CN110476807B - 一种建立油用牡丹‘凤丹’成熟种胚无菌培养体系的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种建立油用牡丹‘凤丹’成熟种胚无菌培养体系的方法，属植物组织培养领域。包括如下步骤：1）挑选种子；2）去除外种皮；3）清洗并浸泡去皮种子；4）消毒处理；5）去除胚乳；6）接种培养。本发明方法选用‘凤丹’牡丹的成熟种胚为外植体，经严格挑选、去皮浸泡、消毒和接种培养，构建的高效无菌培养体系在启动四周后，萌发率≥80％；污染率≤5％；无褐化现象。彻底解决了目前以鳞芽或土芽为外植体的牡丹组培技术无菌培养体系建立中的褐化问题，并在体系建立过程中极大的降低了污染率，提高了牡丹组培技术在生产和实践中建立无菌培养体系的应用效率。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养领域，具体地，涉及一种建立油用牡丹‘凤丹’成熟种胚无菌培养体系的方法。
背景技术
牡丹（Paeonia suffruticosa Andr.）属芍药科（Paeoniac eae）芍药属（Paeonia）多年生落叶亚灌木。‘凤丹’（Paeonia ostii ‘Feng Dan’）是经原种杨山牡丹的长时间种植和栽培而逐渐形成的一种医用和油用种。可将油用牡丹‘凤丹’作为新型木本粮油植物资源进行开发和利用，通过与其他油料作物进行比较，油用牡丹具有以下特点：高产出、高含油率、高品质、低成本。因此大力推广油用牡丹的种植对促进我国粮油生产、改变食用油消费结构以及保障国家粮油安全均具有重要意义，其发展前景非常广阔。
油用牡丹‘凤丹’具有良好的观赏和药用价值，且耐旱耐寒耐贫瘠，结实能力较好，对防止水土流失、防风固沙等方面有较好的作用，但其播种后代存在分离变异，不能较好的保存母本优良性状，且其种子存在生理后熟和二次休眠，导致育苗周期较长；其无性繁殖主要是分株、扦插、压条、嫁接等，存在繁殖系数低、成苗周期长、出苗量少且质量良莠不齐等问题。与传统育苗技术相比，组织培养技术有利于‘凤丹’牡丹育种和快速繁殖，通过组培技术解决牡丹常规繁殖过程中存在的问题，将是油用牡丹发展走向商品化和产业化的明显趋势，也是加速其繁殖和育种的有效措施。然而目前以鳞芽为外植体的油用牡丹组织培养技术在应用于生产实践中往往存在污染率高和褐化率高等问题，极大的阻碍了油用牡丹组织培养技术在生产和实践中的应用。因此，解决油用牡丹组培技术建立无菌培养体系中的褐化问题以及降低其污染率是提高牡丹组培技术在生产和实践中应用效率的关键。
发明内容
为了解决现有技术中的不足，本发明的目的在于提供一种建立油用牡丹‘凤丹’成熟种胚无菌培养体系的方法，所述方法选用油用牡丹‘凤丹’的成熟种胚为外植体，配合优化组织培养方式，解决油用牡丹组织培养技术高效无菌培养体系的建立在应用于生产实践中存在的污染率高和褐化率高等问题，提高牡丹组培技术在生产和实践中的应用效率。
为了实现上述目的，本发明采用的具体方案为：
一种建立油用牡丹‘凤丹’成熟种胚无菌培养体系的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、选取当年新采收的油用牡丹‘凤丹’种子中颗粒饱满、种皮色泽明亮无破裂的健康成熟种子，备用；
步骤二、使用尖嘴钳将步骤一挑选备用的油用牡丹‘凤丹’种子小心去除外种皮，保证去皮后胚乳完好无损；
