CN107950394A - 一种牡丹幼胚的组织培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种牡丹幼胚的组织培养方法，包括如下步骤：1)对盛花期后30天或之后的心皮进行表面消毒，取出心皮中的种子，珠孔朝上，接种于启动培养基上，培养至出现可见胚；所述启动培养基的组成为：改良MS培养基或MS培养基+0.2～0.3mg·L^‑1BA+0.2～0.3mg·L^‑1GA；2)将所述可见胚接种于成苗培养基中培养至生出幼苗。本发明在对种子进行接种的过程中控制珠孔向上，可大大降低种子的褐化率，提高胚的形成率，而且本发明的所选用材料是盛花期后30天或之后的种子，同现有技术最早可选用盛花期后65天的种子相比，种龄大大减小，这对于牡丹远缘杂交育种及胚拯救工作有重大意义。

Description

一种牡丹幼胚的组织培养方法

技术领域

本发明属于组织培养技术领域，具体涉及一种牡丹幼胚的组织培养方法。

背景技术

牡丹(Paeonia sect.Moutan)，芍药科芍药属牡丹组的木本植物。花朵硕大，花色艳丽，气味芬芳，自古以来被称为“国色天香”、“百花之王”，深受人民喜爱。牡丹因其丰富的花色、花型、花香及深厚悠久的文化而具有极高的观赏价值，同时兼有药用、食用的经济价值。植物在受精后就开始发育。牡丹从开花授粉到种子成熟需约4个月时间，种胚发育经历游离核原胚、细胞化原胚、胚原基发生、球形、心形、马蹄形及子叶形等各个时期(成仿云.紫斑牡丹有性生殖过程研究：[博士学位论文].北京：北京林业大学，1996:1-45)。由于离体胚培养是包括在胚发生过程中，可培养不同发育时期的胚，因而一般可分为幼胚培养和成熟胚培养两种类型，他们对培养条件的要求有极大的差异。成熟胚一般指子叶期后到发育完全的胚，它的培养容易成功。幼胚是指子叶期以前的具有胚结构的幼小胚。幼胚培养在远缘杂交育种上有极大的利用价值。在进行幼胚培养时可产生下述几种情况：①胚性发育：在培养中，胚往往呈现胚性发育，即胚可增大到正常胚大小，甚至大于正常胚。②早熟萌发：未成熟胚不能继续长出成熟胚的各种结构，在培养中迅速萌发成瘦弱或畸形的幼胚。③产生愈伤组织：在胚培养中常能诱发细胞增殖而形成愈伤组织，愈伤组织大致可分为胚性愈伤组织和非愈伤组织两种类型(Raghavan V.One hundred years of zygotic embryo cultureinvestigation In Vitro Cell.Dev.Biol.-plant 2003,39；437-442)。

芍药属植物的胚培养开始于1969(Demoise C F,Partanen C R.Effects ofsubculturing and physical of medium on the nuclear behavior of a plant tissueculture.Amer.J.Bot.1969,56(2):147-152)，之后多年采用不同基因型的成熟胚及不同培养基与PGRS配比，通过三条途径获得再生植株。但关于幼胚培养的成功的案例极少：

芍药属芍药：Brukhin VB和Batygina TB(Brukhin V B,Batygina B.Embryoculture and somatic embryo genesis in culture of Paeonia anomala[J].Phytomorphology,1994,44(3-4):151-157.)用处于不同生长时期的Paeonia anomala种胚(授粉后23～45d)为外植体进行胚培养。试验发现只有选球状胚阶段之后的胚状体培养才能增殖，取自成熟种子的胚在无激素的MS和1/2MS培养基上均能形成正常的小植株，而早期鱼雷形胚和心形胚只有25％形成小植株。

芍药属牡丹：何桂梅(何桂梅.牡丹远缘杂交育种及胚培养与体细胞胚发生的研究[D].北京林业大学博士论文，2006)研究发现牡丹花后90d的近成熟胚胚最快可在5周内成苗，刚完成器官分化的早期子叶胚(约60-65d)也可很快离体培养成苗，但早期的胚珠(≤48d)便难以成活。

