CN112369326B - 一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及植物离体培养的技术领域，尤其是涉及一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，外植体的获取和消毒、诱导外植体形成愈伤组织、诱导愈伤组织形成不定芽、不定芽增殖以及诱导不定芽生根；其中，外植体的获取和消毒步骤中，外植体选取生长健壮且无病虫害的母株的花序轴，并对花序轴进行消毒处理，得到消毒后的外植体。本申请能够提高心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的繁殖效率，同时，降低季节对该品种生产的限制，从而促进心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的应用。

Description

一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法
技术领域
本申请涉及植物离体培养的技术领域，尤其是涉及一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法。
背景技术
心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”(Brunnera macrophylla‘Hadspen Cream’)，紫草科牛舌草属植物，多年生草本，耐半荫，在树下等荫蔽条件下生长良好，忌强光长时间直射，喜疏松排水良好的沙壤土。该植株丛生，呈半球型，自然开展；叶片为绿色卵圆状心型，叶片全缘，且叶缘浅黄色；叶面及叶背密被白色柔毛，花序轴、花梗及萼片密被糙柔毛，花期为3-5月。性喜凉爽湿润气候，不耐高温，夏季高温进入休眠。由于该品种植株具有较高的观赏价值，应用范围广泛，具备良好的市场前景，适用于林荫地花境前景布置、溪流水景配植，路边丛植，私家花园庭院栽植以及盆栽观赏。
目前，心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的最佳繁殖季节在早春，繁殖方式主要为播种繁殖和分株繁殖，繁殖效率不高。即全年除早春之外的其他时间，该品种的大规模生产受到限制。
针对上述中的相关技术，发明人认为，依赖心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”目前的繁殖方式明显限制了该品种的应用，需要找到一种新的繁殖方式，克服上述缺陷，植物组织培养是其中的一种选择。目前，国内尚未见关于心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的植物组织培养的资料，心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”在植株组织培养领域尚处于空白。
发明内容
为了提高心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的繁殖效率，同时，降低季节对该品种生产的限制，从而促进心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的应用，本申请提供一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法。
本申请提供一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，采用如下的技术方案：
一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，具体包括以下步骤：外植体的获取和消毒、诱导外植体形成愈伤组织、诱导愈伤组织形成不定芽、不定芽增殖以及诱导不定芽生根；
其中，外植体的获取和消毒步骤中，外植体选取生长健壮且无病虫害的母株的花序轴，并对花序轴进行消毒处理，得到消毒后的外植体。
通过采用上述技术方案，本申请对心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养的过程中，选择的外植体为处于母株花期且生长健壮、无病虫害的花序轴。选择合适的母株部位作为外植体来进行植物组织培养，能够直接影响心叶牛舌草组织培养的最终结果。一方面，花序轴是花序的总花梗或主轴，花序轴来源广泛、数量充足，方便取材；另一方面，花序轴细胞分裂活动旺盛，在一定程度上可提高组织培养诱导的成功率。经过试验分析，选择心叶牛舌草的花序轴作为外植体进行组织培养，较选择心叶牛舌草的小花或叶片作为外植体进行组织培养，能够有效提高心叶牛舌草外植体的消毒成功率，缩短组织培养过程中的诱导周期，提高心叶牛舌草的增殖系数和生根率，从而提高心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的繁殖效率，降低季节对该品种生产的限制，从而促进心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的应用。
