CN112175989A - 一种耐冬山茶遗传转化的方法 - Google Patents
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Abstract
一种耐冬山茶遗传转化的方法，属于生物技术和基因工程技术领域。方法包括：1）耐冬山茶无菌苗准备，2）农杆菌侵染液制备，3）农杆菌侵染及共培养，4）农杆菌清洗，5）抗性芽筛选及诱导培养，6）抗性芽壮苗培养，7）生根培养，8）PCR鉴定。本发明提供的耐冬山茶遗传转化的方法，成功获得了耐冬山茶转基因植株，将该方法应用于山茶相关的遗传转化研究及应用中，转化效率可达4%，为转基因获得新品种提供了技术平台。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和基因工程技术领域，具体涉及一种耐冬山茶遗传转化的方法。
背景技术
‘耐冬’山茶（Camellia japonica L. ‘Naidong’）隶属于山茶科（Theaceae）山茶属（Camellia L.），常绿灌木或小乔木，主要分布于青岛崂山及长门岩等岛屿，为我国山茶的自然分布的最北端。山茶花品种多数来源于红山茶（Camellia japonica L.），与‘耐冬’为同一物种。因此，‘耐冬’山茶是山茶育种的重要研究材料，也是培育耐寒型茶花新品种的理想亲本。然而，山茶属植物为多年生异化授粉木本植物，通过常规杂交育种存在周期长、杂交结实率低、育种目标精准度低等问题。遗传转化技术能在短期内定向培育观赏、抗性皆优的茶花新品种，建立高效的遗传转化体系是山茶分子育种的重要基础。
山茶属植物遗传转化只有在茶树中有相关报道，阻碍其进程的主要问题是离体再生难和转化效率低。以未成熟胚子叶诱导体胚可获得较高的再生频率，遗传转化也获得了成功。但子叶是杂合体，母本的遗传背景已被改造，并且很多品种不能结实，因此子叶不适合作为优良品种遗传改良的外植体。叶片和无芽的茎段的离体再生本身就十分困难，其诱导的愈伤组织转化仅进展到瞬时表达，没有获得再生转基因植株。带有腋芽和顶芽的茎段一般用于微繁殖，转化后可能会产生嵌合体，还没有尝试开展。
在观赏山茶中，杜鹃红山茶、浙江红山茶、‘耐冬’山茶等山茶属植物中已经建立组织培养再生体系，分别从叶片、未成熟胚、茎段中获得了再生植株，构建了高效的再生体系，并获得了发明专利。我们在茎段培养中发现，除了腋芽、顶芽处可萌芽外，茎段两端的切口处形成愈伤组织，并进一步分化不定芽，特别是‘耐冬’山茶，在去除萌发的腋芽和顶芽后，仍具有较强的再生能力，其遗传转化潜力较大。
发明内容
针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于设计提供一种耐冬山茶遗传转化的方法。本发明方法的转化效率可达4%，为山茶分子育种提供技术平台。
一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）耐冬山茶无菌苗准备：采集8月初耐冬山茶未成熟果实，洗涤剂搓洗后自来水冲洗2h，剥去果皮，在超净台用75%酒精消毒30s后，10%NaClO消毒10min，灭菌水清洗6遍，剥去种子的内外种皮，接种于愈伤诱导培养基上培养，一个月后转移至愈伤组织过度培养基上培养，待愈伤组织由淡黄色变为黄色略带红色后转移至愈伤组织分化不定芽培养基内培养，待不定芽长至1cm时转移至壮苗及无菌苗扩繁培养基上培养，得到扩繁的无菌苗，备用；
2）农杆菌侵染液制备：在-80℃温度下取出带有目的基因的pCAMBIA2301植物表达载体的农杆菌工程菌种，低温解冻，在含50mg·L-1Rif和50mg·L-1Kan的YEP固体培养板上划线培养，放入28℃恒温培养箱中24-48h，获得单菌落，挑取单菌落接种在5mL含有50mg·L-1Kan的YEP液体培养基中，28℃下180转/min振荡培养48h，至农杆菌浓度OD595=0.8时得到菌悬液，吸取1mL菌悬液至100mL含50mg·L-1Kan的YEP液体培养基中，28℃下以180转/min振荡培养24h，至菌液浓度OD595=1.0，离心收集菌体，用50mLCoM液体培养基悬浮，再离心收集菌体，用CoM液体培养基悬浮，将悬浮液浓度调至OD595=1.0，得到农杆菌侵染液，备用；
3）农杆菌侵染及共培养：选取步骤1）得到的长势健壮的耐冬无菌苗，将幼嫩茎段去除叶片，切成0.5cm，在步骤2）得到的农杆菌侵染液中侵染30min，于滤纸上吸干，接种在CoM共培养基上，25℃下共培养48-72h；
4）农杆菌清洗：将经步骤3）共培养后的耐冬茎段用无菌水冲洗10次，放入100mL含400mg·L-1 Tim抗生素的无菌水组培瓶中，放置在摇床上以25℃120转/min振荡2h，放置于无菌滤纸上吸干水分；
5）抗性芽筛选及诱导培养：将经步骤4）清洗后的耐冬茎段接种在SeM固体培养基中，培养30天，切除顶芽和腋芽，形成愈伤组织的茎段继续在SeM固体培养基中继代培养，每30天继代一次，直至长出抗性不定芽；
6）抗性芽壮苗培养：将长至0.5cm的抗性不定芽切下，转移至壮苗培养基中，培养温度25±2℃，光照光强2500～3000 Lx，光照时间10-12h/d；