现有技术中，灭菌阶段便存在对心皮灭菌，污染率高，对种子灭菌，伤害外植体的难题；其次是离体的外植体及幼嫩种子的褐化问题，何桂梅发现花后48d及之前采收的种子，在15天内全部褐化死亡；而且背景技术并没有取得牡丹极早期幼胚的成活，65天后采收的种子才可成活。(何桂梅.牡丹远缘杂交育种及胚培养与体细胞胚发生的研究[D].北京林业大学博士论文，2006)

发明内容

本发明的目的是提供一种牡丹幼胚的组织培养方法，本发明的方法可将早期幼胚离体培养成功，使得离体的幼胚维持胚性生长途径，进一步的诱导成苗。本发明的方法包括如下步骤：

1)对盛花期后最早30天的心皮进行表面消毒，取出心皮中的种子，珠孔朝上，接种于启动培养基上，培养至出现可见胚；

所述启动培养基的组成为：改良MS培养基或MS培养基+0.2～0.3mg·L^-1BA+0.2～0.3mg·L^-1GA；

2)将所述可见胚接种于成苗培养基中，至培养生出幼苗；

所述改良MS培养基的组成包括：

大量元素CaCl₂·2H₂O 8800mg L^–1、KH₂PO₄ 1700mgL^–1、KNO₃19000mg L^–1、MgSO₄·7H₂O 3700mg L^–1、NH₄NO₃ 16500mg L^–1；

微量元素CoCl₂·6H₂O 5mgL^–1、CuSO₄·5H₂O 5mg L^–1、Na₂EDTA7460mg L^–1、FeSO₄·7H₂O 5560mg L^–1、H₃BO₃ 1240mgL^–1、KI 166mg L^–1、MnSO₄·H₂O 4460mgL^–1、Na₂MoO₄·2H₂O50mgL^–1、ZnSO₄·7H₂O 1720mgL^–1；

有机成分Myo-Inositol 20000mgL^–1、Nicotinic acid 100mgL^–1、Pyridoxine HCl100mgL^–1、Thiamine HCl 80mgL^–1、Glycine400mgL^–1。

本发明所述的方法，直接对心皮进行表面消毒后，在无菌操作环境中再取出种子，既降低了污染率，还减少了消毒对种子带来的伤害，在培养的过程中，采用珠孔朝上的方式放置，大大减少了种子的褐化率。通过上述的操作可使得盛花期后最早30天的种子成功培养出可见胚，与现有技术的65天相比，种龄大大减小。

本发明所述的方法，需要控制的最关键的因素是接种时珠孔的方向，启动培养基起到进一步促进的作用，本申请所述的改良MS培养基和标准的MS培养基在与本申请所述的激素进行组合后，均可成功培养，实验中发现本申请所述的改良MS培养基效果更好。

优选的，所述步骤1)中，将种子从心皮中取出时，连带部分胎座一起从心皮中取出。实现中发现，在珠孔朝上的情况下保留部分胎座，在培养的过程中可进一步降低种子的褐化率，提高可见胚的形成率。

实验操作中，将种子从心皮中取出的具体操作为，在超净工作台中用刀镊沿心皮腹缝线划开，力道合适，不接触到幼嫩种子，用手拨开心皮，连胎座一起将心皮内两侧种子整排取出到干净滤纸上，将整排种子用刀分成单个，再接到培养基中。

优选的，接种时种子插入培养基中的深度不深，立稳即可。

优选的，步骤1)中一般培养30左右至出现可见胚。

优选的，选择盛花期后40～50天的心皮。

优选的，所述成苗培养基的组成为，所述改良MS培养基或MS培养基+0.55～0.65g·L^-1AC+0.8～1.2mg·L^-1GA。

进一步优选的，所述启动培养基的组成为：所述改良MS培养基或MS培养基+0.25mg·L^-1BA+0.25mg·L^-1GA；

进一步优选的，所述启动培养基的组成为：所述改良MS培养基或MS培养基+0.6g·L^-1AC+1.0mg·L^-1GA。

优选的，所述启动培养基和成苗培养基的pH为6.0。

优选的，所述心皮表面消毒的具体操作为，将心皮用含有洗洁精的水浸泡，用刷子洗净每个心皮表层的绒毛，然后将其置于超净工作台中，在紫外灯下杀菌25～35min，翻转心皮再进行紫外灯杀菌25～35min，然后使用70％酒精处理2～4min、5％次氯酸钠处理10min，次氯酸钠重复一次处理，最后用无菌水冲洗3-4遍。

