CN106359087A - 一种天门冬组培快繁育苗方法 - Google Patents

一种天门冬组培快繁育苗方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种天门冬组培快繁育苗方法，属于生物技术领域。该方法包括1)灭菌；2)接种及愈伤组织诱导；3)愈伤组织分化及不定芽诱导；4)壮苗生根培养及5)驯化移栽种植。本发明通过采用新型的生根培养基，不仅使生根培养基中的有害物质、细菌得以消灭，减轻了外植体的褐变，还使生根培养基中富含多种有益矿物质，并诱导和促进脱落酸及细胞分裂素合成的作用，改变了天门冬体内的激素平衡，有效地调节了天门冬的生长发育，促进了天门冬的生根，生根快，节约了时间成本，且生根率高，可达95％以上。

Description

一种天门冬组培快繁育苗方法
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种天门冬组培快繁育苗方法。
【背景技术】
天门冬为百合科植物。又名天冬。性寒，味甘，微苦。具有养阴清热，润肺滋肾的功效。用于治阴虚发热、咳嗽吐血、肺痈、咽喉肿痛、消渴、便秘等病症。天门冬块根含淀粉33％，蔗糖4％及其他多种营养成分。天门冬全草含天冬酰胺(天门冬素)、β-谷固醇、固体皂苷、黏液质、糖醛衍生物、17种氨基酸、丰富的维生素、无机元素、豆固醇、内酯、黄酮、蒽醌及强心苷等成分。
天门冬是一种珍贵的中药资源，野生天门冬经长期采挖资源频临灭绝。目前，人工栽培天门冬主要靠种子繁殖和分株繁殖。(1)种子繁殖：在畦内开横沟后按一种的种距播种，一般每亩播种10-12千克。播后覆盖堆肥或草木灰，再盖细土与畦面相平，上面再盖稻草保湿。气温在17-20℃，并需有足够的湿度，发芽后揭去盖草，待幼苗开始出土时搭棚遮荫等。(2)分株繁殖：选取根头大、芽头粗壮的健壮母株，将每株至少分成3簇，每簇有芽2-5个，带有3个以上的小块根。切口要小，并抹上石灰以防感染，摊晾1天后即可种植。方法同育苗后的移栽。但种子繁殖发芽率低，出苗时间长；分株繁殖的繁殖系数低，每株只能分得3-5株。近年来，针对天门冬的繁殖出现了一种新的繁殖方法即组织培养繁殖方法，但该方法的生根率研究等却鲜有报道。
【发明内容】
本发明的发明目的在于：针对上述存在的问题，提供一种天门冬组培快繁育苗方法。该方法具有培养周期短、有效芽苗多、生根率高、移植成活率高的特点，可在短期内即可获得大量优质天门冬种苗。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种天门冬组培快繁育苗方法，包括如下步骤：
(1)灭菌：剪取天门冬的嫩枝作为外植体，用自来水冲洗干净，剪成1.0-2.0cm长，再对嫩枝外植体进行清洗、灭菌处理，将坏死部分用刀切除；
(2)接种及愈伤组织诱导：将经过灭菌处理后的外植体接种在诱导培养基上，每瓶接种3-5枝，静置4-8天后，大部分外植体切口处萌发少量愈伤组织，再经过4-8天后，外植体切口处均布满淡黄色致密的愈伤组织；
(3)愈伤组织分化及不定芽诱导：将产生的淡黄色致密的愈伤组织转接到分化培养基中培养，经5-8天后愈伤组织生长分化，颜色渐趋变绿；经4-8天后长出淡黄绿色不定芽，将获得的不定芽移入增殖培养基进行增殖培养，静置4-8天将会长出丛生芽；
(4)壮苗生根培养：外植体生长分化丛生芽至每枝4-5个芽时，将其转接到壮苗培养基中进行壮苗培养，经20-30天后，待其丛生芽长成2-4cm的丛生苗时，再转接到生根培养基上进行生根培养，所述生根培养基：1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+蔗糖2％+10-20mg/L硅藻泥和/或1-3mg/L三唑类化合物；
(5)驯化移栽种植：在生根培养基中15-25天后，丛生苗长出白根，形成幼苗，待苗高长到4-5cm时，将幼苗进行闭瓶炼苗5-7天，再将瓶盖打开，在室内自然光照、温度25-28℃条件下静置2-6天，待其长出嫩叶，即可从培养瓶中取出，根部经清水洗净处理后，在营养土里栽培成株，待幼苗出现3-5个新枝后入土栽培，经5-10天后覆盖薄膜保湿，10-15天即可长出新根。
进一步地，所述灭菌具体为将嫩枝外植体放入体积浓度为1％的洗洁精水溶液中浸泡5-8min，再用自来水细流冲洗20min；在干净工作台上再用体积浓度为75％酒精消毒10-40s后，再用无菌水冲洗干净；然后放入1g/L氯化汞中浸泡5-10min，再用无菌水冲洗干净，取出后用无菌滤纸吸干水份。