在心叶牛舌草组织培养的过程中，从心叶牛舌草母株上取下的花序轴，在诱导外植体形成愈伤组织的培养基中的各类激素以及适宜的培养环境的共同作用下，诱导外植体材料进行脱分化培养，心叶牛舌草细胞脱离母株组织器官的束缚，已分化的植物组织经过诱导失去特有的结构和功能，而转变为具有分生能力的细胞，形成球状胚性愈伤组织。
以诱导出的球状胚性愈伤组织为基础，在诱导愈伤组织形成不定芽的培养基中添加适量且比例较高的细胞分裂素和生长素，对愈伤组织进行再分化培养，心叶牛舌草细胞的全能性得以充分表达，细胞分裂和分生活动旺盛，愈伤组织中的分生组织细胞重新进入有序生长和分化状态，进而形成不定芽。
将诱导形成的丛生不定芽自愈伤组织上切离下来并剥离成单株不定芽，将单株不定芽接种到诱导不定芽增殖的培养基上，单株不定芽在诱导不定芽增殖的培养基中各类激素以及培养条件的共同作用下，心叶牛舌草细胞不断进行分裂，增殖形成大量丛生不定芽。
将丛生不定芽剥离并接种至生根培养基中，诱导不定芽生根，不定芽在体内自身激素和生根培养基的共同作用下，诱导分化形成生根的小苗，从而利用花序轴作为外植体实现心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养。
进一步地，所述外植体的获取和消毒步骤中，选取的花序轴为在母株上生长20-30天的花序轴。
通过采用上述技术方案，本申请选择生长期为20-30天的花序轴，处于该生长阶段的花序轴组织细胞分裂活动旺盛、发育良好，可提高心叶牛舌草的诱导成功率。另一方面，较生长时间较长的植物器官而言，生长期为20-30天的花序轴在外界中生长的时间较短，受到外界的干扰较小，因此，在一定程度上可降低心叶牛舌草组织培养的污染率。
较生长期在20天以内的花序轴及母株其他器官，如花朵、叶片等，生长期为20-30天的花序轴组织厚实，对各类消毒剂的耐受能力较强，因此，可通过延长消毒时间来降低外植体污染率，且延长消毒时间对花序轴造成的负面影响较小，存活率明显升高。
同时，生长期为20-30天的花序轴细胞代谢活动旺盛，分裂能力强，活力较高，花序轴内各类激素浓度较高，使用较低浓度的细胞分裂素和生长素即可成功诱导出愈伤组织，可有效避免因各类激素过高引起的玻璃化及其他不良反应。另外，生长期在40天以上的花序轴出现不同程度的纤维化加重，花序轴细胞代谢活动减弱，诱导成功率显著下降，在诱导过程中需在培养基中添加较高浓度的细胞分裂素和生长素，容易造成植物生理紊乱失调，并增加了生产成本。
综上所述，本申请选择生长期为20-30天的花序轴作为外植体，来进行心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养。
进一步地，所述外植体的获取和消毒步骤中，对花序轴的消毒方式为：先用70-75％酒精消毒，再用消毒剂消毒。
通过采用上述技术方案，用酒精消毒的方式为用体积分数为70-75％酒精溶液浸泡20-30s，用重蒸水清洗2-3次，用酒精浸泡消毒后，可杀灭少量附着在材料表面的病原体，有效排除外植体表面可能附带的污染源的干扰，并可有效增加消毒剂对外植体材料表面的浸透性，进一步提高外植体消毒的成功率。95％或无水酒精会使菌体表面蛋白质快速脱水凝固，阻止了酒精的继续渗入，导致杀菌效果大大降低，因此选择70-75％的酒精对外植体消毒。
进一步地，所述外植体的获取和消毒步骤中，将酒精消毒后的花序轴于0.1％的氯化汞溶液中浸泡5-9min。
通过采用上述技术方案，氯化汞能够杀死繁殖体、亲脂性病毒等，在植物组织培养外植体消毒时，汞是高效消毒剂，对外植体携带的病原体等具有很强的杀灭作用，进一步提高外植体消毒的成功率。先用70-75％酒精消毒，再用消毒剂消毒，酒精具有较强的湿润作用，能够排除外植体表面的空气，利于消毒剂的渗入，从而提高消毒剂对外植体材料表面的浸透性，提高消毒剂的消毒效果，在酒精消毒和消毒剂消毒的配合下，提高外植体消毒的成功率。氯化汞对植物杀伤作用较大，若浸泡时间较长，植物器官的生长会受到影响，甚至会被杀死，因此，利用氯化汞对外植体消毒时要严格控制浸泡时间，经过试验，本申请中将外植体浸泡在氯化汞溶液中的时间控制在7-9min范围内。
进一步地，所述诱导外植体形成愈伤组织的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0-2.0mg/L，NAA 0.5-1.0mg/L，蔗糖25-30g/L，琼脂4-4.5g/L，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800Lux，光照时长8-10h/d。
通过采用上述技术方案，6-BA是一种常见的细胞分裂素，其主要作用是促进细胞分裂，NAA是一种广谱型植物生长调节剂，能促进细胞生长伸长及细胞分裂，诱导愈伤组织的形成。在诱导愈伤组织阶段，培养基中加入了植物生长调节剂0.5-1.0mg/L NAA，促进细胞的增殖和扩大，诱导外植体脱分化形成愈伤组织。
进一步地，所述诱导愈伤组织形成不定芽的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0-2.0mg/L，IBA 0.25-0.5mg/L，蔗糖25-30g/L，琼脂4-4.5g/L，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800Lux，光照时长8-10h/d。
