CN113170729A - 一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生及遗传转化体系的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生及遗传转化体系的构建方法，属于生物技术领域。本发明通过研究赤霉素浓度对幼胚萌发的影响以及活性炭和IBA对幼胚生根影响，建立一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生的方法。在建立牡丹幼胚离体快速再生体系的基础上，探究了遗传转化体系最佳条件，建立了农杆菌介导的直接侵染幼胚遗传转化体系，为利用基因工程技术开展牡丹品种改良奠定了一定的基础。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生及遗传转化体系的构建方法。
背景技术
牡丹是我国常用的观赏和药用植物。其中牡丹籽、牡丹花、牡丹皮均具有较高的应用价值。‘凤丹’牡丹更是因其种子油脂中含有较高的α-亚麻酸，是研究木本油料作物脂肪酸代谢积累的良好材料。但是由于‘凤丹’存在再生困难、遗传背景不清楚等问题，导致‘凤丹’遗传转化体系不成熟，使其在遗传育种改良方面的应用受到一定限制。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高效的‘凤丹’牡丹幼胚离体再生的建立方法，使‘凤丹’牡丹幼苗具有萌发快、幼苗长势壮的特点。
本发明的目的还在于提供一种‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系的构建方法，具有较高的转化率。
本发明提供了一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生的建立方法，包括以下步骤：
1)‘凤丹’牡丹幼胚接种于幼胚萌发培养基上萌发培养，得萌发幼胚；
所述幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：27～33g/L葡萄糖、14～18g/L琼脂浓度、2.8～3.2mg/L GA3和0.23～0.27mg/L NAA，pH值为5.8～6.0；
2)将所述萌发幼胚接种至幼胚生根培养基上进行光照培养，得到‘凤丹’牡丹植株；
所述幼胚生根培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：0.45～0.55mg/L GA3、0.45～0.55mg/L IBA和0.09～0.11mg/L活性炭。
优选的，所述幼胚萌发培养基还包括以下含量的组分：30g/L葡萄糖、16g/L琼脂浓度、3.0mg/L GA3和0.25mg/LNAA，pH值为5.8。
优选的，所述萌发培养的温度为20～25℃，所述萌发培养的时间为25～32d。
优选的，所述幼胚生根培养基还包括以下含量的组分：0.5mg/L GA3、0.5mg/LIBA和0.1mg/L活性炭。
优选的，所述光照培养的温度20～25℃，所述光照培养的时间为28～32d，所述光照培养的光强为6000～8000Lx。
优选的，所述‘凤丹’牡丹幼胚来自当年开花后90d种子。
本发明提供了一种‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系的构建方法，包括以下步骤：
A.将含目标基因的植物表达载体转化农杆菌中，依次经筛选培养和扩大培养后，收集菌体，用含有乙酰丁香酮的MS液体培养基悬浮所述菌体，得到农杆菌侵染液；
所述含有乙酰丁香酮的MS液体培养基中乙酰丁香酮的终浓度为250～350μmol/L；
B.以幼胚萌发培养基上培养7～8d的幼胚为材料，用所述农杆菌侵染液侵染所述幼胚8～12min，将侵染后的幼胚在共培养培养基上共培养3～5d，得到共培养幼胚；
所述幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：27～33g/L葡萄糖、14～18g/L琼脂浓度、2.8～3.2mg/L GA3和0.23～0.27mg/L NAA，pH值为5.8～6.0；
C.将所述共培养幼胚在筛选培养基经筛选培养，得到‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系。
优选的，步骤A中所述含有乙酰丁香酮的MS液体培养基中乙酰丁香酮的终浓度为300μmol/L；
步骤B中所述侵染的时间为10min；所述共培养的时间为4d。
优选的，步骤C中所述筛选培养基是以所述幼胚萌发培养基为基础培养基，还包含终浓度为40～60mg/L的潮霉素。