优选的，所述步骤1)中的培养条件为在温度25±4℃的暗环境中进行暗培养。

优选的，所述步骤2)中的培养条件为在温度25±4℃，光周期14h·d^-1，光强1500～2000lx的条件下进行培养。

作为优选的方案，本发明的方法包括如下步骤：

1)对盛花期后40～50天的心皮进行表面消毒，将种子连带部分胎座一起从心皮中取出，珠孔朝上，将种子接种于启动培养基上，在温度25±4℃的暗环境中进行暗培养，培养至出现可见胚；

所述启动培养基的组成为：改良MS培养基+0.25mg·L^-1BA+0.25mg·L^-1GA；

2)将所述可见胚接种于成苗培养基中，在温度25±4℃，光周期14h·d^-1，光强1500～2000lx的条件下进行培养至生出幼苗；所述成苗培养基的组成为：改良MS培养基+0.6g·L^-1AC+1.0mg·L^-1GA；

所述启动培养基和成苗培养基的pH为6.0。

本发明所述的方法具有如下有益效果：

1)本发明在对种子进行接种的过程中控制珠孔向上，同进调节启动培养基的组成，可大大降低种子的褐化率，其效果较好时甚至可控制到褐化率为0，幼胚离体培养成功，有正常的子叶分化；

进一步的，在控制珠孔向上的同时，将种子连带部分胎座从心皮中一同取出，可进一步降低褐化率，提高可见胚的形成率，效果最好时可见胚率高达87.50％。

2)本发明的所选用材料是最早可为盛花期后30天的幼胚，而现有技术中最早可选用盛花期后65天的胚，本发明的方法提前了35天，对于牡丹远缘杂交育种及胚拯救工作有重大意义。

3)本发明采用对心皮进行表面消毒，在无菌条件下直接剥离种子的方法，既可改善消毒效果，可使污染率降为18.6％，还不会因直接进行表面消毒而对种子带来伤害。

附图说明

图1图1a为接种方式珠孔朝下，带部分胎座刚接种时的状态，图1b为接种方式为珠孔朝下，带部分胎座培养10天时的状态；

图2图2a为接种方式珠孔朝下，不带胎座刚接种时的状态，图2b为珠孔朝下，不带胎座接种10天时的状态；

图3图3a为接种方式珠孔朝下、刻伤，培养15天时的状态；图3b为接种方式珠孔朝下、半切，培养15天时的状态；

图4图4a为实施例2即珠孔朝上，带部分胎座，培养30天时的状态；图4b为实施例2即珠孔朝上，带部分胎座，培养30天对种子解剖后种子的状态；

图5是按对比例1～3和对比例5培养15天后对种子进行解剖，种子内部的状态；

图6是按实施例2所述方法培养得到的幼苗；

图7是按实施例4所述方法培养得到的幼苗。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

具体实施的过程中可采用标准的MS培养基或本申请所述的改良MS培养基，实施例中以改良MS培养基为例进行说明。

实施例中涉及的改良MS培养基的配方如表1：

表1改良MS培养基的配方

实施例1

本发明涉及本发明所述的组织培养方法，包括如下步骤：

1)取盛花期后40天的“凤丹”心皮，将心皮用含有洗洁精的水浸泡，用刷子洗净每个心皮表层的绒毛，然后将其置于超净工作台中，在紫外灯下杀菌30min，翻转心皮再进行紫外灯杀菌30min，然后使用70％酒精处理3min、5％次氯酸钠处理10min，次氯酸钠重复一次处理，最后用无菌水冲洗3-4遍，得到表面消毒的心皮。