通过采用上述技术方案，在经过诱导获得愈伤组织的基础上，以愈伤组织为基础诱导分化不定芽，此时加入作为细胞分裂素的6-BA和作为生长素的IBA诱导愈伤组织再分化形成不定芽，由于作为基础的不是外植体，而是外植体分化形成的愈伤组织，因此，加入1.0-2.0mg/L的6-BA和0.25-0.5mg/L的IBA，控制6-BA和IBA处于较为合适的比值，可较好的促进愈伤组织再分化形成的不定芽。
进一步地，所述不定芽增殖的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0-1.5mg/L，IBA0.25-0.5mg/L，蔗糖25-30g/L，琼脂4-4.5g/L，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800Lux，光照时长8-10h/d。
通过采用上述技术方案，将经过再分化获得的不定芽从愈伤组织上切割下来，转接不定芽增殖培养基中，以分化形成的不定芽为基础增殖不定芽，加入细胞分裂素6-BA，能够促进植物细胞的分裂和增殖，加入IBA，刺激植物生长，促进细胞增殖和扩大，因此，在不定芽增殖的培养基中加入1.0-1.5mg/L的6-BA和0.25-0.5mg/L的IBA，能够促进不定芽的增殖。
进一步地，所述诱导不定芽生根的培养基配方为：1/2MS培养基，AC 0-0.5g/L，蔗糖25-30g/L，琼脂4-4.5g/L，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800Lux，光照时长8-10h/d。
通过采用上述技术方案，将增殖的不定芽转接至诱导生根的培养基中，不定芽在生根培养基及自身合成的各类激素的共同作用下，促进增殖后的不定芽生根形成小苗，因此，在诱导不定芽生根的培养基中没有额外加入激素。另外，活性炭能够吸附不定芽的代谢产物，增强培养基的通透性。
综上所述，本申请包括以下至少一种有益技术效果：
本申请选择心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”处于母株花期且生长健壮、无病虫害的花序轴作为外植体，进行心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”植物组织培养；选择心叶牛舌草的花序轴作为外植体进行组织培养，较选择心叶牛舌草的小花或叶片作为外植体进行组织培养，能够有效提高心叶牛舌草外植体的消毒成功率，缩短组织培养过程中的诱导周期，提高心叶牛舌草的增殖系数和生根率，从而提高心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的繁殖效率，降低季节对该品种生产的限制，从而促进心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的应用。
本申请选择生长期为20-30天的花序轴作为外植体，进行心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养，花序轴组织细胞分裂活动旺盛、发育良好，可提高心叶牛舌草的诱导成功率；且花序轴生长的时间较短，受到外界的干扰较小，对各类消毒剂的耐受能力较强，可降低心叶牛舌草组织培养的污染率。
附图说明
图1是本申请中外植体诱导形成愈伤组织的示意图。
图2是本申请中愈伤组织诱导分化形成不定芽的示意图。
图3是本申请中不定芽增殖分化形成丛生不定芽的示意图。
图4是本申请中不定芽生根的示意图。
具体实施方式
本申请中用到的酒精为欧洁75％消毒酒精500mL，购自杭州欧拓普生物技术有限公司；氯化汞为购自天津市光复精细化工研究所的氯化汞标准溶液；预防性消毒剂为国光50％多菌灵，购自四川润尔科技有限公司。本申请中用到的心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”母株选自北京花乡花卉科技研究所有限公司。
本申请提供了一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，具体包括以下步骤：
1.外植体的获取和消毒
(1)母株的预培养：将母株放置于温室中培养30-60天，生长过程中及时去除枯叶病叶，并每15天喷洒一次预防性杀菌剂；
(2)外植体的获取：选择上述预培养中生长健壮、性状表现良好且无病虫害的母株，取母株上生长期为20-30天的花序，将小花全部去掉，获得花序轴；
(3)外植体的消毒：
A.将获取的花序轴放在流动的自来水下冲洗10分钟，晾干；
B.将步骤A处理后的花序轴裁剪成2-3cm的花序轴小段，于70-75％酒精中消毒30s，轻轻晃动，注意勿将花序轴折断；然后用重蒸水清洗1-2遍，每次清洗震荡2-3min；
C.将步骤B处理后的花序轴于0.1％的氯化汞溶液中浸泡5-9min；然后用重蒸水清洗3-5遍，每次震荡2-3min，轻轻晃动，注意勿将花序轴折断；
(4)将消毒后的花序轴小段的两端切除，形成1-1.5cm的花序轴小段，得到消毒后的外植体。
