CN105794650A

CN105794650A - 一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法

Info

Publication number: CN105794650A
Application number: CN201610228960.2A
Authority: CN
Inventors: 陈利萍; 曹丽雯; 于宁宁; 李俊星; 叶立新; 刘胜龙; 彭辉; 刘玲娟
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2016-04-13
Filing date: 2016-04-13
Publication date: 2016-07-27
Anticipated expiration: 2036-04-13
Also published as: CN105794650B

Abstract

本发明公开了一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，解决了浙江省极小种群广西越桔在自然条件下繁殖比较困难的问题。本发明在自然保护区收集广西越桔未成熟果实，表面消毒后剥取其未成熟种子及部分子房组织，通过组织培养技术来繁育广西越桔后代，短时间内获得数量较多的广西越桔无菌幼苗。本发明的优点是：本发明采用的外植体为未成熟种子，利用人工培养基对其进行培养，能够改善在自然条件下，其种子繁殖不发达的缺陷，可在短期内获得较多的广西越桔植株。该方法可操作性强，简单实用，污染率低，对于极小种群的保存及其繁殖具有重要的意义。

Description

一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法

技术领域

本发明涉及一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，涉及技术领域为通过提高种子繁育水平进而达到保存及扩繁极小种群的目的。

背景技术

广西越桔属于杜鹃花科越桔属(Vaccimium)植物，为常绿小灌木，生于海拔1200-1700米的林中、山谷石上或附生于壳斗科植物树干上。广西越桔主要分布于湖南、广东和广西。2003年，“凤阳山珍稀植物和植被调查”首次发现并报道了广西越桔在浙江省的分布，但其数量稀少，全省分布少于50株，被列入浙江省极小种群保护名录。目前，越桔常见的繁殖方式有实生、分株和扦插，但由于其种子小且萌发条件严苛，在自然条件下繁殖较困难；而分株繁殖的繁殖系数比较低；扦插繁殖的环境管理要求比较高，成活率不高。越桔的繁殖困难在一定程度上制约了其在自然条件下的种群数量及分布范围。因此，急需一套完整的能够提高广西越桔繁殖水平的技术来保存广西越桔，防止极小种群广西越桔因在自然条件下繁殖困难而灭绝，然而目前为止还没有关于这方面的报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法。

为实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，包括如下步骤：

(1)采集广西越桔植株上表面呈现绿色、表皮坚硬的未成熟果实，消毒后，用解剖刀切开未成熟果实，剥取未成熟种子连同部分子房组织，接种到培育培养基上；于25℃黑暗条件下培养24h，再在弱光照条件下(光照强度为20μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天)培养，直到种子成熟；

(2)种子发育成熟后，将种子转移至萌发培养基上进行诱导萌发，培养条件：温度为25℃、光照强度为20μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天；

(3)种子萌发后，将幼苗转移到生长培养基上进行壮苗培养，并且可以通过扩繁培养基诱导其腋芽生长，进行大量扩繁。壮苗后将植株转移至生根培养基上进行生根培养。培养条件：温度为25℃、光照强度为50μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天；

(4)待植株生根后，将其炼苗后转移至营养土中栽培，栽培条件：温度为22/18℃、光照强度为50μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天。

进一步地，在所述步骤(1)中，所述消毒程序为：①将未成熟果实在洗洁精水(在1L水中加入5ml洗洁精)中浸泡清洗20分钟；②用自来水冲洗浸泡过的果实2个小时；③在超净工作台上，将冲洗后的未成熟果实在体积分数为75％的乙醇水溶液中浸泡30秒，浸泡后用无菌水冲洗果实3次，每次1分钟；④用质量体积比为0.1％的升汞水溶液浸泡消毒10分钟，期间摇动3-5次，消毒结束后用无菌水冲洗5次，每次1分钟；⑤将冲洗后的果实置于无菌滤纸上，将果实表皮上多余的水分吸干。

进一步地，在所述步骤(1)中，所述未成熟种子剥取方法为用灭菌解剖刀切除果实上下两端各0.3cm，然后纵向切开，左手持镊子夹住果实外皮，右手持解剖刀将未成熟种子及部分子房组织取下；