2)在超净工作台中用刀镊沿心皮腹缝线划开，力道合适，不接触到幼嫩种子，用手拨开心皮，将心皮内两侧种子整排取出到干净滤纸上，将整排种子用刀分成单个，再接到启动培养基上，每个培养瓶接种5个外植体，每个处理15个外植体，设置3个重复。所述启动培养基的组成为改良MS培养基+0.25mg·L^-1BA+0.25mg·L^-1GA，培养基的pH为6,在温度25±4℃的暗环境中培养30天左右,定期观察污染、褐化情况，30天后统计可见胚情况；

3)取出可见胚后接种于成苗培养基中进行胚成苗培养，培养条件为温度25±4℃，光周期14h·d^-1，光强1500～2000lx(荧光灯),成苗培养基的组成为改良MS+0.6g·L^-1AC+1.0mg·L^-1GA。

实施例2

与实施例1相比，其区别在于，所述步骤2)中将种子从心皮中取出时连带胎座一同取出，分开后的每颗种子上均带有部分胎座。

实施例3

与实施例1相比，其区别在于，所述步骤1)中选择盛花期后50天的心皮。

实施例4

与实施例2相比，其区别在于，所述步骤1)中选择盛花期后50天的心皮。

对比例1

与实施例2相比，其区别在于，保证每个种子珠孔端带有部分胎座，珠孔朝下，将胎座及珠孔插入培养基中；

对比例2

与实施例2相比，其区别在于，不带胎座，珠孔朝下，将种子插入培养基中。

对比例3

与实施例2相比，其区别在于，不带胎座，珠孔朝下，用组培刀将珠孔附近种皮划伤，以划破表皮为宜，将珠孔插入培养基中。

对比例4

与实施例2相比，其区别在于，不带胎座，珠孔朝下，用解剖针将珠孔刺破，以刺破珠孔为宜，将珠孔插入培养基中。

对比例5

与实施例1相比，其区别在于，不带胎座，用组培刀将种子半切，将有珠孔端珠孔朝下插入培养基中。

对比例6

与实施例2相比，其区别在于，所述成苗培养基的组成为改良MS+1.0mg·L^-1GA。

对比例7

与实施例2相比，其区别在于，所述成苗培养基的组成为改良MS+0.6mg·L^-1AC。

对比例8

与实施例2相比，其区别在于，成苗培养基的组成为改良MS+0.6g·L^-1AC+0.5mg·L^-1GA。

实验例1

接种方式对盛花期后40天的种子的影响。

如下面系列图中所示，以不同接种方式接种花后40天的幼胚种子的结果大为不同，刚开始，实施例和对比例中的幼嫩种子均为乳白色，示例如图1a、2a，除了珠孔朝上的接种方式外，在10天时其它接种方式已发生大部分褐化现象，示例如图1b、图2b；15天时除了珠孔朝上的接种方式外，其它接种方式已全部褐化，示例如图3a、图3b，解剖发现里面胚乳腐烂(图5)，而珠孔朝上接种方式的种子褐化率为0；30天时珠孔朝上接种方式的种子种皮变为蟹黄色(图4a)，解剖发现里面胚发育，肉眼可见，胚乳正常(图4b)。

实验例2

接种方式对‘凤丹’花后50天幼胚培养可见胚率的影响，如表3(实施例3和实施例4)

采用珠孔朝上带胎座和珠孔朝上不带胎座的接种方式按上述方法接种花后50天幼胚种子，30天后解剖统计可见胚率，如表3所示，珠孔朝上带胎座的可见胚率为87.50％，珠孔朝上不带胎座的可见胚率为55.00％，可见珠孔朝上带胎座是较好的幼胚培养接种方法，可培养不可见的幼胚至胚可见，且发育正常。