进一步地，所述壮苗生根培养的培养温度为25℃±2℃，光照时间为12-16小时/天，光照强度为1500Lx-2000Lx。
进一步地，所述无菌水冲洗时间为3-5min。
进一步地，所述诱导培养基、分化培养基、增殖培养基和壮苗培养基的配方分别如下：
诱导培养基：1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA；
分化培养基：MS+1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+0.2mg/L KT；
增殖培养基：MS+1.0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+0.2mg/L KT；
壮苗培养基：1/2MS+0.5mg/L IAA+0.5mg/L IBA。
进一步地，所述步骤(5)中营养土为采用腐叶土、园土、沙土、骨粉、米糠、茶叶渣和辣椒叶以2:2:1:2:1:1:1的比例配制而成。
进一步地，所述三唑类化合物为三唑酮、三唑醇、乙环唑或苄氯三唑醇。
三唑类农药除抑菌作用外，还具有极强的调节植物生长、提高植物抵抗不良环境伤害的生理效应。目前报道具有激素作用的杀菌剂如三唑酮、三唑醇、乙环唑以及苄氯三唑醇等均是分子结构极为相似的三唑类化合物。该类化合物属内吸性杀菌剂，在一定的剂量内,可以协调植物地上部分和地下部分、营养生长和生殖生长的关系,有利于提高栽培群体的经济产量。该类化合物能够调节植物生长发育的机理在于:它们参与植物体内异戊二烯的代谢过程,抑制赤霉素的生物合成,诱导和促进脱落酸及细胞分裂素的合成,改变植物体内的激素平衡,从而有效地调节和控制植物的生长发育。三唑类化合物抑制了赤霉素和生长素的合成,使植物生长受到阻滞,矮化了植物,改变了作物的根冠比,从而增加了抗倒伏能力。
三唑类化合物具有植物生长调节剂的特性还表现在能促进植株地上部分和根的生长，同时三唑类化合物能保护叶组织中的绿色色素，增加叶片的含水量，喷洒后能增加植株的反应性，对盐生环境下早熟禾的建植和养护有着潜在的应用价值。
硅藻泥为采用生活在数百万年前的水生浮游类生物—硅藻沉积而成的天然物质，主要成分为蛋白石，富含多种有益矿物质，质地轻软，其表面具有无数微小的孔穴，孔隙率达90％以上，比表面积高达65㎡/g，因此硅藻泥的吸附活性极强，由于其极强的吸附活性，可吸附培养基中的有害物质，从而减轻外植体的褐变，同时由于硅藻泥内富含多种有益矿物质，将其加入培养基中可提高培养基的营养成分，促进生根。
基于上述三唑类化合物和硅藻泥所具有的作用，本发明尝试将这两种物质运用到组织培养技术中，将其添加至生根培养基中对天门冬进行生根培养，最终发现所培养的天门冬的生根率高达95％以上，大大提高了天门冬组织培养的生根率。
目前并没见将三唑类化合物和硅藻泥应用至天门冬属植物组织培养中生根培养基上的报道。
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
(1)本发明通过采用新型的生根培养基，不仅使生根培养基中的有害物质、细菌得以消灭，减轻了外植体的褐变，还使生根培养基中富含多种有益矿物质，并诱导和促进脱落酸及细胞分裂素合成的作用，改变了天门冬体内的激素平衡，有效地调节了天门冬的生长发育，促进了天门冬的生根，生根率高，可达95％以上，生根快，培养周期短，可在短期内即可获得大量优质天门冬种苗。
(2)本发明还采用富含多种营养成分的营养土进行栽培成株，促进了植株的成长，移植成活率高，植株生长健壮。
【具体实施方式】
实施例1：
一种天门冬组培快繁育苗方法，具体步骤如下：
(1)灭菌：剪取天门冬的嫩枝作为外植体，用自来水冲洗干净，然后剪成1.0-2.0cm长的小茎段，放入1％的洗洁精水溶液中浸泡5min，再用自来水细流冲洗20min；在超净工作台上再用75％酒精消毒10s后，再用无菌水冲洗干净；然后放入1g/L氯化汞中浸泡5min，再用无菌水冲洗5min至干净；取出后用无菌滤纸吸干水份，将坏死部分用刀切除；
(2)接种及愈伤组织诱导：将经过灭菌处理后的外植体接种在配方为1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA的诱导培养基上，每瓶接种3-5枝，静置5天后，大部分外植体切口处萌发少量愈伤组织，再经过4-6天后，外植体切口处均布满淡黄色致密的愈伤组织；