进一步地，根据现有的记载和观察，在所述步骤(1)中，所述未成熟种子的种皮表面呈浅黄褐色，所述成熟种子的种皮表面呈现深棕褐色。

进一步地，在所述步骤(1)中，培育培养基以WPM(WoodyPlantMedium)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、活性炭、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白，蔗糖、琼脂、活性炭、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL、0.002g/mL、0.0004g/mL、0.0005g/mL，pH为5.0；

进一步地，在所述步骤(2)中，所述萌发培养基由WPM、蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤和赤霉素组成，蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤、赤霉素的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL、1×10^-6g/mL、1.5×10^-6g/mL，pH为5.0；

进一步地，在所述步骤(3)中，所述生长培养基由WPM、蔗糖、琼脂组成，蔗糖、琼脂的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL，pH为5.0；

进一步地，在所述步骤(3)中，所述扩繁培养基由WPM、蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤组成，蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL、2×10^-6g/mL，pH为5.0；

进一步地，在所述步骤(3)中，所述生根培养基由WPM、蔗糖、琼脂、吲哚丁酸组成，蔗糖、琼脂、吲哚丁酸的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL、1×10^-6g/mL，pH为5.0。

进一步地，在所述步骤(4)中，所述营养土由草炭和蛭石组成，草炭和蛭石的质量比为3：1。

本发明的优点是：本发明采用人工培养基对广西越桔未成熟种子进行培养提高种子的繁殖水平，种子萌发后经过扩繁，可在短期内获得数量比较多的广西越桔无菌植株。该方法可操作性强，简单实用，污染率低，获得植物后代的效果显著，节省快繁时间，对于极小种群的保存及扩繁具有重要的意义。

附图说明

图1是广西越桔未成熟种子培养图；

图2是广西越桔成熟种子诱导萌发图；

图3是广西越桔组培苗壮苗图；

图4是广西越桔组培苗诱导腋芽扩繁图；

图5是广西越桔组培苗诱导生根图；

图6是广西越桔组培苗移栽后生长图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明做进一步说明。

实施例1：

材料：本实例以凤阳山自然保护区野外采集的广西越桔未成熟种子为培养外植体。

步骤(1)：取材

9月中下旬到10月初于凤阳山自然保护区收集广西越桔未成熟的果实，果实表面为浅绿色，且表皮坚硬。

步骤(2)：材料消毒

将摘取的广西越桔未成熟果实先用洗洁精水(在1L水中加入5ml洗洁精)浸泡清洗20分钟，自来水冲洗2个小时，然后在超净工作台上进行操作，用体积分数为75％的乙醇水溶液浸泡30秒，无菌水洗3次，每次1分钟，再用质量体积比为0.1％的升汞水溶液消毒10分钟，期间摇动3-5次，无菌水冲洗5次，每次1分钟，最后在无菌滤纸上将广西越桔未成熟果实表面多余水分吸干。

步骤(3)：未成熟种子的剥离与接种

将消毒后的果实置于铺有灭菌滤纸的培养皿中，用灭菌解剖刀切除其上下两端各0.3cm左右，然后纵向切开，左手持镊子夹住果实外皮，右手持解剖刀将未成熟种子及部分子房组织取下，接种到培育培养基上(图1)，未成熟种子呈现浅黄褐色。培育培养基以WPM(WoodyPlantMedium)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、活性炭、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白，蔗糖、琼脂、活性炭、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL、0.002g/mL、0.0004g/mL、0.0005g/mL，pH为5.0。接种后的未成熟种子先于25℃、黑暗条件下培养24小时，再在弱光照条件下(光照强度为20μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天)培养20天，种子成熟，成熟种子种皮呈现深棕褐色，共获得22粒成熟种子。