实验例3

幼胚最终的成苗情况：

表4 AC与GA对‘凤丹’牡丹种胚成苗的影响

由表4可见AC(活性炭)+GA对于牡丹胚培养具有积极的作用。‘凤丹’在0.6g/LAC+1.0mg/LGA处理中真叶率、平均根长、平均真叶长最高为63.88％、1.63cm、0.61cm；综合数据分析，‘凤丹’适宜浓度为0.6g/LAC+1.0mg/LGA，而在其他浓度时，其综合效果明显不如上述浓度。

图6和图7分别是实施例2和实施例4培养成功后得到的幼苗，由图6和图7可知，采用本发明所述的方法和培养基确实可得到健康成长的牡丹幼苗。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种牡丹幼胚的组织培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)对盛花期后30天或之后的心皮进行表面消毒，取出心皮中的种子，珠孔朝上，接种于启动培养基上，培养至出现可见胚；

所述启动培养基的组成为：改良MS培养基或MS培养基+0.2～0.3mg·L^-1BA+0.2～0.3mg·L^-1GA；

2)将所述可见胚接种于成苗培养基中，至培养生出幼苗；

所述改良MS培养基的组成包括：

大量元素CaCl₂·2H₂O 8800mg L^–1、KH₂PO₄ 1700mgL^–1、KNO₃ 19000mg L^–1、MgSO₄·7H₂O3700mg L^–1、NH₄NO₃ 16500mg L^–1；

微量元素CoCl₂·6H₂O 5mgL^–1、CuSO₄·5H₂O 5mg L^–1、Na₂EDTA 7460mg L^–1、FeSO₄·7H₂O5560mg L^–1、H₃BO₃ 1240mgL^–1、KI 166mg L^–1、MnSO₄·H₂O 4460mgL^–1、Na₂MoO₄·2H₂O 50mgL^–1、ZnSO₄·7H₂O 1720mgL^–1；

有机成分Myo-Inositol 20000mgL^–1、Nicotinic acid 100mgL^–1、Pyridoxine HCl100mgL^–1、Thiamine HCl 80mgL^–1、Glycine 400mgL^–1。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，将种子连带部分胎座一起从心皮中取出。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，选择盛花期后40～50天的心皮。

4.根据权利要求1～3任一项所述的方法，其特征在于，所述成苗培养基的组成为，所述改良MS培养基或MS培养基+0.55～0.65g·L^-1AC+0.8～1.2mg·L^-1GA。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述启动培养基的组成为：所述改良MS培养基或MS培养基+0.25mg·L^-1BA+0.25mg·L^-1GA；

和/或，所述成苗培养基的组成为：所述改良MS培养基或MS培养基+0.6g·L^-1AC+1.0mg·L^-1GA。

6.根据权利要求1～5任一项所述的方法，其特征在于，所述启动培养基和成苗培养基的pH均为6.0。

7.根据权利要求1或6所述的方法，其特征在于，所述心皮表面消毒的具体操作为：将心皮用含有洗洁精的水浸泡，用刷子洗净心皮表层的绒毛，然后将其置于超净工作台中，在紫外灯下杀菌25～35min，翻转心皮再进行紫外灯杀菌25～35min，然后使用70％酒精处理2～4min、5％次氯酸钠处理10min，次氯酸钠重复一次处理，最后用无菌水冲洗3-4遍。

8.根据权利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中的培养条件为温度25±4℃的暗环境。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中的培养条件为温度25±4℃，光周期14h·d^-1，光强1500～2000lx。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)对盛花期后40～50天的心皮进行表面消毒，将种子连带部分胎座一起从心皮中取出，珠孔朝上，将种子接种于启动培养基上，在温度25±4℃的暗环境中进行暗培养，培养至出现可见胚；

所述启动培养基的组成为：所述改良MS培养基+0.25mg·L^-1BA+0.25mg·L^-1GA；

2)将所述可见胚接种于成苗培养基中，在温度25±4℃，光周期14h·d^-1，光强1500～2000lx的条件下进行培养至生出幼苗；所述成苗培养基的组成为：所述改良MS培养基+0.6g·L^-1AC+1.0mg·L^-1GA；

所述启动培养基和成苗培养基的pH均为6.0。