7）生根培养：长至3-4cm的抗性不定芽，切除基部愈伤组织，用500-550mg∙L-1的IBA浸没处理基部20-25min后，转到添加有15-20 g∙L-1蔗糖的MV液体培养基的纸桥上，在100-200μmol∙m-2∙s-1条件下诱导生根，20天后有透明略带红色的幼根长出，再培养，直至幼根伸长并出现木质化；
8）PCR鉴定：采集5片叶以上的抗性不定芽的叶片100mg，用液氮研磨至细末，采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，设计上游引物和下游引物，以基因组DNA为模版进行PCR扩增，扩增出目的条带的为阳性植株。
所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤1）中各培养基上培养条件均为：温度25±2℃，光照光强2500～3000 Lx，光照时间10-12h/d。
所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤1）中愈伤诱导培养基为：MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg∙L-12,4-D 和 1.8-2.2 mg∙L-16-BA，所述愈伤组织过度培养基为：MS基本培养基中加入0.1-0.15 mg∙L-1NAA + 2.0-2.2 mg∙L-16-BA，所述愈伤组织分化不定芽培养基为：MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg∙L-1NAA + 9-11 mg∙L-16-BA或者MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg∙L-1IBA + 9-11 mg∙L-16-BA，所述壮苗及无菌苗扩繁培养基为：MS基本培养基中加入0.5mg∙L-1NAA + 2.0mg∙L-16-BA，蔗糖含量2-4%，琼脂0.6-0.8%，MS基本培养基使用前PH调至5.7-5.9，120-125℃下灭菌20-25分钟。
所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤2）中CoM液体培养基为：MS基础培养基中加入0.5 mg·L-1 2,4-D + 2.0 mg·L-1 6-BA，蔗糖含量2-4%。
所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤2）中目的基因为带有杜鹃红山茶FT基因的CaFT，CaFT的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤3）中CoM共培养基为：MS基础培养基中加入0.5 mg·L-1 2,4-D + 2.0 mg·L-1 6-BA，蔗糖含量2-4%，琼脂0.6-0.8%。
所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤5）中SeM固体培养基为：WPM培养基中加1.0mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1IBA+0.02 mg·L-1TDZ +200 mg·L-1 Tim+200mg·L-1 Amp+ 50mg·L-1Kan，所述SeM固体培养基中的培养条件为：温度25±2℃，光照光强2500～3000 Lx，光照时间10-12h/d。
所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤6）中壮苗培养基为MS基本培养基中加入0.5mg∙L-1NAA + 2.0mg∙L-16-BA+200 mg·L-1 Tim+200mg·L-1 Amp+50mg·L-1Kan。
所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤7）中基部用520-530mg∙L-1的IBA浸没处理21-23min，在120-150μmol∙m-2∙s-1条件下诱导生根。
所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤8）中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，下游引物序列如SEQ ID No.3所示。
2,4-D，别 名：(2,4-二氯苯氧基)乙酸，2,4-D酸，2,4-D属于苯氧类物质，是一种人工合成的植物激素具有与生长素（IAA）相似的生理效应。
6-BA，化学名称：6-苄氨基腺嘌呤，别 名：6-苄氨基嘌呤、细胞分裂素。
NAA，也称a-萘乙酸，是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加坐果，防止落果，改变雌、雄花比率等。
IBA，也叫吲哚丁酸,促进植物主根生长，提高发芽率，成活率，用于促使插条生根。
Kan，也称硫酸卡那霉素（Kanamycin Sulfate），一种氨基糖苷类抗生素，对大多数革兰氏阴性菌、肠杆菌、变形杆菌、沙门氏菌、多杀性巴氏杆菌等有强大抗菌作用，对金黄色葡萄球菌和结核杆菌也较敏感，是一种蛋白质生物合成抑制剂，通过与30S核糖体结合从而致使mRNA密码误读，作为选择基因或标记基因用于分子克隆中。
