CN116058281B - 一种沙木蓼组织快繁方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种沙木蓼组织快繁方法，包括以下步骤：将切段后的带有部分叶片的沙木蓼外植体Ⅰ依次采用酒精、氯化汞消毒；然后将消毒后的外植体接入初代培养基上进行初代培养；之后接入继代培养基上，薄膜封口，进行继代培养；将继代培养无菌苗置于带有小拱棚的日光温室中炼苗3～5d，然后去掉封口膜，加入适量无菌水，再炼苗3～5d，移栽于沙土苗床上培养，待长出新根后，去掉小拱棚，正常管理，翌年移栽至苗圃地；初代培养基和继代培养基为添加了吲哚乙酸的B5培养基。本申请提供的快繁方法，相比沙木蓼传统的扦插技术，腋芽分化速度快，分化率高，生根速度快，炼苗移栽成活率高，值得大面积推广。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及了一种沙木蓼组织快繁方法。
背景技术
沙木蓼(Atraphaxis bracteata A.los)为蓼科木蓼属的荒漠旱生灌木，是我国荒漠地区优良的沙旱生植物资源之一，具有耐旱、抗寒、抗风蚀、耐沙埋的优良特性，它以特化的形态适应严酷的荒漠环境，集沙区造林与景观优势为一体，适宜推广造林，而且衰老退化时可通过平茬方式更新复壮，其枝条可作为饲料二次利用，具有较高的生态和经济价值，故加强沙木蓼的开发应用对丰富沙区造林树种、促进沙区产业开发意义重大。而对其育苗技术的研发是关键一步，目前关于其繁殖措施主要采用硬质扦插技术和种子育苗技术，但是扦插存在插条有限、扦插成本较高、成活率较低的问题，使得该植物苗木价格较高，造成造林成本增加，而影响其推广应用；种子育苗时因其花期不一致，收获种子成熟度差异较大，进而影响出苗率，目前还未应用于生产实践。而利用组织快繁技术可快速繁殖植物，保持品种优良特性，但是现有技术中关于沙木蓼的组织快繁技术还未见研究报道。故本发明通过攻克其组织快繁技术以为其苗木繁育提供新的路径。
发明内容
本发明的目的就在于为解决现有技术的不足，而提供一种沙木蓼组织快繁方法。
本发明的目的是以下述技术方案实现的：
一种沙木蓼组织快繁方法，包括以下步骤：
S1.初代培养：将切段后的带有部分叶片的沙木蓼外植体Ⅰ依次采用酒精、氯化汞消毒；然后将消毒后的外植体接入初代培养基上，薄膜封口，于24～26℃、光暗交替条件下培养，直至培养至高度5～8cm，获得无菌苗Ⅰ；
S2.继代培养：将所述无菌苗Ⅰ切段，获得外植体Ⅱ，将所述外植体Ⅱ接入继代培养基上，薄膜封口，于24～26℃、光暗交替条件下培养，直至培养至高度5～8cm，获得无菌苗Ⅱ；
S3.炼苗移栽：将所述无菌苗Ⅱ置于带有小拱棚的日光温室中炼苗3～5d，然后去掉封口膜，加入适量无菌水，所述无菌水加入量以没过培养基为宜，再炼苗3～5d，移栽于沙土苗床上，保持在温度为23～26℃、湿度70～80％下培养，待长出新根后，去掉小拱棚，正常管理，翌年移栽至苗圃地；
所述初代培养基和继代培养基为添加了吲哚乙酸的B5培养基，所述吲哚乙酸添加量为0.15～0.25mg/L培养基，所述B5培养基还含有20～30g/L蔗糖，4～6g/L琼脂。
优选的，所述外植体Ⅰ为选自以下三种采集方式的任意一种采集获得；
方法A：采集野外无病虫害、健康的沙木蓼枝条顶部嫩枝作为外植体Ⅰ；