优选的，步骤B中共培养培养基为幼胚萌发培养基。
本发明提供的‘凤丹’牡丹幼胚离体再生的建立方法，与自然环境下凤丹种子首先解除下胚轴限制，遇到适当时机再打破上胚轴休眠，突破种皮限制形成幼苗的萌发机制不同，离体幼胚萌发首先通过上胚轴长出两片真叶，然后才通过下胚轴长根，通过在萌发培养基中适当添加2.8～3.2mg/L GA3和0.23～0.27mg/LNAA，不仅能明显促进幼胚萌动，而且幼苗茎部粗壮，不易倒伏。与种子在自然环境下萌发的最适赤霉素浓度相差100倍以上，这可能是由于去除了种皮的限制导致的；同时在生根培养过程中，在生根培养基中添加0.45～0.55mg/L GA3、0.45～0.55mg/L IBA和0.09～0.11mg/L活性炭，有利于使子叶展开和胚根长成时间明显提前，种胚生长正常。采用本发明提供的方法，使幼胚萌发整个过程只需要两个月，较传统的种子萌发时间缩短2～3个月，而且幼苗胚根有明显增长，生根率高达60％以上，有真叶长出，主茎较粗。
本发明提供的‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系的构建方法，本发明以离体的幼胚为初始材料，在萌发培养基上生长一段时间后，采用含有目标基因的农杆菌侵染，通过严格控制乙酰丁香酮浓度250～350μmol/L、侵染时间8～12min以及共培养时间3～5d，使遗传转化体系的转化率高达20％以上，同时得到的遗传转化体系具有生长能力强的特点。
进一步的，本发明还限定了幼胚在筛选培养基上培养时，还添加了潮霉素，探究‘凤丹’幼胚对潮霉素的敏感性；结果表明潮霉素浓度对存活率影响显著，潮霉素浓度越高越容易对幼胚造成损伤最终导致褐化，而在含有低浓度潮霉素(12.5mg/L和25mg/L)的培养基中虽然幼胚存活率高但会增加假阳性和农杆菌污染的机率。添加终浓度40～60mg/L的潮霉素进行幼胚筛选，有利于提高幼胚存活率的同时减少假阳性和农杆菌的污染机率。
附图说明
图1为赤霉素浓度对幼胚萌发的影响柱形图；
图2为‘凤丹’牡丹种子幼胚直接再生幼苗过程；
图3为‘凤丹’离体幼胚遗传转化体系，其中A：80d种子；B：离体幼胚；C：GUS染色后的萌发幼胚；D：茎叶GUS染色；
图4为潮霉素浓度对幼胚存活率影响柱形图。
具体实施方式
本发明提供了一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生的建立方法，包括以下步骤：
1)‘凤丹’牡丹幼胚接种于幼胚萌发培养基上萌发培养，得萌发幼胚；
所述幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：27～33g/L葡萄糖、14～18g/L琼脂浓度、2.8～3.2mg/L GA3和0.23～0.27mg/L NAA，pH值为5.8～6.0；
2)将所述萌发幼胚接种至幼胚生根培养基上进行光照培养，得到‘凤丹’牡丹植株；
所述幼胚生根培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：0.45～0.55mg/L GA3、0.45～0.55mg/L IBA和0.09～0.11mg/L活性炭。
本发明提供的‘凤丹’牡丹幼胚离体再生的过程见图2。
本发明‘凤丹’牡丹幼胚接种于幼胚萌发培养基上萌发培养，得萌发幼胚；所述幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：27～33g/L葡萄糖、14～18g/L琼脂浓度、2.8～3.2mg/L GA3和0.23～0.27mg/L NAA，pH值为5.8～6.0。
在本发明中，所述‘凤丹’牡丹幼胚优选来自当年开花后90d种子。低于90d萌发率会有所降低，高于90d不好分离幼胚，幼胚容易受到损伤。
在本发明中，在接种时优选每瓶接种5～8个幼胚。所述幼胚萌发培养基优选包括以下含量的组分：30g/L葡萄糖、16g/L琼脂浓度、3.0mg/L GA3和0.25mg/LNAA，pH值为5.8。实验表明在萌发培养基上添加少量GA3(赤霉素)就可以明显促进幼胚萌动，高浓度GA3条件下生长的幼胚，茎较高但细弱，容易倒伏，而GA3浓度过低导致幼胚生长缓慢，萌发率低；本发明将3.0mg/LGA3和0.25mg/LNAA配合，比与其他植物激素组合，有利于大大提高了萌发速度。所述萌发培养的温度优选为20～25℃，更优选为23℃。所述萌发培养的时间优选为25～32d，更优选为30d。