Amp，又称氨苄青霉素（Ampicillin），是一种β-内酰胺类抗生素，光谱抑制革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和厌氧菌，在遗传转化中用于抑制农杆菌和杂菌生长。
Tim，又称特美汀（Timentin），其组分为替卡西林钠及克拉维酸钾，常用于抑制农杆菌生长，在遗传转化的筛选培养中，能达到很好的抑菌效果。
Rif，也称利福平（Rifampicin），是一种所属利福霉素家族的一种广谱抗生素药物，对结核杆菌有较强抗菌作用，对革兰氏阳性或阴性细菌、病毒等也有疗效，在遗传转化中作为抑制杂菌生长的抗生素。
DNA提取试剂盒和PCR试剂均为常用分子生物学试剂。
本发明提供的耐冬山茶遗传转化的方法，成功获得了耐冬山茶转基因植株，将该方法应用于山茶相关的遗传转化研究及应用中，转化效率可达4%，为转基因获得新品种提供了技术平台。
附图说明
图1为耐冬山茶茎段愈伤组织再生及转基因苗获得（A：茎段愈伤组织再生不定芽，B：耐冬转基因抗性苗）；
图2为耐冬山茶抗性苗PCR鉴定（M：分子量标准DL2000；1-3：PCR阴性的抗性苗；4-16：PCR阳性的抗性苗；17：耐冬山茶非转基因苗）。
具体实施方式
以下将结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例：
1）‘耐冬’山茶无菌苗准备：以采集8月初的耐冬山茶未成熟果实，洗涤剂搓洗并用自来水冲洗2小时，剥去果皮，在超净台中用75%酒精消毒30s，10%NaClO消毒10min，灭菌水清洗6遍；剥去种子的内外种皮，接种于愈伤诱导培养基上，约一个月左右转移至愈伤组织过渡培养基上，待愈伤组织由淡黄色变为黄色略带一点红色后将材料转移至愈伤组织分化不定芽培养基内，待不定芽长至1cm时转移至壮苗及无菌苗扩繁培养基上。上述培养温度为25±2℃，光照光强为2500～3000 Lx，光照时间为10-12h/d；所述的愈伤诱导培养基为MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg∙L-12,4-D 和 1.8-2.2 mg∙L-16-BA，愈伤组织过渡培养基为MS基本培养基中加入0.1-0.15 mg∙L-1NAA + 2.0-2.2 mg∙L-16-BA，愈伤组织分化不定芽培养基为MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg∙L-1NAA + 9-11 mg∙L-16-BA或者MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg∙L-1IBA + 9-11 mg∙L-16-BA,壮苗及无菌苗扩繁培养基为MS基本培养基中加入0.5mg∙L-1NAA + 2.0mg∙L-16-BA。所述培养基中蔗糖含量为2-4%，琼脂0.6-0.8%，灭菌前将PH调至5.7-5.9，120-125℃下灭菌20-25分钟。扩繁的无菌苗备用。其中MS基本培养基成分表如表1所示。
表1 MS基本培养基成分表
2) 农杆菌侵染液制备：从-80℃取出带有杜鹃红山茶FT基因（CaFT）的pCAMBIA2301植物表达载体的农杆菌工程菌种，其中CaFT的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。低温解冻，在含50mg·L-1Rif和50mg·L-1Kan的YEP固体培养板上划线培养,放入28℃恒温培养箱培养24-48h，获得单菌落。挑取单菌落接种在5mL含50mg·L-1Kan的YEP液体培养基中，28℃下180转/min振荡培养约48h，至农杆菌浓度为OD595=0.8；吸取1mL该悬浮菌液至100mL含50mg·L- 1Kan的YEP液体培养基中，28℃下180转/min振荡培养，振荡培养约24小时至菌液浓度OD595=1.0；离心收集农杆菌，用50mLCoM液体培养基悬浮，再次离心收集菌体，用CoM液体培养基悬浮，将悬浮液浓度调至OD595=1.0，备用。所述的CoM液体培养基为MS基本培养基中加入0.5mg·L-1 2,4-D + 2.0 mg·L-1 6-BA，蔗糖含量为2-4%。其中，YEP液体培养基成分表如下表2。
表2 YEP液体培养基成分表
3）农杆菌侵染及共培养：选取长势健壮的‘耐冬’无菌苗，将幼嫩茎段去除叶片，切成0.5cm左右，在已准备好的农杆菌悬浮液中侵染30分钟，于滤纸上吸干，接种在CoM共培养基上。所述CoM培养基为MS基本培养基中加入0.5 mg·L-1 2,4-D + 2.0 mg·L-1 6-BA，蔗糖含量为2-4%，琼脂含量为0.6-0.8%。共培养温度为25℃，暗培养48-72h。
4）农杆菌清洗：共培养3天的‘耐冬’茎段，无菌水冲洗10次，再放入100mL含抗生素（400mg·L-1 Tim）的无菌水的组培瓶中，放置在摇床上（120转/min, 25摄氏度），振荡2h，放置于无菌滤纸上吹干多余水分。