方法B：采集野外成熟沙木蓼无病虫害、健康的当年生枝条，剪成10～15cm插穗，于营养钵中扦插，以其生长出的嫩枝作为外植体Ⅰ；
方法C：采集成熟沙木蓼种子种植于营养钵中，以其生长出的嫩枝作为外植体Ⅰ。
优选的，步骤S1所述切段长度为1.5～2.5cm，并且叶片剪去至少三分之一。
优选的，步骤S1采用所述酒精消毒20～40s。
优选的，采用所述氯化汞的质量百分浓度为0.08～0.12％，消毒时间为3～4min。
优选的，步骤S1～S2所述光暗交替培养周期为12h/12h。
优选的，步骤S1～S2所述光暗交替培养过程中光照培养光强为1500～2500Lx。
优选的，步骤S2所述切段长度为1.5～2.5cm。
优选的，步骤S3所述沙土苗床中的沙土预先采用质量百分含量为0.15～0.25％的高锰酸钾消毒。
本申请提供的快繁方法，相比沙木蓼传统的扦插技术，腋芽分化速度快，分化率高，生根速度快，炼苗移栽成活率高，值得大面积推广。
附图说明
图1是采用传统育苗方法获得的幼苗生长状态图(左为种子育苗，右为扦插育苗)；
图2是采用种子直接作为外植体以及采用营养钵硬枝扦插得到的嫩枝作为外植体初代培养的效果图(左为种子，右为硬枝扦插，采用氯化汞消毒3min)；
图3是采用不同培养基继代培养的效果图(左为含有吲哚乙酸的MS培养基、右为含有吲哚乙酸的B5培养基)；
图4是采用B5培养基继代培养幼苗生根及生长情况。
具体实施方式
采用传统的种子育苗和扦插育苗方法，进行沙木蓼育苗，结果如图1所示，因沙木蓼花期不一致，而且种子易脱落，使其种子收集困难，且饱满程度低，使得种子育苗时存在出苗率低的问题，生产中种子育苗成活率不到60％；另外采用沙木蓼扦插育苗时，剪插穗时插条容易劈裂，使得木质部与韧皮部容易分离，从而影响枝条萌芽，进一步影响苗木成活率，使得扦插成活率降低，不到75％。传统方法所得苗木较少难以满足生产需求，使得沙木蓼苗木价格较高，进而影响了其推广应用。
在上述基础上，本发明提供了一种沙木蓼组织快繁方法，包括以下步骤：
S1.初代培养：将切段后的带有部分叶片的沙木蓼外植体Ⅰ依次采用酒精、氯化汞消毒；然后将消毒后的外植体Ⅰ接入初代培养基上，薄膜封口，于24～26℃、光暗交替条件下培养，直至培养至高度5～8cm，获得无菌苗Ⅰ。
组培外植体需选用新鲜、基因优良、生长健壮的植株，由于沙木蓼并没有组培相关研究报道，申请人尝试了多种外植体进行实验，结果发现选自以下三种采集方式的任意一种采集获得的外植体萌芽率高，且容易消毒，具体为：
方法A：采集野外无病虫害、健康的沙木蓼枝条顶部嫩枝作为外植体Ⅰ；
方法B：采集野外成熟沙木蓼无病虫害、健康的当年生枝条，剪成10～15cm插穗，于营养钵中扦插，以其生长出的嫩枝作为外植体I；
方法C：采集成熟沙木蓼种子种植于营养钵中，以其生长出的嫩枝作为外植体Ⅰ。
采集后的外植体首先进行切段，切段长度为1.5～2.5cm，每段需带有一个叶片，并且将叶片剪去至少三分之一，以刺激生长。
消毒对外植体出芽率有重要影响，消毒不彻底，将导致培养过程中出现污染，消毒过度，虽然能抑制污染，但是将对外植体组织产生较大伤害，影响发芽率，经过优选，本申请采用酒精和氯化汞结合消毒的方式，首先采用毒性较低浸润性强的酒精对外植体进行短时间消毒，酒精消毒浓度为70～75％(体积分数)，时间为20～40s，可以对组织表面进行消毒，并降低后续毒性较强的氯化汞消毒时间，以达到尽可能消毒彻底同时又减轻对组织损伤的目的，氯化汞消毒浓度优选为0.08～0.12％(质量分数)，消毒时间为3～4min，消毒时间过长，将导致对植物组织损伤过大。