步骤三、使用蒸馏水清洗经步骤二处理的去外种皮种子并浸泡24-30 h；
步骤四、将经步骤三浸泡后的去皮种子带进超净工作台，用紫外灯照射25-40min，再使用消毒液进行消毒；所述使用消毒液消毒的步骤为：用无菌水涮洗2-3次，再用75%医用酒精浸泡15-20 s后无菌水涮洗2-3次，然后用0.1%的升汞浸泡6-8 min后再以无菌水涮洗4-5次，弃洗液；
步骤五、去除胚乳：使用镊子镊取经步骤四消毒后的种子至灭菌滤纸上吸去多余水分，再用手术刀沿种脐对面将胚乳切开，小心取出种胚；
步骤六、使用镊子镊取健康种胚胚根向下接种于诱导油用牡丹‘凤丹’成熟种胚组织培养无根试管苗的无根试管苗诱导培养基或者组织培养具根试管苗的具根试管苗诱导培养基中进行诱导培养；
步骤七、将经步骤六接种后的培养基移至组培室进行5-10 d的暗培养后进行正常光照培养，组培室光照强度为2000-3000 Lx，光照周期为16 h/d，设置组培室环境相对湿度为85%-95%，室内温度为23-26 ℃，在此条件下培养4-5周后即可由油用牡丹‘凤丹’成熟种胚得到无根试管苗或具根试管苗，实现油用牡丹‘凤丹’成熟种胚无菌培养体系的建立。
作为对上述方案的进一步优化，所述无根试管苗诱导培养基是在改良MS培养基中加入以下组分：蔗糖25-30 g/L、琼脂7-8 g/L、6-BA 0.8-1 mg/L、NAA 0.6-0.8 mg/L和椰树牌椰汁70-100 g/L， pH值5.8-6.0。
作为对上述方案的进一步优化，所述具根试管苗诱导培养基是在改良MS培养基中加入以下组分：蔗糖25-30 g/L、琼脂7-8 g/L、6-BA 0.4-0.5 mg/L、NAA 0.6-0.8 mg/L和活性炭1-3 g/L， pH值5.8-6.0。
作为对上述方案的更进一步优化，所述改良MS培养基为将基础MS培养基配方中CaCl2·2H2O的浓度改良为880 mg/L的改良版MS培养基。
作为对上述方案的进一步优化，步骤三所述浸泡期间多次搅拌及清洗以去除内种皮。
有益效果：
1、本发明的方法选用油用牡丹‘凤丹’的成熟种胚为外植体，经严格挑选、去皮浸泡、消毒和接种培养，解决了‘凤丹’种子败育和发育不良的问题，同时也缩短了‘凤丹’种子休眠期，培养过程培养基中所添加的外源物质椰汁和活性炭均显著提高了‘凤丹’种子萌发率，萌发率≥80％，培养基中CaCl2·2H2O浓度的加倍使培养所得无菌试管苗更健壮，为后续牡丹组培技术的研究提供良好的供试材料。
2、因种胚被胚乳和内外种皮严密包裹，经过严格的去皮、消毒及无菌操作显著降低了接种的污染率，污染率≤5％，在体系建立过程中污染率的降低可提高牡丹组培技术在生产和实践中建立无菌培养体系的应用效率。
3、又因选用种胚接种操作全程中种胚不曾产生切口，故此完全不会出现牡丹组培外植体接种培养中普遍存在的褐化现象，彻底解决了目前以鳞芽或土芽为外植体的牡丹组培技术无菌培养体系建立中的褐化问题，进而提高了牡丹组培技术在生产和实践中建立无菌培养体系的应用效率。
附图说明
图1是实施例1、空白对照和实施例2的组织培养结果观测图；
图2是实施例1、空白对照和实施例2的培养结果数据对比统计图。
具体实施方式
一种建立油用牡丹‘凤丹’成熟种胚高效无菌培养体系的方法，属植物组织培养领域。包括挑选种子、去除外种皮、清洗并浸泡去皮种子、消毒处理、去除胚乳、接种培养等步骤。实现了油用牡丹‘凤丹’成熟种胚高效无菌培养体系的建立，具体步骤如下：