2.诱导外植体形成愈伤组织
将上述消毒后的外植体平铺接种到诱导愈伤组织的培养基上，诱导外植体形成愈伤组织；诱导外植体形成愈伤组织的培养基配方为：MS培养基，6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)1.0-2.0mg/L，NAA(萘乙酸)0.5-1.0mg/L，蔗糖25-30g/L，琼脂4-4.5g/L，pH值在5.8-6.0；培养温度为23-27℃，光照强度为1500-1800Lux，光照时长为8-10h/d。
3.诱导愈伤组织形成不定芽
将上述诱导形成的、与外植体一体的球状胚性愈伤组织和外植体一并转接到诱导愈伤组织形成不定芽的培养基上；
诱导愈伤组织形成不定芽的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0-2.0mg/L，IBA(吲哚丁酸)0.25-0.5mg/L，蔗糖25-30g/L，琼脂4-4.5g/L，pH值在5.8-6.0；培养温度为23-27℃，光照强度为1500-1800Lux，光照时长为8-10h/d。
4.不定芽增殖
将上述诱导形成的、与愈伤组织一体的不定芽从愈伤组织上切离，并剥离成单个的不定芽，将单个不定芽平铺接种到诱导不定芽增殖的培养基上；
诱导不定芽增殖的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0-1.5mg/L，IBA 0.25-0.5mg/L，蔗糖25-30g/L，琼脂4-4.5g/L，pH值在5.8-6.0；培养温度为23-27℃，光照强度为1500-1800Lux，光照时长为8-10h/d。
5.诱导不定芽生根
将上述增殖获得的丛生不定芽剥离成单独的不定芽，并将单个不定芽接种到诱导不定芽生根的培养基上；
诱导不定芽生根的培养基配方为：1/2MS培养基，AC(活性炭)0-0.5g/L，蔗糖25-30g/L，琼脂4-4.5g/L，pH值在5.8-6.0；培养温度为23-27℃，光照强度为1500-1800Lux，光照时长为8-10h/d。
本申请提供的心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，不仅提高了心叶牛舌草外植体的消毒成功率，而且缩短了诱导周期，提高了不定芽增殖倍率，同时，心叶牛舌草的生根效果也较好，进而提高了心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的繁殖效率，降低季节对该品种生产的限制，从而促进心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的应用。
以下结合附图以及实施例1-3、对比例1-5的相关数据的对比结果，对本发明作进一步的详细说明。
实施例
实施例1
本实施例提供了一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，具体包括以下步骤：
1.外植体的获取和消毒
(1)母株的预培养：将母株放置于温室中培养30-60天，生长过程中及时去除枯叶病叶，并每15天喷洒一次多菌灵；
(2)外植体的获取：选择上述预培养中生长健壮、性状表现良好且无病虫害的母株，取母株上生长期为20天的花序，将小花全部去掉，获得花序轴；
(3)外植体的消毒：
A.将获取的花序轴放在流动的自来水下冲洗10分钟，晾干；
B.将步骤A处理后的花序轴裁剪成2cm的花序轴小段，于75％酒精中消毒30s，轻轻晃动，注意勿将花序轴折断；然后用重蒸水清洗1遍，每次清洗震荡2min；
C.将步骤B处理后的花序轴于0.1％的氯化汞溶液中浸泡5min；然后用重蒸水清洗3遍，每次震荡2min，轻轻晃动，注意勿将花序轴折断；
(4)将消毒后的花序轴小段的两端切除，形成1cm的花序轴小段，得到消毒后的外植体。
2.诱导外植体形成愈伤组织
将上述消毒后的外植体平铺接种到诱导愈伤组织的培养基上，诱导外植体形成愈伤组织，诱导外植体形成愈伤组织的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0mg/L，NAA 0.5mg/L，蔗糖25g/L，琼脂4g/L，pH值在5.8；培养温度为23℃，光照强度为1500Lux，光照时长为8h/d。
3.诱导愈伤组织形成不定芽
将上述诱导形成的、与外植体一体的球状胚性愈伤组织和外植体一并转接到诱导愈伤组织形成不定芽的培养基上；诱导愈伤组织形成不定芽的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0mg/L，IBA 0.5mg/L，蔗糖25g/L，琼脂4g/L，pH值在5.8；培养温度为23℃，光照强度为1500Lux，光照时长为8h/d。
4.不定芽增殖
将上述诱导形成的、与愈伤组织一体的不定芽从愈伤组织上切离，并剥离成单个的不定芽，将单个不定芽平铺接种到诱导不定芽增殖的培养基上；诱导不定芽增殖的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0mg/L，IBA 0.25mg/L，蔗糖25g/L，琼脂4g/L，pH值在5.8；培养温度23℃，光照强度1500Lux，光照时长8h/d。