培养基对外植体初代培养的萌芽情况也有着重要的影响，申请人尝试使用添加吲哚乙酸的MS培养基和添加吲哚乙酸的B5培养基进行初代培养研究，以进一步尝试通过优化改良培养基以改善萌芽效果，发现添加吲哚乙酸的MS培养基外植体萌芽慢，无愈伤组织和根产生，无菌枝条生长缓慢且细弱，不能形成无菌苗，而添加吲哚乙酸的B5培养基(吲哚乙酸添加量为0.15～0.25mg/L培养基，同时B5培养基还含有20～30g/L蔗糖，4～6g/L琼脂)，外植体能够产生愈伤组织，且有生根，能形成无菌苗，所以初代培养中选用添加吲哚乙酸的B5培养基。但是仅通过初代培养，组织数量少，因此进行继代培养，以扩大繁殖数量。
S2.继代培养：将无菌苗Ⅰ切成1.5～2.5cm小段，获得带有叶腋的外植体Ⅱ，将外植体Ⅱ接入继代培养基上，薄膜封口，于24～26℃、光暗交替条件下培养，直至培养至高度5～8cm，获得无菌苗Ⅱ。
继代培养时为了快速扩大繁殖体，需对培养基进行进一步筛选，而且，一般添加生长因子促进生长，申请人尝试使用了多种培养基进行筛选，发现选用与初代培养基相同的培养基即添加了吲哚乙酸的改良B5培养基，愈伤组织产生和生根情况较好，而且培养时间短，苗木健壮。
S3.炼苗移栽：将无菌苗Ⅱ置于带有小拱棚的日光温室中炼苗3～5d，然后去掉封口膜，加入适量无菌水，无菌水加水量以没过培养基为宜，再炼苗3～5d，移栽于沙土苗床上，保持温度为23～26℃，湿度70～80％下培养，待长出新根后，去掉小拱棚，正常管理，翌年移栽至苗圃地。
现有技术中一般在组培时继代培养后直接于日光温室中炼苗，在炼苗一段时间后，去掉封口膜再直接进行炼苗，然后进行移栽，但是申请人采用传统方法进行移栽时，发现炼苗污染率高、成活率较低，经过实验研究，发现在日光温室中搭建小拱棚、并在去掉封口膜后加入无菌水(加水量以没过培养基为宜)继续炼苗后直接移栽于沙土苗床上，可大大降低炼苗污染、改善生根效果，移栽成活率达到90％以上。
因此，本申请提供的快繁方法，相比沙木蓼传统的扦插技术，腋芽分化速度快，分化率高，生根速度快，炼苗移栽成活率高，值得大面积推广。
优选的，步骤S1～S2光暗交替培养周期为12h/12h，光暗交替培养过程中光照培养光强为1500～2500Lx。
优选的，步骤S3沙土苗床中的沙土预先采用质量百分含量为0.15～0.25％的高锰酸钾消毒，防止污染。
实施例1
实验时间和地点：实验于2021年3月～2022年5月，在甘肃省酿酒葡萄苗木快繁工程技术研究中心组培实验室和武威市林业科学研究院智能温室中进行。
一、试验方法
具体方法包括以下步骤：
1.外植体获得：一是采集石羊河林场红崖山分场人工造林区沙木蓼无病虫害、健康的枝条顶部嫩枝为组培外植体；二是采集石羊河林场红崖山分场人工造林区成熟沙木蓼无病虫害、健康的当年生枝条，剪成10～15cm插穗，于营养钵中扦插，以其生长出的嫩枝为组培外植体；三是采集石羊河林场红崖山分场人工造林区成熟沙木蓼种子种植于营养钵中，以其生长出的嫩枝为组培外植体；四是以采集的成熟沙木蓼种子为组培外植体。