步骤一、在9-12月之间选取当年8月份新收油用牡丹‘凤丹’种子中颗粒饱满、种皮色泽明亮无破裂的健康成熟种子，备用；
步骤二、使用尖嘴钳将挑选备用的油用牡丹‘凤丹’种子小心去除外种皮，需保证去皮后胚乳完好无损；
步骤三、使用蒸馏水清洗去外种皮种子并浸泡24-30 h，浸泡期间可多次搅拌及清洗以完全去除内种皮；
步骤四、将浸泡后的去皮种子（要求种子种胚无破损且无内陷）带进超净工作台，用紫外灯照射25-40 min，再使用消毒液进行消毒：用无菌水涮洗2-3次，再以75%医用酒精浸泡15-20 s后无菌水涮洗2-3次，然后用0.1%的升汞浸泡6-8 min后再以无菌水涮洗4-5次，弃洗液备用；
步骤五、使用酒精灼烧并降温的镊子镊取消毒后的种子至灭菌滤纸上吸去多余水分，再用同样经酒精灼烧且降温过的手术刀沿种脐对面将胚乳切开，小心取出种胚；
步骤六、使用酒精灼烧并降温的镊子镊取健康种胚（白色或乳白色，质地厚，发育良好无破损）胚根向下接种于诱导油用牡丹‘凤丹’成熟种胚组织培养无根试管苗或具根试管苗的初代培养基中进行诱导培养。其中无根试管苗诱导培养基成分如下：改良MS培养基（将基础MS培养基中CaCl2·2H2O改良为880 mg/L），蔗糖25-30 g/L，琼脂7-8 g/L，6-BA0.8-1 mg/L，NAA 0.6-0.8 mg/L，椰树牌椰汁70-100 g/L，滴加10%的NaOH水溶液调节培养基pH值至5.8-6.0；具根试管苗诱导培养基成分如下：改良MS培养基（将基础MS培养基中CaCl2·2H2O改良为880 mg/L），蔗糖25-30 g/L，琼脂7-8 g/L，6-BA 0.4-0.5 mg/L，NAA0.6-0.8 mg/L，活性炭1-3 g/L，滴加10%的NaOH水溶液调节培养基pH值至5.8-6.0；
步骤七、将接种后的培养基移至组培室组陪架进行5-8 d或7-10 d的暗培养随后进行正常光照培养，组培室光照强度为2000-3000 Lx（冷光灯），光照周期为16 h/d（6:30-22:30），设置组培室环境相对湿度为85%-95%，室内温度为23-26 ℃，以此条件培养4-5周后即可由油用牡丹‘凤丹’成熟种胚得到无根试管苗或具根试管苗，实现油用牡丹‘凤丹’成熟种胚高效无菌培养体系的建立。
实施例1
一种建立油用牡丹‘凤丹’成熟种胚高效无菌培养体系的方法，它包括挑选种子、去除外种皮、清洗并浸泡去皮种子、消毒处理、去除胚乳、接种培养等步骤，实现了油用牡丹‘凤丹’成熟种胚高效无菌培养体系的建立，步骤如下：
步骤一、在9-12月之间选取当年8月份新收油用牡丹‘凤丹’种子中颗粒饱满、种皮色泽明亮无破裂的健康成熟种子，备用；
步骤二、使用尖嘴钳将挑选备用的油用牡丹‘凤丹’种子小心去除外种皮，需保证去皮后胚乳完好无损；
步骤三、使用蒸馏水清洗去外种皮种子并浸泡24-30 h，浸泡期间可多次搅拌及清洗以完全去除内种皮；
步骤四、将浸泡后的去皮种子（要求种子种胚无破损且无内陷）带进超净工作台，用紫外灯照射25-40 min，再使用消毒液进行消毒：用无菌水涮洗2-3次，再以75%医用酒精浸泡15-20 s后无菌水涮洗2-3次，然后用0.1%的升汞浸泡6-8 min后再以无菌水涮洗4-5次，弃洗液备用；
步骤五、使用酒精灼烧并降温的镊子镊取消毒后的种子至灭菌滤纸上吸去多余水分，再用同样经酒精灼烧且降温过的手术刀沿种脐对面将胚乳切开，小心取出种胚；