5）抗性芽筛选及诱导培养：将清洗过的‘耐冬’茎段接种在筛选培养基SeM固体培养基中。培养约30天左右，切除长出的顶芽和腋芽，形成愈伤组织的茎段继续在SeM培养基中继代培养，每30天继代一次，约60天开始长出抗性不定芽。抗性不定芽再生效率约为30%。所述SeM培养基为WPM培养基中加1.0mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1IBA+0.02 mg·L-1TDZ +200mg·L-1 Tim+200mg·L-1 Amp+ 50mg·L-1Kan。培养温度为25±2℃，光照光强为2500～3000Lx，光照时间为10-12h/d。其中WPM培养基成分表如表3所示。
表3 WPM培养基成分表
6）抗性芽壮苗培养：将长至0.5cm左右的抗性芽切下，转移至壮苗培养基，共获得卡那霉素抗性苗94株。所述的壮苗培养基为MS基本培养基中加入0.5mg∙L-1NAA + 2.0mg∙L-16-BA+200 mg·L-1 Tim+200mg·L-1 Amp+ 50mg·L-1Kan，培养条件同上。
7）生根培养：长至3-4cm的芽条，切除基部愈伤组织，用500-550mg∙L-1的IBA浸没处理20-25min，然后转到MV液体培养基的纸桥上在100-200 μmol∙m-2∙s-1下诱导生根；诱导生根阶段，采用MV液体培养基加入蔗糖15-20 g∙L-1，20-22天开始启动，透明略带红色的幼根长出，再培养一段时间之后，幼根伸长并逐渐木质化，如图1。其中，MV液体培养基成分表如下表4所示。
表4 MV液体培养基成分表
8）PCR鉴定：采集5片叶以上的抗性不定芽的叶片约100mg，用液氮研磨至细末，基因组DNA提取方法参照TaKaRaMiniBEST Plant Genomic DNA Extraction Kit操作手册。根据插入目的基因CaFT及35S启动子设计引物,其中上游引物如SEQ ID No.2所示，下游引物如SEQID No.3所示,扩增试剂为TaKaRa公司的rTaq premix，以基因组DNA为模板按照其操作手册在PCR仪上进行PCR扩增，20μl体系，其中退火温度为54℃，延伸时间为1分钟，目的条带大小为812bp，结果如图2。
经检测，共获得13株PCR阳性植株，阳性率为13.8%,与前述抗性不定芽再生效率30%合计，转化效率约为4%。
序列表
<110> 中国林业科学研究院亚热带林业研究所
<120> 一种耐冬山茶遗传转化的方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 889
<212> DNA
<213> 杜鹃红山茶FT基因(CaFT)
<400> 1
ttgcattgca ataaacaaac aagtagtcag tcagcctcct ccaatatata tattttttcc 60
ttttgatcat tagtaggatt agattgggtt gtgttgcata ttaatctcta tccctctctc 120
tcaatctctc agtttcctcc cacttgtgat gcctcgggac agggatcctc ttgttgttgg 180
gcgtgttata ggggatgttt tggacccctt tacaaggtct atctctctca gggtgaccta 240
cagcagtagg gaagttacca atggttgtga gctcaggcct tctcaagttg tcatccaacc 300
tagggttgac attggtggtg atgaccttag gaccttctac actcttgtta tggtggaccc 360
tgatgctccc agcccaagcg acccaaacct aagggaatac ttgcattggt tggtgactga 420
tatcccagca accactggag caagctttgg gcaagaggtg gtttgttatg agagtccgag 480
gccatcaatg ggaatccatc gattcgtttt ggcgttgttt agacagttgg gaaggcaaac 540
agtgtatgct ccagggtggc gtcagaattt caacactcgg gactttgcgg agctttacaa 600
tctcggctct cctgtcgccg ctgtttattt taactgtcaa agggagaccg gctcaggagg 660
ccgaagacga tgaatcacat catcatcatc atcatatatt atactatact atcaccgttt 720
agcttaattt atctatatat gtctttcttt actgtttgtg tctaaatcta tctttacaca 780
ttgaagaggt tgcctgaaag ttgaaaccac tcactagtta gatcatatgt gcttgtatca 840
aattaaaaga tgcatgttgc aatgctatta attatatata tatatatat 889
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 上游引物(The upstream primer)
<400> 2
ttcgcaagac ccttcctc 18