2.外植体消毒：将灭菌室和超净工作台用紫外灯消毒灭菌备用，培养皿、镊子等仪器、蒸馏水、滤纸等用高压灭菌锅灭菌备用。选择前述获得的外植体于烧杯中，用1层纱布盖住杯口置于自来水下冲洗5h，倒掉自来水，用蒸馏水冲洗3～5次，放在超净工作台上，用灭菌好的剪刀将外植体剪成单芽茎段(长度约为2cm)，每个茎段带有一个叶片，并将叶片剪去1/2(种子作为外植体不需要切段、修剪叶片)，置于灭菌广口瓶中用70％的酒精将外植体浸润30s，取出外植体，将其用0.1％的氯化汞(HgCl2)分别消毒3、4、5min，之后将外植体取出，置于提前准备好的灭菌蒸馏水中，清洗5次，洗涤后用灭菌滤纸吸干外植体表面的水分，备用。
3.初代培养：将步骤2中所得外植体接入提前准备好的不同固体培养基上，每瓶培养基接种1～2个外植体，每个培养基接20瓶，编号后送入组培室进行培养。培养温度25℃，光/暗周期为12/12h，光强2000Lx，直至无菌苗在培养瓶中长到5～8cm左右，用于继代培养。
4.继代培养：将步骤3中所得无菌苗切段(每段约2cm)，每段带有一个叶腋，接入不同的培养基上，每瓶培养基接3～5个外植体，每个培养基接50瓶，编号后送入组培室进行培养。培养温度25℃，光/暗周期为12/12h，光强2000Lx，观测无菌苗萌芽/发芽情况、在不同培养基上愈伤组织产生及生根情况，直至无菌苗在培养瓶中长到5～8cm左右(约耗时30～40d)。
5.炼苗移栽：将无菌苗带培养瓶放入带有小拱棚的日光温室中炼苗4d，去掉组培瓶封口膜，加入适量无菌水，加水量以没过培养基为宜，再炼苗4d。将组培苗移出培养瓶，用清水将组培苗根部培养基清洗干净，及时移栽。移栽时，将上述苗木栽植于提前准备好的带有4cm厚度沙子的苗床上(其中沙子用0.2％的高锰酸钾进行消毒)，及时喷透水，遮荫保湿，保持温度在23～26℃，湿度70～80％进行培养。之后加强管理，待长出新根后，逐渐放风，将日光温室中的小拱棚逐渐去掉，正常管理，翌年移栽至苗圃地。
二、试验结果
1.外植体采集及消毒
试验组培时选择4种不同外植体作为繁殖材料，采用0.1％HgCl2消毒时设置了不同的消毒时间，分别观测不同消毒时间对外植体污染情况及茎段单芽萌芽率和种子发芽率的影响，结果如表1和图2所示。
表1 0.1％ HgCl2不同消毒时间对外植体消毒效果
由表1可知，不同外植体消毒5min时污染率为0，茎段单芽萌芽率也为0，说明采用0.1％ HgCl2茎段消毒时间达5min时，对外植体的消毒作用过重，虽然能够极大程度抑制污染，但对植物组织也造成极大伤害。消毒4min时种子种植外植体污染率最低，为6.98％，野外采集外植体污染率最高，为18.6％，营养钵硬枝扦插所得外植体污染率居中，为11.63％；单芽萌芽率以营养钵硬枝扦插所得外植体萌芽率最高，为58.14％，种子在营养钵种植所得外植体萌芽率最低，为30.23％，说明种子培育苗所得外植体用0.1％ HgCl2消毒4min时虽然极大降低了污染率，但是对其组织也造成一定伤害，而营养钵硬枝扦插所得外植体消毒4min时污染率较低且具有较高的单芽萌芽率。消毒3min时，野外采集外植体污染率最高，为30.23％，种子培育苗所得外植体污染率最低，为9.3％，营养钵硬枝扦插所得外植体污染率居中，为16.28％；营养钵硬枝扦插所得外植体茎段单芽萌芽率最高，为81.39％，种子培育苗所得外植体次之，为76.74％，野外采集外植体最低，为46.51％。种子消毒3～5min时，均无污染，但是种子萌芽率都比较低，为13.95～20.93％。