步骤(4)：成熟种子的诱导萌发

种子成熟后，将成熟种子转移至萌发培养基上培养，诱导种子萌发(图2)。起初，将22粒成熟种子置于由WPM、蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤组成的萌发培养基上进行萌发培养，蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL、1×10^-6g/mL，pH为5.0，此萌发培养基对广西越桔种子萌发的促进作用不明显，广西越桔种子在此萌发培养基上仅萌发2颗，萌发率为9.09％。随后，对萌发培养基的成份进行调整，在前面所用萌发培养基的基础上加入1.5×10^-6g/mL的赤霉素，调整后的萌发培养基明显促进了广西越桔种子的萌发，之前剩余的20粒未萌发种子在该调整后的萌发培养基上又萌发了4颗，萌发率提高为20％。所以，最终确定萌发培养基由WPM、蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤和赤霉素组成，蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤、赤霉素的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL、1×10^-6g/mL、1.5×10^-6g/mL，pH为5.0。培养条件：温度为25℃、光照强度为20μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天。

步骤(5)：壮苗、扩繁、生根

种子萌发后，将幼苗转移到生长培养基上进行壮苗培养，生长培养基由WPM、蔗糖、琼脂组成，蔗糖、琼脂的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL，pH为5.0，壮苗培养后的幼苗如图3所示。然后，通过扩繁培养基诱导越桔的腋芽生长，进行大量扩繁(图4)，扩繁培养基由WPM、蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤组成，蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL、2×10^-6g/mL，pH为5.0。将壮苗培养后的植株转移至生根培养基上进行生根培养(图5)，生根培养基由WPM、蔗糖、琼脂、吲哚丁酸组成，蔗糖、琼脂、吲哚丁酸的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL、1×10^-6g/mL，pH为5.0。壮苗、扩繁和生根的培养条件：温度为25℃、光照强度为50μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天。

步骤(6)：炼苗移栽

待广西越桔生根，将其炼苗后转移至营养土中栽培(图6)，营养土由草炭和蛭石组成，草炭和蛭石的质量比为3：1。栽培条件：温度为22/18℃、光照强度为50μmol·m^-2·s^-1、光照时间为12小时/天。

Claims

1.一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，所述消毒程序为：①将未成熟果实在洗洁精水(在1L水中加入5ml洗洁精)中浸泡清洗20分钟；②用自来水冲洗浸泡过的果实2个小时；③在超净工作台上，将冲洗后的未成熟果实在体积分数为75％的乙醇水溶液中浸泡30秒，浸泡后用无菌水冲洗果实3次，每次1分钟；④用质量体积比为0.1％的升汞水溶液浸泡消毒10分钟，期间摇动3-5次，消毒结束后用无菌水冲洗5次，每次1分钟；⑤将冲洗后的果实置于无菌滤纸上，将果实表皮上多余的水分吸干。

3.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，所述未成熟种子剥取方法为用灭菌解剖刀切除果实上下两端各0.3cm，然后纵向切开，左手持镊子夹住果实外皮，右手持解剖刀将未成熟种子及部分子房组织取下。

4.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，所述未成熟种子的种皮表面呈浅黄褐色，所述成熟种子的种皮表面呈现深棕褐色。

5.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤(1)中，培育培养基以WPM(WoodyPlantMedium)为基本培养基，另外添加蔗糖、琼脂、活性炭、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白，蔗糖、琼脂、活性炭、谷氨酰胺、酶水解酪蛋白的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL、0.002g/mL、0.0004g/mL、0.0005g/mL，pH为5.0。

6.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤(2)中，所述萌发培养基由WPM、蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤和赤霉素组成，蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤、赤霉素的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL、1×10^-6g/mL、1.5×10^-6g/mL，pH为5.0。

7.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，所述生长培养基由WPM、蔗糖、琼脂组成，蔗糖、琼脂的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL，pH为5.0。

8.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，所述扩繁培养基由WPM、蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤组成，蔗糖、琼脂、6-苄氨基腺嘌呤的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL、2×10^-6g/mL，pH为5.0。

9.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤(3)中，所述生根培养基由WPM、蔗糖、琼脂、吲哚丁酸组成，蔗糖、琼脂、吲哚丁酸的浓度分别为0.03g/mL、0.012g/mL、1×10^-6g/mL，pH为5.0。

10.根据权利要求1所述的一种通过未成熟种子保存极小种群广西越桔后代的方法，其特征在于：在所述步骤(4)中，所述营养土由草炭和蛭石组成，草炭和蛭石的质量比为3：1。