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> 下游引物(Downstream primers)
<400> 3
tctagattca actttcaggc aac 23
Claims (10)
1.一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于包括以下步骤：
1）耐冬山茶无菌苗准备：采集8月初耐冬山茶未成熟果实，洗涤剂搓洗后自来水冲洗2h，剥去果皮，在超净台用75%酒精消毒30s后，10%NaClO消毒10min，灭菌水清洗6遍，剥去种子的内外种皮，接种于愈伤诱导培养基上培养，一个月后转移至愈伤组织过度培养基上培养，待愈伤组织由淡黄色变为黄色略带红色后转移至愈伤组织分化不定芽培养基内培养，待不定芽长至1cm时转移至壮苗及无菌苗扩繁培养基上培养，得到扩繁的无菌苗，备用；
2）农杆菌侵染液制备：在-80℃温度下取出带有目的基因的pCAMBIA2301植物表达载体的农杆菌工程菌种，低温解冻，在含50mg·L-1Rif和50mg·L-1Kan的YEP固体培养板上划线培养，放入28℃恒温培养箱中24-48h，获得单菌落，挑取单菌落接种在5mL含有50mg·L-1Kan的YEP液体培养基中，28℃下180转/min振荡培养48h，至农杆菌浓度OD595=0.8时得到菌悬液，吸取1mL菌悬液至100mL含50mg·L-1Kan的YEP液体培养基中，28℃下以180转/min振荡培养24h，至菌液浓度OD595=1.0，离心收集菌体，用50mLCoM液体培养基悬浮，再离心收集菌体，用CoM液体培养基悬浮，将悬浮液浓度调至OD595=1.0，得到农杆菌侵染液，备用；
3）农杆菌侵染及共培养：选取步骤1）得到的长势健壮的耐冬无菌苗，将幼嫩茎段去除叶片，切成0.5cm，在步骤2）得到的农杆菌侵染液中侵染30min，于滤纸上吸干，接种在CoM共培养基上，25℃下共培养48-72h；
4）农杆菌清洗：将经步骤3）共培养后的耐冬茎段用无菌水冲洗10次，放入100mL含400mg·L-1 Tim抗生素的无菌水组培瓶中，放置在摇床上以25℃120转/min振荡2h，放置于无菌滤纸上吸干水分；
5）抗性芽筛选及诱导培养：将经步骤4）清洗后的耐冬茎段接种在SeM固体培养基中，培养30天，切除顶芽和腋芽，形成愈伤组织的茎段继续在SeM固体培养基中继代培养，每30天继代一次，直至长出抗性不定芽；
6）抗性芽壮苗培养：将长至0.5cm的抗性不定芽切下，转移至壮苗培养基中，培养温度25±2℃，光照光强2500～3000 Lx，光照时间10-12h/d；
7）生根培养：长至3-4cm的抗性不定芽，切除基部愈伤组织，用500-550mg∙L-1的IBA浸没处理基部20-25min后，转到添加有15-20 g∙L-1蔗糖的MV液体培养基的纸桥上，在100-200 μmol∙m-2∙s-1条件下诱导生根，20天后有透明略带红色的幼根长出，再培养，直至幼根伸长并出现木质化；
8）PCR鉴定：采集5片叶以上的抗性不定芽的叶片100mg，用液氮研磨至细末，采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，设计上游引物和下游引物，以基因组DNA为模版进行PCR扩增，扩增出目的条带的为阳性植株。
2. 如权利要求1所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤1）中各培养基上培养条件均为：温度25±2℃，光照光强2500～3000 Lx，光照时间10-12h/d。
3. 如权利要求1所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤1）中愈伤诱导培养基为：MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg∙L-12,4-D 和 1.8-2.2 mg∙L-16-BA，所述愈伤组织过度培养基为：MS基本培养基中加入0.1-0.15 mg∙L-1NAA + 2.0-2.2 mg∙L-16-BA，所述愈伤组织分化不定芽培养基为：MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg∙L-1NAA + 9-11mg∙L-16-BA或者MS基本培养基中加入0.4-0.6 mg∙L-1IBA + 9-11 mg∙L-16-BA，所述壮苗及无菌苗扩繁培养基为：MS基本培养基中加入0.5mg∙L-1NAA + 2.0mg∙L-16-BA，蔗糖含量2-4%，琼脂0.6-0.8%，MS基本培养基使用前PH调至5.7-5.9，120-125℃下灭菌20-25分钟。
4. 如权利要求1所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤2）中CoM液体培养基为：MS基础培养基中加入0.5 mg·L-1 2,4-D + 2.0 mg·L-1 6-BA，蔗糖含量2-4%。
5. 如权利要求1所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤2）中目的基因为带有杜鹃红山茶FT基因的CaFT，CaFT的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