(3)愈伤组织分化及不定芽诱导：将产生的淡黄色致密的愈伤组织转接到配方为MS+1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+0.2mg/L KT的分化培养基中培养，经5-8天后愈伤组织生长分化，颜色渐趋变绿；经4-8天后长出淡黄绿色不定芽，将获得的不定芽移入配方为MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+0.2mg/L KT的增殖培养基进行增殖培养，静置4-6天将会长出丛生芽；
(5)壮苗生根培养：外植体生长分化丛生芽至每枝4-5个芽时，将其转接到配方为1/2MS+0.5mg/L IAA+0.5mg/L IBA的壮苗培养基中进行壮苗培养，经20-25天后，待其丛生芽长成2-4cm的丛生苗时，再转接到配方为1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+蔗糖2％+20mg/L硅藻泥的生根培养基上进行生根培养，其中培养温度为25℃±2℃，光照时间为12-16小时/天，光照强度为1500Lx-2000Lx；
(6)驯化移栽种植：在生根培养基中15-20天后，丛生苗长出白根，形成幼苗，待苗高长到4-5cm时，将幼苗进行闭瓶炼苗5-7天，再将瓶盖打开，在室内自然光照、温度25-28℃条件下静置2-4天，待其长出嫩叶，即可从培养瓶中取出，根部经清水洗净处理后，在营养采用腐叶土、园土、沙土、骨粉、米糠、茶叶渣和辣椒叶以2:2:1:2:1:1:1的比例配制而成的营养土里栽培成株，待幼苗出现3-5个新枝后入土栽培，经5-10天后覆盖薄膜保湿，10-15天即可长出新根。
实施例2：
一种天门冬组培快繁育苗方法，具体步骤如下：
(1)灭菌：剪取天门冬的嫩枝作为外植体，用自来水冲洗干净，然后剪成1.0-2.0cm长的小茎段，放入1％的洗洁精水溶液中浸泡8min，再用自来水细流冲洗20min；在超净工作台上再用75％酒精消毒40s后，再用无菌水冲洗干净；然后放入1g/L氯化汞中浸泡10min，再用无菌水冲洗5min至干净；取出后用无菌滤纸吸干水份，将坏死部分用刀切除；
(2)接种及愈伤组织诱导：将经过灭菌处理后的外植体接种在配方为1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA的诱导培养基上，每瓶接种3-5枝，静置8天后，大部分外植体切口处萌发少量愈伤组织，再经过6-8天后，外植体切口处均布满淡黄色致密的愈伤组织；
(3)愈伤组织分化及不定芽诱导：将产生的淡黄色致密的愈伤组织转接到配方为MS+1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+0.2mg/L KT的分化培养基中培养，经5-8天后愈伤组织生长分化，颜色渐趋变绿；经4-8天后长出淡黄绿色不定芽，将获得的不定芽移入配方为MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+0.2mg/L KT的增殖培养基进行增殖培养，静置6-8天将会长出丛生芽；
(5)壮苗生根培养：外植体生长分化丛生芽至每枝4-5个芽时，将其转接到配方为1/2MS+0.5mg/L IAA+0.5mg/L IBA的壮苗培养基中进行壮苗培养，经25-30天后，待其丛生芽长成2-4cm的丛生苗时，再转接到配方为1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+蔗糖2％+10mg/L硅藻泥和1mg/L三唑酮的生根培养基上进行生根培养，其中培养温度为25℃±2℃，光照时间为12-16小时/天，光照强度为1500Lx-2000Lx；
(6)驯化移栽种植：在生根培养基中15-25天后，丛生苗长出白根，形成幼苗，待苗高长到4-5cm时，将幼苗进行闭瓶炼苗5-7天，再将瓶盖打开，在室内自然光照、温度25-28℃条件下静置2-6天，待其长出嫩叶，即可从培养瓶中取出，根部经清水洗净处理后，在营养采用腐叶土、园土、沙土、骨粉、米糠、茶叶渣和辣椒叶以2:2:1:2:1:1:1的比例配制而成的营养土里栽培成株，待幼苗出现3-5个新枝后入土栽培，经5-10天后覆盖薄膜保湿，10-15天即可长出新根。
实施例3：
一种天门冬组培快繁育苗方法，具体步骤如下：
