全揭开薄膜。如无法达到这种温度要求，也要控制达到18～32℃，否则试管苗移植将失败。

通风管理：通过通风，可以调节移植环境的湿度、温度及空气的新鲜度，有利于苗的生长，及病害的控制。一般移植前4天可不揭开薄膜通风，4天后可开始逐天打开，先从棚的两头，渐逐扩大面积，先从晚上，渐逐延长时间，直到最后全天候完全揭开。

肥分管理和病虫害防治：试管苗移植前7天，结合淋水用HN-1号促根杀菌营养剂进行2次的喷淋施肥防病，每3天1次。试管苗长出新根并开始长高时，每7d施用一次水肥和杀菌剂。水肥配方：磷酸二氢钾、尿素、硫酸钙、硫酸镁按1：1：0.5：0.5的比例配成总浓度为3000ppm的水溶液施用；杀菌剂：甲基托布津、国光英钠、敌磺钠、国光根灵等杀菌剂配成800-1000倍溶液交替使用。如发生病害，及时清除病株，并每隔2～3天喷杀菌剂一次，连续喷施2～3次。杀菌剂必须多种交换使用，特殊情况可多种混合使用(碱性药不能与酸性药混合)并加入井冈霉素。

组培成苗出圃：林下仿野生规模化种植或大田种植苗质量标准：(1)叶片舒展、叶色淡红绿、叶片数达到8片以上；(2)茎粗壮，株高20cm以上；(3)根系发达，植株健康，无病虫害；(4)生长正常，无扭曲现象。达到组培苗出圃标准并已移栽驯化的组培苗即可出圃进行林下仿野生规模化种植或大田种植。

结果：塑料大棚移栽80d，移栽存活率94～98％，新根长出、根系发达，苗抽高、高12～15cm，健壮、整齐，生长情况佳。

实现了从外植体诱导到试管苗移栽出圃185～205天，生产周期短；外植体诱导期50～65天，诱导率88～92％；增殖、壮芽和生根周期50～60天，增殖率4～5倍、生根率95～98％，成苗率94～96％，污染率2～3％，褐化率2～4％，塑料大棚移栽80d，移栽存活率94～98％，高12～15cm。已生产出组培苗52680株，为林下仿野生规模化种植提供了大量的优质种苗，解决当前种苗严重不足的现状。

以上所述，仅用以说明本发明的技术方案而非限制，本领域普通技术人员对本发明的技术方案所做的其它修改或者等同替换，只要不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (3)

1.一种走马胎组培工厂化育苗方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：外植体准备

5～6月或10～11月，取生长健壮、无病虫害、存放在塑料大棚15天以上并经外植体预处理的走马胎优良母株新萌发的嫩枝，去除叶片，用75%酒精抹擦干净后，切成5～7cm长的枝段；

步骤S2：外植体消毒无菌操作

在超净工作台上，将切取的枝段放入75%酒精湿润50～60s后取出，用0.1%的HgCl溶液灭菌4min，用无菌水冲洗2次，再用0.1%的HgCl溶液灭菌3min，用无菌水冲洗5次，将消毒好的枝段切成长2～3cm，带有1～2个叶芽的小段作为外植体进行叶芽诱导；

步骤S3：外植体叶芽诱导

将消毒处理后的外植体接种于叶芽诱导培养基，每瓶接种一段，进行叶芽诱导培养，诱导培养条件：温度25±2℃、光照强度2000～3000Lux、光照时间10～12h；

步骤S4：继代增殖、壮芽生根无菌扩繁促长

经叶芽诱导培养基诱导培养50～60d后，外植体叶芽萌发、长高和生根，以后以50～60d为一个转接培养周期，转接时，单株切段，每段带有一个叶芽，接种至继代增殖、壮芽生根无菌扩繁促长培养基，每瓶接种6～8段，进行增殖培养，增殖培养条件：温度25±2℃、 光照强度2500～3500 Lux、光照时间10～12h；

步骤S5：组培种苗成苗生根炼苗培养

准备转出塑料大棚生根炼苗的增殖培养材料，接种后在接种室内当天采用食品级保鲜膜沿着瓶盖与瓶子接口处包扎2～3圈，保持瓶盖和瓶子两边各有1～1.5cm被包住，然后隔天放入炼苗塑料大棚内架子上进行炼苗及生根培养，生根培养条件：控制大棚温度20～32℃、光照强度6000～10000Lux、光照时间7～14h、湿度35～75%；

步骤S6：组培种苗成苗塑料大棚移栽

移栽基质准备与消毒、取苗冲洗、消毒分级和种苗种植；

步骤S7试管苗栽培管理

湿度管理、光照管理、水分管理、温度和通风管理、肥分管理和病虫害防治；

步骤S8组培苗出圃

林下仿野生规模化种植或大田种植苗质量标准：（1）叶片舒展、叶色淡红绿、叶片数达到8片以上；（2）茎粗壮，株高20cm以上；（3）根系发达，植株健康，无病虫害；（4）生长正常，无扭曲现象，达到组培苗出圃标准并已移栽驯化的组培苗即可出圃进行林下仿野生规模化种植或大田种植；