得到萌发幼胚后，本发明将所述萌发幼胚接种至幼胚生根培养基上进行光照培养，得到‘凤丹’牡丹植株；所述幼胚生根培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：0.45～0.55mg/L GA3、0.45～0.55mg/L IBA和0.09～0.11mg/L活性炭。
在本发明中，所述幼胚生根培养基优选包括以下含量的组分：0.5mg/L GA3、0.5mg/L IBA和0.1mg/L活性炭。实验表明，在生根培养基中添加有活性肽(AC)，有利于胚根长成时间明显提前，添加IBA有利于幼胚的子叶展开，同时添加活性肽、IBA和GA3，有利于提高生根率，保证种胚生长正常。
在本发明中，所述光照培养的温度优选20～25℃，更优选为23℃。所述光照培养的时间优选为28～32d，更优选为30d。所述光照培养的光强优选为6000～8000Lx，更优选为7000Lx。
自然环境下凤丹种子首先解除下胚轴限制，遇到适当时机再打破上胚轴休眠，突破种皮限制，形成幼苗。与自然环境下种子萌发过程不同，离体幼胚萌发首先通过上胚轴长出两片真叶，然后才通过下胚轴长根。整个过程只需要两个月，较传统的种子萌发时间缩短2～3个月。而且由于去除了种皮的限制，幼胚直接吸收赤霉素，使构建幼胚再生体系时，赤霉素的含量降低100多倍。
本发明提供了一种‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系的构建方法，包括以下步骤：
A.将含目标基因的植物表达载体转化农杆菌中，依次经筛选培养和扩大培养后，收集菌体，用含有乙酰丁香酮的MS液体培养基悬浮所述菌体，得到农杆菌侵染液；
所述含有乙酰丁香酮的MS液体培养基中乙酰丁香酮的终浓度为250～350μmol/L；
B.以幼胚萌发培养基上培养7～8d的幼胚为材料，用所述农杆菌侵染液侵染所述幼胚8～12min，将侵染后的幼胚在共培养培养基上共培养3～5d，得到共培养幼胚；
所述幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：27～33g/L葡萄糖、14～18g/L琼脂浓度、2.8～3.2mg/L GA3和0.23～0.27mg/L NAA，pH值为5.8～6.0；
C.将所述共培养幼胚在筛选培养基经筛选培养，得到‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系。
本发明提供了一种‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系的各阶段形态见图3。
本发明将含目标基因的植物表达载体转化农杆菌中，依次经筛选培养和扩大培养后，收集菌体，用含有乙酰丁香酮的MS液体培养基悬浮所述菌体，得到农杆菌侵染液；所述含有乙酰丁香酮的MS液体培养基中乙酰丁香酮的终浓度为250～350μmol/L。
在本发明中，对含目标基因的植物表达载体的构建方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的构建方法即可。本发明对所述转化的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的转化方法即可。所述筛选培养优选采用含有Kan 50mg/L、Rif50 mg/L的LB培养基进行。所述扩大培养优选采用LB培养基进行。所述收集菌体的方法优选采用离心的方法进行。所述离心的转速优选为6000rpm/min；所述离心的时间优选为10min。
在本发明中，所述含有乙酰丁香酮的MS液体培养基中乙酰丁香酮的终浓度优选为300μmol/L。所述乙酰丁香酮的含量不仅能影响转化效果还能对幼胚的活力产生影响。实验表明，低浓度的乙酰丁香酮造成幼胚的转化率低，而浓度高对幼胚产生伤害导致生长停止和农杆菌污染。本发明所述限定的乙酰丁香酮浓度得到较高的阳性转化率。
本发明以幼胚萌发培养基上培养7～8d的幼胚为材料，用所述农杆菌侵染液侵染所述幼胚8～12min，将侵染后的幼胚在共培养培养基上共培养3～5d，得到共培养幼胚；
所述幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：27～33g/L葡萄糖、14～18g/L琼脂浓度、2.8～3.2mg/L GA3和0.23～0.27mg/L NAA，pH值为5.8～6.0。
在本发明中，所述幼胚优选来自开花后80d种子。所述种子优选采集后置于4℃条件下保藏。低于80d的种子，分离的幼胚萌发率会有所降低；高于80d的种子，不好分离幼胚。
在本发明中，在幼胚萌发培养基上培养幼胚7～8d，有利于打破休眠，促进幼胚萌发。