简言之，采用野外采集嫩枝作为组培外植体时选择0.1％ HgCl2消毒时间为4min相对较好，污染率较低且发芽率相对较好；采用硬枝扦插和种子在营养钵种植所得嫩枝为外植体进行组织培养时，选择0.1％ HgCl2消毒时间为3min相对较好，此时污染率相对较低，且具有较高的萌芽率；采用种子直接作为外植体进行繁殖时，所选消毒时间对其没有显著影响，其发芽率均比较低。综合上述结果，优选采用营养钵硬枝扦插所得嫩枝为外植体，采用0.1％ HgCl2消毒3min的方法，所得单芽萌芽率可达到80％以上。
2.初代培养
在初代培养中，选用改良MS培养基(添加0.2mg/L吲哚乙酸，培养基含25g/L蔗糖，5g/L琼脂，pH为5.8)和改良B5培养基(添加0.2mg/L吲哚乙酸，培养基含25g/L蔗糖，5g/L琼脂，pH为5.8)，外植体为营养钵硬枝扦插所得嫩枝，酒精消毒后，采用0.1％ HgCl2消毒3min。结果发现MS培养基培养时外植体萌芽慢，无愈伤组织和根产生，无菌枝条生长缓慢且细弱，不能形成无菌苗；而采用改良B5培养基，外植体能够产生愈伤组织，且有生根，能形成无菌苗。故初代培养选用改良B5培养基。
3.继代培养
在继代培养中，外植体为初代培养所得无菌繁殖枝条茎段，在6种改良固体培养基上的愈伤组织产生、生根情况及无菌苗生长情况如表2和图3、图4所示。
表2外植体在不同培养基上愈伤组织形成及生根情况
由表2可知，含有吲哚乙酸的B5培养基、1/2MS、GS培养基能够产生愈伤组织、正常生根，且能够产生无菌繁殖枝条；但含有吲哚乙酸的MS培养基无愈伤组织和新根产生，却能产生无菌繁殖枝条。由表2可知，MS和1/2MS培养基上愈伤组织和根生产较弱，许多外植体甚至无愈伤组织产生，将激素由吲哚乙酸调整为丁酸后虽然有部分愈伤组织产生，但是数量少且比较小；添加了吲哚乙酸的改良B5和GS培养基上愈伤组织产生和生根情况较好，但是改良B5培养基培养时间短，苗木更加健壮，故可选其进行继代培养。
4.炼苗
炼苗移栽后成活率达90％以上。
实施例2
1.外植体获得
采集石羊河林场红崖山分场人工造林区成熟沙木蓼无病虫害、健康的当年生枝条，剪成10～15cm插穗，于营养钵中扦插，以其生长出的嫩枝为组培外植体。
2.外植体消毒
将灭菌室和超净工作台用紫外灯消毒灭菌备用，培养皿、镊子等仪器、蒸馏水、滤纸等用高压灭菌锅灭菌备用。选择前述获得的外植体于烧杯中，用1层纱布盖住杯口置于自来水下冲洗5h，倒掉自来水，用蒸馏水冲洗3～5次，放在超净工作台上，用灭菌好的剪刀将外植体剪成单芽茎段(长度约为2cm)，每个茎段带有一个叶片，并将叶片剪去1/2，置于灭菌广口瓶中用70％的酒精将外植体浸润30s，取出外植体，将其用0.1％的氯化汞(HgCl2)分别消毒3min，之后将外植体取出，置于提前准备好的灭菌蒸馏水中，清洗5次，洗涤后用灭菌滤纸吸干外植体表面的水分，备用。
3.初代培养
将步骤2中所得外植体接入提前准备好的改良B5固体培养基(含0.2mg/L吲哚乙酸，25g/L蔗糖，5g/L琼脂，pH为5.8)上，每瓶培养基接种1～2个外植体，送入组培室进行培养。培养温度25℃，光/暗周期为12/12h，光强2000Lx，直至无菌苗在培养瓶中长到5～8cm左右。经测定萌芽率为75％。
4.继代培养
将步骤3中所得无菌苗切段(每段约2cm)，每段带有一个叶腋，接入改良B5培养基，每瓶培养基接3～5个外植体，送入组培室进行培养。培养温度25℃，光/暗周期为12/12h，光强2000Lx，直至无菌苗在培养瓶中长到5～8cm左右。经测定萌芽率为97％，生根率为95％。