5.诱导不定芽生根
将上述增殖获得的丛生不定芽剥离成单独的不定芽，并将单个不定芽接种到诱导不定芽生根的培养基上；诱导不定芽生根的培养基配方为：1/2MS培养基，蔗糖25g/L，琼脂4g/L，pH值在5.8；培养温度23℃，光照强度1500Lux，光照时长8h/d。
实施例2
本实施例提供了一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，本实施例与实施例1的不同之处在于以下几点：
1.在外植体的获取和消毒步骤中：
步骤(2)外植体的获取中：选择母株生长期为25天的花序，将小花全部去掉，获得花序轴；步骤(3)外植体的消毒中：
A.将获取的花序轴放在流动的自来水下冲洗10分钟，晾干；
B.将步骤A处理后的花序轴裁剪成3cm的花序轴小段，于75％酒精中消毒30s，轻轻晃动，注意勿将花序轴折断；然后用重蒸水清洗2遍，每次清洗震荡3min；
C.将步骤B处理后的花序轴于0.1％的氯化汞溶液中浸泡7min；然后用重蒸水清洗3遍，每次震荡3min，轻轻晃动，注意勿将花序轴折断；
(4)将消毒后的花序轴小段的两端切除，形成1.5cm的花序轴小段，得到消毒后的外植体。
2.在诱导外植体形成愈伤组织步骤中：
诱导外植体形成愈伤组织的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.5mg/L，NAA 0.8mg/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在5.8；培养温度为25℃，光照强度为1800Lux，光照时长为10h/d。
3.在诱导愈伤组织形成不定芽步骤中：
诱导愈伤组织形成不定芽的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0mg/L，IBA0.25mg/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在5.8；培养温度为25℃，光照强度为1800Lux，光照时长为10h/d。
4.在不定芽增殖步骤中：
诱导不定芽增殖的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0mg/L，IBA 0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在6.0；培养温度27℃，光照强度1800Lux，光照时长10h/d。
5.在诱导不定芽生根步骤中：
诱导不定芽生根的培养基配方为：1/2MS培养基，AC 0.3g/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在5.8；培养温度23℃，光照强度1800Lux，光照时长10h/d。
其余参数和步骤均与实施例1的参数和步骤一致。
实施例3
本实施例提供了一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，本实施例与实施例2的不同之处在于以下几点：
1.在外植体的获取和消毒步骤中：
步骤(2)外植体的获取中：选择母株生长期为30天的花序，将小花全部去掉，获得花序轴；
步骤(3)外植体的消毒中：
A.将获取的花序轴放在流动的自来水下冲洗10分钟，晾干；
B.将步骤A处理后的花序轴裁剪成3cm的花序轴小段，于75％酒精中消毒30s，轻轻晃动，注意勿将花序轴折断；然后用重蒸水清洗2遍，每次清洗震荡3min；
C.将步骤B处理后的花序轴于0.1％的氯化汞溶液中浸泡9min；然后用重蒸水清洗3遍，每次震荡3min，轻轻晃动，注意勿将花序轴折断；
(4)将消毒后的花序轴小段的两端切除，形成1.5cm的花序轴小段，得到消毒后的外植体。
2.在诱导外植体形成愈伤组织步骤中：
诱导外植体形成愈伤组织的培养基配方为：MS培养基，6-BA 2.0mg/L，NAA 1.0mg/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在6.0；培养温度为27℃，光照强度为1800Lux，光照时长为10h/d。
3.在诱导愈伤组织形成不定芽步骤中：
诱导愈伤组织形成不定芽的培养基配方为：MS培养基，6-BA 2.0mg/L，IBA 0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在6.0；培养温度为27℃，光照强度为1800Lux，光照时长为10h/d。
4.在不定芽增殖步骤中：
诱导不定芽增殖的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.5mg/L，IBA 0.25mg/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在6.0；培养温度27℃，光照强度1800Lux，光照时长10h/d。
5.在诱导不定芽生根步骤中：