在本发明中，所述侵染的时间优选为10min。实验表明，幼胚随着侵染时间的延长，可能受农杆菌侵染程度的影响越大，过长时间侵染会使幼胚失去活性；而侵染时间过短侵染率低。侵染8～12min条件下，幼胚伤害较小，幼胚生长正常，阳性率达到20％以上。
在本发明中，所述共培养培养基优选为上述幼胚萌发培养基。所述共培养的时间优选为4d。过长时间的共培养容易降低外植体转化率，同时不仅在后续的培养基上造成幼胚污染严重，而且共培养之后外植体的生长能力变弱。培养3～5d尤其是培养4d的外植体转化率最高，达到23％。
得到共培养幼胚后，本发明将所述共培养幼胚在筛选培养基经筛选培养，得到‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系。
在本发明中，所述筛选培养基优选是以所述幼胚萌发培养基为基础培养基，还包含终浓度为40～60mg/L的潮霉素。结果表明，霉素浓度对存活率影响显著。潮霉素浓度越高越容易对幼胚造成损伤最终导致褐化，而在含有低浓度潮霉素(12.5mg/L和25mg/L)的培养基中虽然幼胚存活率高但会增加假阳性和农杆菌污染的机率。
在本发明中，得到遗传转化体系后，还优选进行转基因阳性苗的鉴定。所述鉴定方法以目标基因为对象进行鉴定。为了举例说明，鉴定方法，本发明实施例以目标基因为GUS基因为例加以说明，幼苗进行GUS染色鉴定，通过各组分中染色结果判断转基因阳性苗。
下面结合实施例对本发明提供的一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生及遗传转化体系的构建方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生的建立方法，包括以下步骤：
1)将开花后90d的‘凤丹’牡丹幼胚接种于幼胚萌发培养基上萌发培养，每瓶接种8个幼胚，每10瓶培养基为一组，共设置3组，得萌发幼胚；其中幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：27g/L葡萄糖、18g/L琼脂浓度、2.8mg/L GA3和0.27mg/LNAA，pH值为5.8；生长20d后观察幼胚的生长情况，统计各组的萌发率，计算平均值。
2)将培养30d的萌发幼胚接种至幼胚生根培养基上进行在光照强度为6000Lx下光照培养30d，得到‘凤丹’牡丹植株；幼胚生根培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：0.45mg/L GA3、0.55mg/L IBA和0.09mg/L活性炭。
观察‘凤丹’牡丹植株的胚根和真叶生长情况，统计三组‘凤丹’牡丹植株的生根率。
胚根有明显增长，有侧根长出，有真叶长出，主茎较粗。‘凤丹’牡丹植株的生根率为59.37％。
实施例2
一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生的建立方法，包括以下步骤：
1)将开花后90d的‘凤丹’牡丹幼胚接种于幼胚萌发培养基上萌发培养，每瓶接种8个幼胚，每10瓶培养基为一组，共设置3组，得萌发幼胚；其中幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：33g/L葡萄糖、14g/L琼脂浓度、3.2mg/L GA3和0.23mg/LNAA，pH值为6.0；生长20d后观察幼胚的生长情况，统计各组的萌发率，计算平均值。
2)将得到的萌发幼胚接种至幼胚生根培养基上进行在光照强度为8000Lx下光照培养30d，得到‘凤丹’牡丹植株；幼胚生根培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：0.55mg/L GA3、0.45mg/L IBA和0.11mg/L活性炭。
观察‘凤丹’牡丹植株的胚根和真叶生长情况，统计三组‘凤丹’牡丹植株的生根率。
胚根有明显增长，有侧根长出，有真叶长出，主茎较粗。‘凤丹’牡丹植株的生根率为62.33％。
实施例3
一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生的建立方法，包括以下步骤：
1)将开花后90d的‘凤丹’牡丹幼胚接种于幼胚萌发培养基上萌发培养，每瓶接种8个幼胚，每10瓶培养基为一组，共设置3组，得萌发幼胚；其中幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：30g/L葡萄糖、16g/L琼脂浓度、3.0mg/L GA3和0.25mg/LNAA，pH值为5.8；生长20d后观察幼胚的生长情况，统计各组的萌发率，计算平均值。