(1)灭菌：剪取天门冬的嫩枝作为外植体，用自来水冲洗干净，然后剪成1.0-2.0cm长的小茎段，放入1％的洗洁精水溶液中浸泡8min，再用自来水细流冲洗20min；在超净工作台上再用75％酒精消毒20s后，再用无菌水冲洗干净；然后放入1g/L氯化汞中浸泡8min，再用无菌水冲洗5min至干净；取出后用无菌滤纸吸干水份，将坏死部分用刀切除；
(2)接种及愈伤组织诱导：将经过灭菌处理后的外植体接种在配方为1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA的诱导培养基上，每瓶接种3-5枝，静置4-6天后，大部分外植体切口处萌发少量愈伤组织，再经过6-8天后，外植体切口处均布满淡黄色致密的愈伤组织；
(3)愈伤组织分化及不定芽诱导：将产生的淡黄色致密的愈伤组织转接到配方为MS+1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+0.2mg/L KT的分化培养基中培养，经5-8天后愈伤组织生长分化，颜色渐趋变绿；经4-8天后长出淡黄绿色不定芽，将获得的不定芽移入配方为MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+0.2mg/L KT的增殖培养基进行增殖培养，静置4-8天将会长出丛生芽；
(5)壮苗生根培养：外植体生长分化丛生芽至每枝4-5个芽时，将其转接到配方为1/2MS+0.5mg/L IAA+0.5mg/L IBA的壮苗培养基中进行壮苗培养，经20-25天后，待其丛生芽长成2-4cm的丛生苗时，再转接到配方为1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+蔗糖2％+3mg/L三唑醇的生根培养基上进行生根培养，其中培养温度为25℃±2℃，光照时间为12-16小时/天，光照强度为1500Lx-2000Lx；
(6)驯化移栽种植：在生根培养基中15-25天后，丛生苗长出白根，形成幼苗，待苗高长到4-5cm时，将幼苗进行闭瓶炼苗5-7天，再将瓶盖打开，在室内自然光照、温度25-28℃条件下静置2-4天，待其长出嫩叶，即可从培养瓶中取出，根部经清水洗净处理后，在营养采用腐叶土、园土、沙土、骨粉、米糠、茶叶渣和辣椒叶以2:2:1:2:1:1:1的比例配制而成的营养土里栽培成株，待幼苗出现3-5个新枝后入土栽培，经5-8天后覆盖薄膜保湿，10-12天即可长出新根。
对比例：
一种天门冬组培快繁育苗方法，具体步骤如下：
(1)灭菌：剪取天门冬的嫩枝作为外植体，用自来水冲洗干净，然后剪成1.0-2.0cm长的小茎段，放入1％的洗洁精水溶液中浸泡5-8min，再用自来水细流冲洗20min；在超净工作台上再用75％酒精消毒10-40s后，再用无菌水冲洗干净；然后放入1g/L氯化汞中浸泡5-10min，再用无菌水冲洗3-5min至干净；取出后用无菌滤纸吸干水份，将坏死部分用刀切除；
(2)接种及愈伤组织诱导：将经过灭菌处理后的外植体接种在配方为1/2MS+1.0mg/L6-BA+0.5mg/L NAA的诱导培养基上，每瓶接种3-5枝，静置4-8天后，大部分外植体切口处萌发少量愈伤组织，再经过4-8天后，外植体切口处均布满淡黄色致密的愈伤组织；
(3)愈伤组织分化及不定芽诱导：将产生的淡黄色致密的愈伤组织转接到配方为MS+1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+0.2mg/L KT的分化培养基中培养，经5-8天后愈伤组织生长分化，颜色渐趋变绿；经4-8天后长出淡黄绿色不定芽，将获得的不定芽移入配方为MS+1.0mg/L6-BA+0.05mg/L NAA+0.2mg/L KT的增殖培养基进行增殖培养，静置4-8天将会长出丛生芽；
(5)壮苗生根培养：外植体生长分化丛生芽至每枝4-5个芽时，将其转接到配方为1/2MS+0.5mg/L IAA+0.5mg/L IBA的壮苗培养基中进行壮苗培养，经20-30天后，待其丛生芽长成2-4cm的丛生苗时，再转接到配方为1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+蔗糖2％的生根培养基上进行生根培养，其中培养温度为25℃±2℃，光照时间为12-16小时/天，光照强度为1500Lx-2000Lx；