诱导不定芽生根的培养基配方为：1/2MS培养基，AC 0.5g/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在6.0；培养温度27℃，光照强度1800Lux，光照时长10h/d。
其余参数和步骤均与实施例2的参数和步骤一致。
对比例
对比例1
本对比例公开了一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，本对比例与实施例2的不同之处在于在诱导外植体形成愈伤组织步骤中，诱导外植体形成愈伤组织的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0mg/L，2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)0.8mg/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在5.8；培养温度为25℃，光照强度为1800Lux，光照时长为10h/d。
其余参数和步骤均与实施例2的参数和步骤一致。
对比例2
本对比例公开了一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，本对比例与实施例2的不同之处在于以下几点：
1.在诱导外植体形成愈伤组织步骤中：
诱导外植体形成愈伤组织的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0mg/L，2，4-D0.8mg/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在5.8；培养温度为25℃，光照强度为1800Lux，光照时长为10h/d。
2.在诱导愈伤组织形成不定芽步骤中：
诱导愈伤组织形成不定芽的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0mg/L，NAA0.25mg/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在5.8；培养温度为25℃，光照强度为1800Lux，光照时长为10h/d。
其余参数和步骤均与实施例2的参数和步骤一致。
对比例3
本对比例公开了一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，本对比例与实施例2的不同之处在于外植体的获取和消毒步骤中：
步骤(2)外植体的获取：选择母株生长期为20天的新生叶片，将叶片切除取粗壮叶柄；
步骤(3)外植体的消毒：
A.将获取的粗壮叶柄放在流动的自来水下冲洗10分钟，晾干；
B.将步骤A处理后的叶柄裁剪成3cm的叶柄小段，于75％酒精中消毒30s，轻轻晃动，注意勿将叶柄折断；然后用重蒸水清洗2遍，每次清洗震荡3min；
C.将步骤B处理后的叶柄于0.1％的氯化汞溶液中浸泡5min；然后用重蒸水清洗3遍，每次震荡3min，轻轻晃动，注意勿将叶柄折断；
(4)将消毒后的叶柄小段的两端切除，形成1.5cm的叶柄小段，得到消毒后的外植体。
其余参数和步骤均与实施例2的参数和步骤一致。
对比例4
本对比例公开了一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，本对比例与实施例2的不同之处在于外植体的获取和消毒步骤中：
步骤(2)外植体的获取：选择母株生长期为30天的花序，将开放的小花自花序上切除；
步骤(3)外植体的消毒：
A.将获取的小花放在流动的自来水下冲洗10分钟，晾干；
B.将步骤A处理后的小花于75％酒精中消毒30s，轻轻晃动；然后用重蒸水清洗2遍，每次清洗震荡3min；
C.将步骤B处理后的小花于0.1％的氯化汞溶液中浸泡4min；然后用重蒸水清洗3遍，每次震荡3min，轻轻晃动；
当外植体为小花时，未能获得消毒后的外植体，小花全部死亡，无法展开后续工作。
对比例5
本对比例公开了一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，本对比例与实施例2的不同之处在于：
1.在外植体的获取和消毒步骤中：
步骤(2)外植体的获取：选择母株生长期为25天的叶片，将叶柄去除，留叶片；
步骤(3)外植体的消毒：
A.将获取的叶片放在流动的自来水下冲洗10分钟，晾干；
B.将步骤A处理后的叶片于75％酒精中消毒30s，轻轻晃动，注意勿将叶片弄破；然后用重蒸水清洗2遍，每次清洗震荡3min；
C.将步骤B处理后的叶片于0.1％的氯化汞溶液中浸泡5min；然后用重蒸水清洗3遍，每次震荡3min，轻轻晃动；
(4)将消毒后的叶片切割成2cm2的小块，得到消毒后的外植体。
2.在诱导外植体形成愈伤组织步骤中：
诱导外植体形成愈伤组织的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0mg/L，2，4-D0.8mg/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在5.8；培养温度为25℃，光照强度为1800Lux，光照时长为10h/d。
3.在诱导愈伤组织形成不定芽步骤中：