6. 如权利要求1所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤3）中CoM共培养基为：MS基础培养基中加入0.5 mg·L-1 2,4-D + 2.0 mg·L-1 6-BA，蔗糖含量2-4%，琼脂0.6-0.8%。
7. 如权利要求1所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤5）中SeM固体培养基为：WPM培养基中加1.0mg·L-1 6-BA+0.5mg·L-1IBA+0.02 mg·L-1TDZ +200mg·L-1 Tim+200mg·L-1 Amp+ 50mg·L-1Kan，所述SeM固体培养基中的培养条件为：温度25±2℃，光照光强2500～3000 Lx，光照时间10-12h/d。
8. 如权利要求1所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤6）中壮苗培养基为MS基本培养基中加入0.5mg∙L-1NAA + 2.0mg∙L-16-BA+200 mg·L-1 Tim+200mg·L-1 Amp+ 50mg·L-1Kan。
9.如权利要求1所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤7）中基部用520-530mg∙L-1的IBA浸没处理21-23min，在120-150μmol∙m-2∙s-1条件下诱导生根。
10. 如权利要求1所述的一种耐冬山茶遗传转化的方法，其特征在于所述步骤8）中上游引物的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，下游引物序列如SEQ ID No.3所示。
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| CN202011007635.6A Pending CN112175989A (zh) | 2020-09-23 | 2020-09-23 | 一种耐冬山茶遗传转化的方法 |
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114410679A (zh) * | 2022-03-10 | 2022-04-29 | 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 | 山鸡椒的遗传转化方法和应用 |
| CN115044609A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-09-13 | 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 | 一种利用农杆菌瞬时转化山茶花离体花瓣进行基因表达的方法 |
Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN101558742A (zh) * | 2009-05-12 | 2009-10-21 | 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 | 一种茶花愈伤组织再生植株的方法 |
| CN103081807A (zh) * | 2013-02-01 | 2013-05-08 | 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 | 耐冬山茶愈伤组织再生植株的方法 |
-
2020
- 2020-09-23 CN CN202011007635.6A patent/CN112175989A/zh active Pending
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101558742A (zh) * | 2009-05-12 | 2009-10-21 | 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 | 一种茶花愈伤组织再生植株的方法 |
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|---|
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| CN114410679B (zh) * | 2022-03-10 | 2024-01-09 | 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 | 山鸡椒的遗传转化方法和应用 |
| CN115044609A (zh) * | 2022-06-15 | 2022-09-13 | 中国林业科学研究院亚热带林业研究所 | 一种利用农杆菌瞬时转化山茶花离体花瓣进行基因表达的方法 |
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