(6)驯化移栽种植：在生根培养基中15-25天后，丛生苗长出白根，形成幼苗，待苗高长到4-5cm时，将幼苗进行闭瓶炼苗5-7天，再将瓶盖打开，在室内自然光照、温度25-28℃条件下静置2-6天，待其长出嫩叶，即可从培养瓶中取出，根部经清水洗净处理后，在营养采用腐叶土、园土、沙土以2:2:1的比例配制而成的营养土里栽培成株，待幼苗出现3-5个新枝后入土栽培，经5-10天后覆盖薄膜保湿，10-15天即可长出新根。
对本发明实施例与对比例的生根率和植株生长速度进行比较，得到数据如下表所示：
生根率(％) 植株生长速度
实施例1 96 快
实施例2 99 快
实施例3 97 快
对比例 67 慢
根据表中的数据，本发明实施例中的生根率明显高于对比例中的生根率，且植株生长速度快，表明本发明中的生根培养基极大地促进了外植体的生根，使本发明天门冬的繁殖速度加快。
上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (7)

1.一种天门冬组培快繁育苗方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)灭菌：剪取天门冬的嫩枝作为外植体，用自来水冲洗干净，剪成1.0-2.0cm长，再对嫩枝外植体进行清洗、灭菌处理，将坏死部分用刀切除；
(2)接种及愈伤组织诱导：将经过灭菌处理后的外植体接种在诱导培养基上，每瓶接种3-5枝，静置4-8天后，大部分外植体切口处萌发少量愈伤组织，再经过4-8天后，外植体切口处均布满淡黄色致密的愈伤组织；
(3)愈伤组织分化及不定芽诱导：将产生的淡黄色致密的愈伤组织转接到分化培养基中培养，经5-8天后愈伤组织生长分化，颜色渐趋变绿；经4-8天后长出淡黄绿色不定芽，将获得的不定芽移入增殖培养基进行增殖培养，静置4-8天将会长出丛生芽；
(4)壮苗生根培养：外植体生长分化丛生芽至每枝4-5个芽时，将其转接到壮苗培养基中进行壮苗培养，经20-30天后，待其丛生芽长成2-4cm的丛生苗时，再转接到生根培养基上进行生根培养；所述生根培养基：1/2MS+0.5mg/L IBA+0.5mg/L NAA+蔗糖2％+10-20mg/L硅藻泥和/或1-3mg/L三唑类化合物；
(5)驯化移栽种植：在生根培养基中15-25天后，丛生苗长出白根，形成幼苗，待苗高长到4-5cm时，将幼苗进行闭瓶炼苗5-7天，再将瓶盖打开，在室内自然光照、温度25-28℃条件下静置2-6天，待其长出嫩叶，即可从培养瓶中取出，根部经清水洗净处理后，在营养土里栽培成株，待幼苗出现3-5个新枝后入土栽培，经5-10天后覆盖薄膜保湿，10-15天即可长出新根。
2.根据权利要求1所述的天门冬组培快繁育苗方法，其特征在于，所述灭菌具体为将嫩枝外植体放入体积浓度为1％的洗洁精水溶液中浸泡5-8min，再用自来水细流冲洗20min；在干净工作台上再用体积浓度为75％酒精消毒10-40s后，再用无菌水冲洗干净；然后放入1g/L氯化汞中浸泡5-10min，再用无菌水冲洗干净，取出后用无菌滤纸吸干水份。
3.根据权利要求1所述的天门冬组培快繁育苗方法，其特征在于，所述壮苗生根培养的培养温度为25℃±2℃，光照时间为12-16小时/天，光照强度为1500Lx-2000Lx。
4.根据权利要求2所述的天门冬组培快繁育苗方法，其特征在于，所述无菌水冲洗时间为3-5min。
5.根据权利要求1所述的天门冬组培快繁育苗方法，其特征在于，所述诱导培养基、分化培养基、增殖培养基和壮苗培养基的配方分别如下：
诱导培养基：1/2MS+1.0mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA；
分化培养基：MS+1.5mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+0.2mg/L KT；
增殖培养基：MS+1.0mg/L 6-BA+0.05mg/L NAA+0.2mg/L KT；
壮苗培养基：1/2MS+0.5mg/L IAA+0.5mg/L IBA。
6.根据权利要求1所述天门冬组培快繁育苗方法，其特征在于，所述步骤(5)中营养土为采用腐叶土、园土、沙土、骨粉、米糠、茶叶渣和辣椒叶以2:2:1:2:1:1:1的比例配制而成。
7.根据权利要求1所述天门冬组培快繁育苗方法，其特征在于，所述三唑类化合物为三唑酮、三唑醇、乙环唑或苄氯三唑醇。
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