诱导愈伤组织形成不定芽的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0mg/L，IBA 0.5mg/L，蔗糖30g/L，琼脂4.5g/L，pH值在5.8；培养温度为25℃，光照强度为1800Lux，光照时长为10h/d。
其余参数和步骤均与实施例2的参数和步骤一致。
检测试验
利用上述实施例1-3和对比例1-5的植物组织培养方法对心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”进行培养，并记录培养过程中心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的污染率和死亡率，并在植物组织培养的各个阶段记录相应的考察参数，结果见表1，具体为：在诱导外植体形成愈伤组织阶段，记录心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的出愈率和出愈时间；在诱导愈伤组织形成不定芽阶段，记录心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的诱导率和诱导时间；在不定芽增殖阶段，记录心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的增殖系数；在诱导不定芽生根阶段，记录心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的生根率。植物组织培养过程中外植体的消毒效果、愈伤组织质量以及诱导愈伤组织形成不定芽的情况见表2。
表1利用实施例1-3和对比例1-5进行组织培养获得的结果(一)
Figure BDA0002762403600000121
表2利用实施例1-3和对比例1-5进行组织培养获得的结果(二)
Figure BDA0002762403600000122
Figure BDA0002762403600000131
结合实施例1-3以及对比例1-5的组织培养方法以及表1、表2所示的内容，本申请选择母株上生长了20-30天的花序轴作为外植体，同时在各组织培养阶段选择合适的培养基配方和培养条件，进行心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养，不仅提高了心叶牛舌草外植体的消毒成功率，而且缩短了诱导周期，提高了不定芽增殖倍率，同时，心叶牛舌草的生根效果较好，进而提高了心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的繁殖效率，降低季节对该品种生产的限制，从而促进心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的应用。
首先，在心叶牛舌草组织培养的过程中，选择合适的母株部位作为外植体来进行植物组织培养，能够直接影响心叶牛舌草组织培养的最终结果。通过实施例1-3与对比例1-5的对比可知，本申请提供的组织培养方法能够有效降低植物组织培养过程中心叶牛舌草的污染率和死亡率，提高心叶牛舌草的出愈率和诱导率，缩短心叶牛舌草的出愈时间和诱导时间，同时还能够有效提高心叶牛舌草的增殖系数和生根率。
在本申请中，实施例1-3的组织培养方法中均选择母株的花序轴作为外植体，对比例3与实施例2的不同之处在于选择的外植体是母株上生长20天的新生叶片，通过实施例2和对比例3的数据对比可知，在相同条件下，选择花序轴作为外植体，死亡率更低，并且明显缩短了出愈时间和诱导时间，同时提高了不定芽的增殖系数。
对比例4与实施例2的不同之处在于选择的外植体是生长在母株花序上的小花，对比例4未能成功诱导出不定芽，通过实施例2和对比例4的对比可知，花序轴较小花更适合做为心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养的外植体。
对比例5与实施例2的不同之处在于在选择母株上生长了25天的叶片作为外植体的基础上，还将诱导外植体形成愈伤组织的培养基配方中的NAA换成了2，4-D，通过实施例2与对比例6的对比可知，选择花序轴作为外植体较选择生长了25天的新生叶片作为外植体而言，外植体的死亡率低，同时缩短了出愈周期和诱导周期，提高了不定芽的增殖系数。可见外植体的选择对植物组织培养的效果影响较大，选择合适的母株部位作为外植体来进行植物组织培养，能够提高心叶牛舌草组织培养的效果。
另外，心叶牛舌草组织培养各阶段选择的培养基配方和培养条件也能够影响心叶牛舌草组织培养的结果。实施例1-3的组织培养方法中均选择母株的花序轴作为外植体，对比例1与实施例2的不同之处在于诱导外植体形成愈伤组织的培养基配方中的NAA换成2，4-D，通过实施例1-3和对比例1的对比可知，诱导外植体形成愈伤组织的培养基配方中含有NAA时，虽然实施例1-3外植体形成愈伤组织的时间较长，但实施例1-3诱导形成的愈伤组织质量明显优于对比例1诱导形成的愈伤组织质量，同时还提高不定芽的增殖系数。