2)将得到的萌发幼胚接种至幼胚生根培养基上进行在光照强度为7000Lx下光照培养30d，得到‘凤丹’牡丹植株；幼胚生根培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：0.50mg/L GA3、0.50mg/L IBA和0.1mg/L活性炭。
观察‘凤丹’牡丹植株的胚根和真叶生长情况，统计三组‘凤丹’牡丹植株的生根率。
胚根有明显增长，有侧根长出，有真叶长出，主茎较粗。‘凤丹’牡丹植株的生根率为65.07％。
对比例1
采用实施例3的方法建立‘凤丹’牡丹幼胚离体再生，不同之处在于0.5mg/L GA3、1.0mg/L GA3、2.0mg/L GA3或4.0mg/L GA3替换3.0mg/L GA3。统计萌发率。
结果见图1。
通过在添加有不同浓度赤霉素的培养基上生长20d后观察幼胚的生长情况，由表可知，添加少量赤霉素就可以明显促进幼胚萌动，高浓度赤霉素条件下生长的幼胚，茎较高但细弱，容易倒伏。浓度过低幼胚生长缓慢，萌发率低(图1)。3mg/L赤霉素为幼胚萌发最佳浓度，与种子在自然环境下萌发的最适赤霉素浓度相差100倍以上，这可能是由于去除了种皮的限制，幼胚直接吸收赤霉素造成的。
与自然环境下种子萌发过程不同，自然环境下凤丹种子首先解除下胚轴限制，遇到适当时机再打破上胚轴休眠，突破种皮限制，形成幼苗。而离体幼胚萌发首先通过上胚轴长出两片真叶，然后才通过下胚轴长根。整个过程只需要两个月，较传统的种子萌发时间缩短2-3个月。
对比例2
采用实施例3的方法建立‘凤丹’牡丹幼胚离体再生，不同之处在于生根培养基不同，生根培养基的配方见表1。
表1不同组分的生根培养基
不同生根培养基对幼苗生根及真叶影响结果见表2。
表2活性炭和IBA对幼胚生根的影响
实施例4
一种‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系的构建方法，包括以下步骤：
A.将含GUS基因的植物表达载体转化农杆菌中，取200μL接种20mL LB液体培养基中，培养基中含有Kan 50mg/L、Rif50 mg/L，28℃条件下振荡培养过夜。吸取2mL菌液放入50mL LB液体培养基中，相同条件培养9h；将无菌条件下得到的菌液，6000rpm/min离心10min，弃上清，菌体用含有终浓度为300μmol/L乙酰丁香酮(AS)的MS液体培养基悬浮。
B.以幼胚萌发培养基上培养7d的幼胚为材料，用所述农杆菌侵染液侵染所述幼胚10min，将侵染后的幼胚在共培养培养基上在23℃条件下共培养4d，得到共培养幼胚；幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：30g/L葡萄糖、16g/L琼脂浓度、3.0mg/L GA3和0.25mg/L NAA，pH值为5.8；共培养培养基为实施例3中幼胚萌发培养基；
C.将所述共培养幼胚在筛选培养基经筛选培养，得到‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系，其中筛选培养基为添加有50mg/L潮霉素的幼胚萌发培养基。
D.检测和统计，将筛选培养基中成活的幼胚置于GUS染色液中，25℃过夜孵化，再用75％酒精洗脱两次，置于显微镜下观察，统计带有蓝色的幼胚和茎叶。三组重复试验，每组侵染50个幼胚。遗传转化效率(％)＝有目的表型的幼胚数/总幼胚数。
结果表明，利用该转化体系，可以获得成功转入外源基因的牡丹阳性苗，转化率达23％。
实施例5
一种‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系的构建方法，包括以下步骤：
A.将含GUS基因的植物表达载体转化农杆菌中，取200μL接种20mL LB液体培养基中，培养基中含有Kan 50mg/L、Rif50 mg/L，28℃条件下振荡培养过夜。吸取2mL菌液放入50mL LB液体培养基中，相同条件培养9h；将无菌条件下得到的菌液，6000rpm/min离心10min，弃上清，菌体用含有终浓度为250～350μmol/L乙酰丁香酮(AS)的MS液体培养基悬浮。
B.以幼胚萌发培养基上培养8d的幼胚为材料，用所述农杆菌侵染液侵染所述幼胚8min，将侵染后的幼胚在共培养培养基上在23℃条件下共培养5d，得到共培养幼胚；幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：27g/L葡萄糖、18g/L琼脂浓度、2.8mg/L GA3和0.27mg/L NAA，pH值为5.8；共培养培养基为实施例3中幼胚萌发培养基；