步骤S3中的诱导培养基、步骤S4中的增殖培养基和步骤S5中的生根培养基均采用专用培养基；

所述的专用培养基每升里面添加有50ml母液A、10ml母液B、1ml母液C、1ml母液D、1ml母液E、10ml母液F、1000mg聚乙烯吡咯烷酮K-30、20ml纳米银C溶液、30g蔗糖、7g卡拉胶；

所述的母液A由8.25g/L硝酸氨、28.5g/L硝酸钾、2.55g/L磷酸二氢钾、6.6g/L氯化钙、5.55g/L硫酸镁组成；

所述的母液B由2.78g/L硫酸亚铁和3.73g/L乙二胺四乙酸二钠盐组成；

所述的母液C由0.25g/L目酸钠、22.3g/L硫酸锰、8.6g/L硫酸锌、0.025g/L硫酸铜、0.025g/L氯化钴、6.2g/L硼酸组成；

所述的母液D为0.5g/L6-BA；

所述的母液E为0.2g/LIAA；

所述的母液F由10g/L肌醇、0.4g/L甘氨酸、0.1g/L盐酸硫胺素、0.05g/L盐酸吡哆辛、0.05g/L烟酸、0.5g/L抗坏血酸组成。

2.根据权利要求1所述的一种走马胎组培工厂化育苗方法，其特征在于，在步骤S6中，移栽基质准备与消毒、取苗冲洗、消毒分级和种苗种植具体包括：

步骤S601：移栽基质准备

60%泥炭土+30%蛭石+10%河沙混合均匀备用；

步骤S602：移栽基质消毒

准备好的基质用高锰酸钾和敌磺钠进行消毒；具体操作方法：0.2%的高锰酸钾溶液在混合基质时一边搅拌一边喷淋，使基质均匀湿润为度，裝填后隔天再用500倍的敌磺钠溶液淋透隔天使用；

步骤S603：移栽基质装填

育苗容器使用54孔的塑料穴盘，把消毒好的基质装填入塑料穴盘备用，装填基质时必须把基质稍微压实并填平；

步骤S604：组培苗出瓶与清洗

用镊子把炼好的试管苗从培养瓶轻轻地夹出，放入备好、装有干净水的塑料盆里，用干净水清洗两遍；

步骤S605：组培苗消毒和种植

清洗干净后的组培苗用0.02%的高锰酸钾溶液浸泡5min.后取出，用干净的自来水清洗一遍并把其分为三级：一级、二级、三级，按不同的级别分类进行栽植，栽植时，基质盖住组培苗的基部，不能盖到心部，栽植后，用手轻捏，使苗的根部与基质充分接触，并淋定根水HN-1号促根杀菌营养剂：NAA0.2mg/L+花宝1号1g/L+花宝2号1g/L+硫酸亚铁0.5mg/L+硼酸50mg/L+纳米银C溶液10ml/L。

3.根据权利要求2所述的一种走马胎组培工厂化育苗方法，其特征在于，在步骤S7中，试管苗栽培管理包括：

湿度管理：试管苗种植后，用搭建的简易小拱棚覆盖塑料薄膜保湿，刚种植前4d，棚内湿度保持70～80%，后逐渐打开薄膜，通风降低湿度，开始揭膜时，在晚上，并先从两边，后逐渐扩大并延长时间，第10～12天全天候打开，湿度与试管苗移栽环境一致；

光照管理：组培苗移栽塑料大棚用90%的遮阳网覆盖遮阴；

水分管理：试管苗移栽基质始终保持湿润状态，移植前4天，薄膜覆盖，不用淋水，4天后，薄膜经常打开通风降温并注意观察，发现基质表面干时及时淋水，淋水时必须采用喷淋的方式，切忌用水龙头直接对着冲淋，淋水应做到先少后多，保证前7d基质离表面1～3cm处保持湿润状态；10d后，新根可长出，顶芽开始抽高，苗开始成活生长，淋水应保证全部基质湿润；

温度和通风管理：试管苗移栽的环境温度控制在20～32℃之间，试管苗移栽4天后开始逐天打开覆盖保湿用的塑料薄膜：先从棚的两头，渐逐扩大面积，先从晚上，渐逐延长时间，直到最后全天候完全揭开；

肥分管理和病虫害防治：试管苗移植前7天，结合淋水用HN-1号促根杀菌营养剂进行2次的喷淋施肥防病，每3天1次；试管苗长出新根并开始长高时，每7d施用一次水肥和杀菌剂；水肥配方：磷酸二氢钾、尿素、硫酸钙、硫酸镁按1：1：0.5：0.5的比例配成总浓度为3000ppm的水溶液施用；杀菌剂：甲基托布津、国光英钠、敌磺钠、国光根灵配成800-1000倍溶液交替使用；如发生病害，及时清除病株，并每隔2～3天喷杀菌剂一次，连续喷施2～3次。

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