对比例2与实施例2的不同之处在于不仅在诱导外植体形成愈伤组织的培养基配方中的NAA换成2,4-D，而且在诱导愈伤组织形成不定芽的培养基配方中将IBA替换为NAA，通过实施例1-3以及对比例1、对比例2的数据对比可知，IBA在诱导愈伤组织形成不定芽的过程中起到了NAA无法替代的作用。
通过上述实施例1-3和对比例1-2的对比可知，利用本申请提供的组织培养方法培养心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”，并且利用本申请提供的各组织培养阶段的培养基配方和培养条件对心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”进行组织培养，能够提高心叶牛舌草的不定芽增殖倍率和生根率，缩短培养过程中的诱导周期，从而提高了心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的繁殖效率，降低季节对心叶牛舌草生产的限制。
另外，通过实施例1-3的对比可知，消毒时长对外植体的消毒效果有较大的影响，选择合适的外植体消毒时长对心叶牛舌草的组织培养效果有较大影响。参考表1和表2，本申请中利用氯化汞对外植体进行消毒时，将消毒时长控制在5-9min内，消毒后外植体表现正常，但会影响组织培养过程中的污染率和死亡率。当消毒时长较长时，组织培养过程中的污染率越低，消毒效果较佳，但会导致外植体死亡率升高，表明外植体不能长时间处于氯化汞溶液中；当消毒时间越短时，外植体基本不会死亡，但外植体的污染率显著升高，显然低于消毒时间较长时的消毒效果。因此，本申请最终将外植体的消毒时长控制在5-9min的范围内，最佳的消毒时长为7min。
综上所述，本申请提供的心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，不仅提高了心叶牛舌草外植体的消毒成功率，而且缩短了诱导周期，提高了不定芽增殖倍率，同时，心叶牛舌草的生根效果也较好，进而提高了心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的繁殖效率，降低季节对该品种生产的限制，从而促进心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的应用。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (4)

1.一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，其特征在于，具体包括以下步骤：外植体的获取和消毒、诱导外植体形成愈伤组织、诱导愈伤组织形成不定芽、不定芽增殖以及诱导不定芽生根；
其中，外植体的获取和消毒步骤中，外植体选取生长健壮且无病虫害的母株的花序轴，并对花序轴进行消毒处理，得到消毒后的外植体；
所述诱导外植体形成愈伤组织的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0-2.0mg/L，NAA0.5-1.0mg/L，蔗糖 25-30g/L，琼脂4-4.5g/L，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800Lux，光照时长8-10h/d；
所述诱导愈伤组织形成不定芽的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0-2.0mg/L，IBA0.25-0.5mg/L，蔗糖 25-30g/L，琼脂4-4.5g/L，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800Lux，光照时长8-10h/d；
所述不定芽增殖的培养基配方为：MS培养基，6-BA 1.0-1.5mg/L，IBA 0.25-0.5mg/L，蔗糖 25-30g/L，琼脂4-4.5g/L，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800Lux，光照时长8-10h/d；
所述诱导不定芽生根的培养基配方为：1/2 MS培养基，AC 0-0.5g/L，蔗糖25-30g/L，琼脂4-4.5g/L，pH值在5.8-6.0；培养温度23-27℃，光照强度1500-1800Lux，光照时长8-10h/d。
2.根据权利要求1所述的一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，其特征在于：所述外植体的获取和消毒步骤中，选取的花序轴为在母株上生长20-30天的花序轴。
3.根据权利要求2所述的一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，其特征在于，所述外植体的获取和消毒步骤中，对花序轴的消毒方式为：先用70-75%酒精消毒，再用消毒剂消毒。
4.根据权利要求3所述的一种心叶牛舌草“哈德斯本冰淇淋”的组织培养方法，其特征在于：所述外植体的获取和消毒步骤中，将酒精消毒后的花序轴于0.1%的氯化汞溶液中浸泡5-9min。
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