步骤六、使用酒精灼烧并降温的镊子镊取健康种胚（白色或乳白色，质地厚，发育良好无破损）胚根向下接种于诱导油用牡丹‘凤丹’成熟种胚组织培养无根试管苗的初代培养基中进行诱导培养，其中诱导培养基成分如下：改良MS培养基（将基础MS培养基中CaCl2·2H2O改良为880 mg/L），蔗糖30 g/L，琼脂8 g/L，6-BA 1 mg/L，NAA 0.8 mg/L，椰树牌椰汁75 g/L，滴加10%的NaOH水溶液调节培养基pH值至5.8-6.0；
步骤七、将接种后的培养基移至组培室组陪架进行5-8 d的暗培养随后进行正常光照培养，组培室光照强度为3000 Lx（冷光灯），光照周期为16 h/d（6:30-22:30），设置组培室环境相对湿度为85%，室内温度为25 ℃，以此条件培养4-5周后即可由油用牡丹‘凤丹’成熟种胚得到无根试管苗，实现油用牡丹‘凤丹’成熟种胚高效无菌培养体系的建立。
实施例2
一种建立油用牡丹‘凤丹’成熟种胚高效无菌培养体系的方法，它包括挑选种子、去除外种皮、清洗并浸泡去皮种子、消毒处理、去除胚乳、接种培养等步骤，实现了油用牡丹‘凤丹’成熟种胚高效无菌培养体系的建立，步骤如下：
步骤一、在9-12月之间选取当年8月份新收油用牡丹‘凤丹’种子中颗粒饱满、种皮色泽明亮无破裂的健康成熟种子，备用；
步骤二、使用尖嘴钳将挑选备用的牡丹种子小心去除外种皮，需保证去皮后胚乳完好无损；
步骤三、使用蒸馏水清洗去外种皮种子并浸泡24-30 h，浸泡期间可多次搅拌及清洗以完全去除内种皮；
步骤四、将浸泡后的去皮种子（要求种子种胚无破损且无内陷）带进超净工作台，用紫外灯照射25-40 min，再使用消毒液进行消毒：用无菌水涮洗2-3次，再以75%医用酒精浸泡15-20 s后无菌水涮洗2-3次，然后用0.1%的升汞浸泡6-8 min后再以无菌水涮洗4-5次，弃洗液备用；
步骤五、使用酒精灼烧并降温的镊子镊取消毒后的种子至灭菌滤纸上吸去多余水分，再用同样经酒精灼烧且降温过的手术刀沿种脐对面将胚乳切开，小心取出种胚；
步骤六、使用酒精灼烧并降温的镊子镊取健康种胚（白色或乳白色，质地厚，发育良好无破损）胚根向下接种于诱导油用牡丹‘凤丹’成熟种胚组织培养具根试管苗的初代培养基中进行诱导培养，其中诱导培养基成分如下：改良MS培养基（将基础MS培养基中CaCl2·2H2O改良为880 mg/L），蔗糖30 g/L，琼脂8 g/L，6-BA 0.5 mg/L，NAA 0.8 mg/L，活性炭3 g/L，滴加10%的NaOH水溶液调节培养基pH值至5.8-6.0；
步骤七、将接种后的培养基移至组培室组陪架进行7-10 d的暗培养随后进行正常光照培养，组培室光照强度为3000 Lx（冷光灯），光照周期为16 h/d（6:30-22:30），设置组培室环境相对湿度为85%，室内温度为25 ℃，以此条件培养4-5周后即可由油用牡丹‘凤丹’成熟种胚得到具根试管苗，实现油用牡丹‘凤丹’成熟种胚高效无菌培养体系的建立。
附图解析：
图1为实施例1、空白对照和实施例2的培养结果观测图，其中A为实施例1，B为空白对照，C为实施例2。如图所示，相较于空白对照及实施例2，实施例1所得无菌试管苗真叶叶片舒展，苗体生长茁壮；相较于空白对照及实施例1，实施例2所得具根试管苗上胚轴长势较弱，真叶生长缓慢，其胚根生长健壮。