5.炼苗移栽
将无菌苗带培养瓶放入带有小拱棚的日光温室中炼苗4d，去掉组培瓶封口膜，加入适量无菌水(加水量以没过培养基为宜)再炼苗4d。将组培苗移出培养瓶，用清水将组培苗根部培养基清洗干净，及时移栽。移栽时，将上述苗木栽植于提前准备好的带有4cm厚度沙子的苗床上(其中沙子用0.2％的高锰酸钾进行消毒)，及时喷透水，遮荫保湿，保持温度在23～26℃，湿度70～80％进行培养。之后加强管理，待长出新根后，逐渐放风，将日光温室中的小拱棚逐渐去掉，正常管理，翌年移栽至苗圃地。移栽成活率为93％。
尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
Claims (8)
1.一种沙木蓼组织快繁方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.初代培养：将切段后的带有部分叶片的沙木蓼外植体Ⅰ依次采用酒精、氯化汞消毒；然后将消毒后的外植体Ⅰ接入初代培养基上，薄膜封口，于24~26℃、光暗交替条件下培养，直至培养至高度5~8cm，获得无菌苗Ⅰ；所述切段长度为1.5~2.5cm，并且叶片剪去至少三分之一；
S2.继代培养：将所述无菌苗Ⅰ切段，获得外植体Ⅱ，将所述外植体Ⅱ接入继代培养基上，薄膜封口，于24~26℃、光暗交替条件下培养，直至培养至高度5~8cm，获得无菌苗Ⅱ；
S3.炼苗移栽：将所述无菌苗Ⅱ置于带有小拱棚的日光温室中炼苗3~5d，然后去掉封口膜，加入适量无菌水，所述无菌水加入量没过培养基，再炼苗3~5d，移栽于沙土苗床上，保持在温度为23~26℃、湿度70~80%下培养，待长出新根后，去掉小拱棚，正常管理，翌年移栽至苗圃地；
所述初代培养基和继代培养基为添加了0.15~0.25mg/L吲哚乙酸、20~30g/L蔗糖、4~6g/L琼脂的B5培养基。
2.如权利要求1所述的沙木蓼组织快繁方法，其特征在于，
所述外植体Ⅰ为选自以下三种采集方式的任意一种采集获得；
方法A：采集野外无病虫害、健康的沙木蓼枝条顶部嫩枝作为外植体Ⅰ；
方法B：采集野外成熟沙木蓼无病虫害、健康的当年生枝条，剪成10~15cm插穗，于营养钵中扦插，以其生长出的嫩枝作为外植体Ⅰ；
方法C：采集成熟沙木蓼种子种植于营养钵中，以其生长出的嫩枝作为外植体Ⅰ。
3.如权利要求1所述的沙木蓼组织快繁方法，其特征在于，
步骤S1采用所述酒精消毒20~40s。
4.如权利要求1所述的沙木蓼组织快繁方法，其特征在于，
采用所述氯化汞的质量百分浓度为0.08~0.12%，消毒时间为3~4min。
5.如权利要求1所述的沙木蓼组织快繁方法，其特征在于，
步骤S1~S2所述光暗交替培养周期为12h/12h。
6.如权利要求1所述的沙木蓼组织快繁方法，其特征在于，
步骤S1~S2所述光暗交替培养过程中光照培养光强为1500 ~2500Lx。
7.如权利要求1所述的沙木蓼组织快繁方法，其特征在于，
步骤S2所述切段长度为1.5~2.5cm。
8.如权利要求1所述的沙木蓼组织快繁方法，其特征在于，
步骤S3所述沙土苗床中的沙土预先采用质量百分含量为0.15~0.25%的高锰酸钾消毒。
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