C.将所述共培养幼胚在筛选培养基经筛选培养，得到‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系，其中筛选培养基为添加有60mg/L潮霉素的幼胚萌发培养基。
D.检测和统计，将筛选培养基中成活的幼胚置于GUS染色液中，25℃过夜孵化，再用75％酒精洗脱两次，置于显微镜下观察，统计带有蓝色的幼胚和茎叶。三组重复试验，每组侵染60个幼胚。遗传转化效率(％)＝有目的表型的幼胚数/总幼胚数。
结果表明，利用该转化体系，可以获得成功转入外源基因的牡丹阳性苗，转化率达21％。
实施例6
一种‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系的构建方法，包括以下步骤：
A.将含GUS基因的植物表达载体转化农杆菌中，取200μL接种20mL LB液体培养基中，培养基中含有Kan 50mg/L、Rif50 mg/L，28℃条件下振荡培养过夜。吸取2mL菌液放入50mL LB液体培养基中，相同条件培养9h；将无菌条件下得到的菌液，6000rpm/min离心10min，弃上清，菌体用含有终浓度为250～350μmol/L乙酰丁香酮(AS)的MS液体培养基悬浮。
B.以幼胚萌发培养基上培养7d的幼胚为材料，用所述农杆菌侵染液侵染所述幼胚12min，将侵染后的幼胚在共培养培养基上在23℃条件下共培养3d，得到共培养幼胚；幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：33g/L葡萄糖、14g/L琼脂浓度、3.2mg/L GA3和0.23mg/L NAA，pH值为6.0；共培养培养基为实施例3中幼胚萌发培养基；
C.将所述共培养幼胚在筛选培养基经筛选培养，得到‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系，其中筛选培养基为添加有40mg/L潮霉素的幼胚萌发培养基。
D.检测和统计，将筛选培养基中成活的幼胚置于GUS染色液中，25℃过夜孵化，再用75％酒精洗脱两次，置于显微镜下观察，统计带有蓝色的幼胚和茎叶。三组重复试验，每组侵染55个幼胚。遗传转化效率(％)＝有目的表型的幼胚数/总幼胚数。
结果表明，利用该转化体系，可以获得成功转入外源基因的牡丹阳性苗，转化率达22.4％。
对比例3
采用实施例4的方法构建‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系，不同之处在于乙酞丁香酮(AS)浓度100μmol/L、200μmol/L、400μmol/L和500μmol/L替换300μmol/L。观察得到的遗传转化体系幼苗生长情况及统计转化率。
结果发现，100μmol浓度的乙酞丁香酮(AS)对转化效果不好，转化率低；400μmol和500μmol的AS浓度对幼胚产生伤害导致生长停止和农杆菌污染；而侵染液中AS最佳浓度为300μmol，后期通过GUS染色检测阳性率最高。
对比例4
采用实施例4的方法构建‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系，不同之处在于共培养时间2d、8d和16d分别替换4d。观察得到的遗传转化体系幼苗生长情况及统计转化率。
结果表明，共培养6d和8d的外植体转化率最低，且在后续的培养基上幼胚污染严重，转化率仅为9％，共培养之后外植体的生长能力变弱。表明共培养4d为最佳共培养时间。
对比例5
采用实施例4的方法构建‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系，不同之处在于侵染时间分别用5min、15min和20min替换10min，观察得到的遗传转化体系幼苗生长情况及统计转化率。
侵染15min和20min后农杆菌污染严重，特别是20min侵染后，幼胚转化率显著减低，最低只有8％的转化率。表明幼胚随着侵染时间的延长，可能受农杆菌侵染程度的影响越大，过长时间侵染可能会使幼胚失去活性。本发明采用10min侵染条件下，幼胚伤害较小，幼胚生长正常，阳性率显著高于上述三个处理组。
对比例6
采用实施例4的方法构建‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系，不同之处在于潮霉素浓度分别为12.5mg/L、25mg/L和100mg/L替换50mg/L，分析幼胚对抗生素的敏感性。