图2为实施例1、空白对照和实施例2的培养结果数据对比统计图，其中Treatment1为实施例1，CK为空白对照，Treatment 2为实施例2。如图所示，相较于空白对照，实施例1及实施例2的萌发率（Germination Rate）均有显著提高，均达80%以上；3组污染率（Contamination Rate）均低于5%；且实施例2生根率（Rooting Rate）高达90%。
其中空白对照区别于实施例在于其培养基成分：基础MS培养基，蔗糖30 g/L，琼脂8 g/L。
需要说明的是，以上所述的实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对本发明作出的一些非本质的改进和调整仍属于本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种建立油用牡丹‘凤丹’成熟种胚无菌培养体系的方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤一、选取当年新采收的油用牡丹‘凤丹’种子中颗粒饱满、种皮色泽明亮无破裂的健康成熟种子，备用；
步骤二、使用尖嘴钳将步骤一挑选备用的油用牡丹‘凤丹’种子小心去除外种皮，保证去皮后胚乳完好无损；
步骤三、使用蒸馏水清洗经步骤二处理的去外种皮种子并浸泡24-30 h；
步骤四、将经步骤三浸泡后的去皮种子带进超净工作台，用紫外灯照射25-40 min，再使用消毒液进行消毒；所述使用消毒液消毒的步骤为：用无菌水涮洗2-3次，再用75%医用酒精浸泡15-20 s后无菌水涮洗2-3次，然后用0.1%的升汞浸泡6-8 min后再以无菌水涮洗4-5次，弃洗液；
步骤五、去除胚乳：使用镊子镊取经步骤四消毒后的种子至灭菌滤纸上吸去多余水分，再用手术刀沿种脐对面将胚乳切开，小心取出种胚；
步骤六、使用镊子镊取健康种胚胚根向下接种于诱导油用牡丹‘凤丹’成熟种胚组织培养无根试管苗的无根试管苗诱导培养基中进行诱导培养；
步骤七、将经步骤六接种后的培养基移至组培室进行5-10 d的暗培养后进行正常光照培养，组培室光照强度为2000-3000 Lx，光照周期为16 h/d，设置组培室环境相对湿度为85%-95%，室内温度为23-26 ℃，在此条件下培养4-5周后即可由油用牡丹‘凤丹’成熟种胚得到无根试管苗，实现油用牡丹‘凤丹’成熟种胚无菌培养体系的建立；
所述无根试管苗诱导培养基是由改良MS培养基、蔗糖30 g/L、琼脂8 g/L、6-BA 1 mg/L、NAA 0.8 mg/L和椰汁75g/L组成，pH值5.8-6.0；
所述改良MS培养基为将基础MS培养基配方中CaCl2·2H2O的浓度改良为880 mg/L的改良版MS培养基。
2.根据权利要求1所述的一种建立油用牡丹‘凤丹’成熟种胚无菌培养体系的方法，其特征在于：步骤三所述浸泡期间多次搅拌及清洗以去除内种皮。
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| 牡丹胚离体培养的研究;高昌勇;《安徽农业科学》;20091231;第37卷(第19期);第8844页和8865页 * |
| 观赏芍药幼胚不定芽离体诱导研究;魏冬霞等;《植物研究》;20161231;第36卷(第02期);第190-194页 * |
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| CN110476807A (zh) | 2019-11-22 |
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