侵染后的幼胚共培养4d后，放入含有不同浓度潮霉素的筛选培养基中，探究‘凤丹’幼胚对潮霉素的敏感性，观察各浓度对外植体生长状况的影响确定适宜的筛选浓度。设计了5种潮霉素浓度，发现潮霉素浓度对存活率影响显著(见图4)。潮霉素浓度越高越容易对幼胚造成损伤最终导致褐化，而在含有低浓度潮霉素(12.5mg/L和25mg/L)的培养基中虽然幼胚存活率高但会增加假阳性和农杆菌污染的机率。实验结果表明‘凤丹’幼胚对潮霉素的最佳耐受浓度为50mg/L。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种‘凤丹’牡丹幼胚离体再生的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)‘凤丹’牡丹幼胚接种于幼胚萌发培养基上萌发培养，得萌发幼胚；
所述幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：27～33g/L葡萄糖、14～18g/L琼脂浓度、2.8～3.2mg/L GA3和0.23～0.27mg/LNAA，pH值为5.8～6.0；
2)将所述萌发幼胚接种至幼胚生根培养基上进行光照培养，得到‘凤丹’牡丹植株；
所述幼胚生根培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：0.45～0.55mg/LGA3、0.45～0.55mg/L IBA和0.09～0.11mg/L活性炭。
2.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于，所述幼胚萌发培养基还包括以下含量的组分：30g/L葡萄糖、16g/L琼脂浓度、3.0mg/L GA3和0.25mg/LNAA，pH值为5.8。
3.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于，所述萌发培养的温度为20～25℃，所述萌发培养的时间为25～32d。
4.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于，所述幼胚生根培养基还包括以下含量的组分：0.5mg/L GA3、0.5mg/L IBA和0.1mg/L活性炭。
5.根据权利要求1所述建立方法，其特征在于，所述光照培养的温度20～25℃，所述光照培养的时间为28～32d，所述光照培养的光强为6000～8000Lx。
6.根据权利要求1～5所述建立方法，其特征在于，所述‘凤丹’牡丹幼胚来自当年开花后90d种子。
7.一种‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
A.将含目标基因的植物表达载体转化农杆菌中，依次经筛选培养和扩大培养后，收集菌体，用含有乙酰丁香酮的MS液体培养基悬浮所述菌体，得到农杆菌侵染液；
所述含有乙酰丁香酮的MS液体培养基中乙酰丁香酮的终浓度为250～350μmol/L；
B.以幼胚萌发培养基上培养7～8d的幼胚为材料，用所述农杆菌侵染液侵染所述幼胚8～12min，将侵染后的幼胚在共培养培养基上共培养3～5d，得到共培养幼胚；
所述幼胚萌发培养基以1/2MS为基础培养基，还包括以下含量的组分：27～33g/L葡萄糖、14～18g/L琼脂浓度、2.8～3.2mg/L GA3和0.23～0.27mg/LNAA，pH值为5.8～6.0；
C.将所述共培养幼胚在筛选培养基经筛选培养，得到‘凤丹’牡丹幼胚遗传转化体系。
8.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤A中所述含有乙酰丁香酮的MS液体培养基中乙酰丁香酮的终浓度为300μmol/L；
步骤B中所述侵染的时间为10min；所述共培养的时间为4d。
9.根据权利要求7所述方法，其特征在于，步骤C中所述筛选培养基是以所述幼胚萌发培养基为基础培养基，还包含终浓度为40～60mg/L的潮霉素。
10.根据权利要求7～9任意一项所述方法，其特征在于，步骤B中共培养培养基为所述幼胚萌发培养基。
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| CN107950394A (zh) * | 2017-11-23 | 2018-04-24 | 北京林业大学 | 一种牡丹幼胚的组织培养方法 |
| CN109220810A (zh) * | 2018-11-19 | 2019-01-18 | 武汉市农业科学院 | 一种无菌条件下牡丹胚高效生根的方法 |
| CN110476807A (zh) * | 2019-07-31 | 2019-11-22 | 河南科技大学 | 一种建立油用牡丹‘凤丹’成熟种胚无菌培养体系的方法 |
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