CN106754970A - 一种通过控制LsFT 基因来培育耐抽薹型生菜的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过控制LsFT基因来培育耐抽薹型生菜的方法，所述LsFT基因具有SEQ ID NO.27所示的编码序列。本发明还提供了所述LsFT基因在提前植物生殖生长发生时间或者延迟植物生殖生长发生时间中的应用。本发明方法通过过量表达LsFT基因可以完全恢复拟南芥突变体的表型，并且通过干扰LsFT基因的表达可以将植物例如生菜抽薹开花时间推迟两倍的时间，使例如其商品生产时间延长至约两倍的时间，为种植提供了更加宽裕的时间安排，显著地提高了其商品生产效率。

Description

一种通过控制LsFT基因来培育耐抽薹型生菜的方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及通过转基因技术培养耐抽薹型生菜的方法。
背景技术
植物的生长一般包括营养生长和生殖生长。花是植物从营养生长到生殖生长的一个重要转折点。花启动的时机对生殖生长的成功至关重要。而开花时间据推推测可能受内在因子和环境因子的共同调节(Seo，E.，Lee，H.，Jeon，J.，Park，H.，Kim，J.，Noh，Y.S.和Lee，I.(2009).Crosstalk between cold response and flowering in Arabidopsis ismediated through the flowering-time gene SOC1 and its upstream negativeregulator FLC.Plant Cell 21，3185-97.doi:10.1105/tpc.108.063883.)，其中光照(光质、光强、日照长度)和温度是主要的外部因素，自主途径因子和赤霉素是主要的内部因素。此外，植物的生理状况(如年龄、植株大小)、胁迫条件(如干旱、营养匮乏)、植物激素、水杨酸、维生素C、微小核糖核酸(MicroRNA)等也可能对开花时间产生一定的影响(Mouradov，A.，Cremer，F.和Coupland，G.(2002).Control of flowering time:Interactingpathways as a basis for diversity.Plant Cell 14S，S111-S130.doi:10.1105/tpc.001362)。植物开花调控和花形态建成的分子机制的研究主要建立在模式植物拟南芥上。拟南芥开花由5条途径共同调控，即光周期途径、春化途径、自主途径、赤霉素途径、年龄途径(Komeda，Y.(2004).Genetic regulation of time to flower in Arabidopsisthaliana.Annu.Rev.Plant Biol.55，521-35.doi:10.1146/annurev.arplant.55.031903.141644.)。这几条途径彼此独立，又相互交织，形成了一个非常复杂的基因调控网络，推测这五条途径最终都要通过激活一系列开花途径整合因子从而激活花分生组织特征基 因的表达调节植物开花。所以开花调控的整合因子对植物的开花调控尤为重要。
据报道，成花素(FT)基因的转录本集中在叶片韧皮部的伴胞处，但它的蛋白可以通过韧皮部筛管移动到植物的茎顶端分生组织，与bZIP转录因子FLOWERING LOCUS D(FD)互作，形成蛋白二聚体激活下游基因SOC1和花分生组织特征基因APETALA 1(AP1)的表达，从而促进开花(Corbesier，L.，Vincent，C.，Jang，S.，Fornara，F.，Fan，Q.，Searle，I.，Giakountis，A.，Farrona，S.，Gissot，L.，Turnbull，C.和Coupland，G.(2007).FT proteinmovement contributes to long-distance signaling in floral induction ofArabidopsis.Science 316，1030-1033.doi:10.1126/science.1141752；Jaeger，K.E.和Wigge，P.A.(2007).)。
生菜(Lactuca sativa L.)学名叶用莴苣，因其叶子适宜生食而得名，是希望延长其营养生长的典型植物之一。生菜是菊科莴苣属一、二年生草本植物，原产于地中海沿岸,是欧洲无土栽培的三大蔬菜之一。其叶片质地脆嫩、口感清香、营养丰富，深受全世界人民喜爱。2013年，世界生菜和菊苣的栽培面积为114.8万公顷，总产量为2489.6万吨。我国生菜和莴苣栽培面积达57万公顷，总产量为1350万吨，分别占世界总栽培面积和总产量的49.7％和54.2％，遥遥领先于其他国家。目前北京市生菜年播种面积在8万亩以上，是京郊蔬菜生产的第一大叶菜类作物，也是北京市郊区鲜切蔬菜的主要品种。生菜性喜冷凉，适宜生长温度为15-20℃，植株在高温环境下往往生长不良，严重影响产量和品质，且高温长日照能够促进其抽薹开花，从而大大降低其商品价值。然而夏季栽培生菜，生长前期温度高，植株生长缓慢，且易感受高温引起花芽分化，造成先期抽薹而破坏其商品价值，从而使得栽培难度很大，使生菜周年供应难度增加，也制约着生菜鲜切行业的发展。因此，培育出耐高温抽薹的生菜品种已成为我国乃至世界范围内生菜育种目标与生产上重点关注的问题。
Fukuda M.等早在2011年就克隆到生菜FT基因，并将其转入拟南芥中(Fukuda，M.，Matsuo，S.，Kikuchi，K.，Kawazu，Y.，Fujiyama，R.和Honda，I.(2011).Isolation andfunctional characterization of the FLOWERING LOCUS T homolog，the LsFT gene，inlettuce.J.Plant Physiol.168，1602-1607.doi:10.1016/j.jplph.2011.02.004.)。但是到目前为止仍没有人利用生菜FT基因来培育迟花型生菜，究其原因主要有两点。一个原因是Fukuda M.的结果认为生菜FT基因并不能完全有效地促进拟南芥提前开花，远不如拟南芥的类似基因那样有效。因此包括其本人在内的该领域的科研或技术人员没有对生菜FT基因的作用和效果进行更加深入的研究。另一个原因是，生菜是一种生长周期短，再生能力强，在组织培养上是很好的实验材料，被认为是非常具有转基因应用前景的“生物反应器”，国内外的科研人员很早就开始对生菜的组织培养和转基因系统进行了研究和探索，采用现有技术推荐的常规组培体系并不适合于FT转基因生菜的遗传转化体系。
发明内容
为了解决现有技术中的上述问题，本发明人对生菜FT基因进行了深入研究，终于建立起了适合于FT转基因生菜的遗传转化体系，并且考察了FT转基因在生菜抽薹开花中的作用，并惊讶地发现生菜FT基因不仅能够完全恢复拟南芥ft突变株的开花能力，而且在被抑制之后还可以显著地延长生菜的开花时间，从而使得通过基于生菜FT基因的转基因技术来培育长期以来一直想要获得的迟花型生菜成为可能。
本发明通过如下技术方案来解决现有技术中的上述问题从而实现本发明的目的：
1、一种通过控制LsFT基因来调节生菜抽薹开花起始时间的方法，其特征在于，所述LsFT基因具有SEQ ID NO.27所示的编码序列。
2、根据技术方案1所述的方法，其特征在于，所述控制LsFT基因为抑制LsFT基因的功能，并且所述调节生菜抽薹开花起始时间为延迟生菜抽薹开花起始时间。
3、根据技术方案2所述的方法，其特征在于，所述抑制LsFT基因的功能通过LsFT基因的转录抑制或者转录后抑制来实现；优选的是，所述抑制LsFT基因的功能通过基因敲除或者基因沉默的方式实现；更优选的是，所述抑制LsFT基因的功能通过LsFT-RNAi技术来实现。
4、根据技术方案2或3所述的方法，其特征在于，LsFT-RNAi技术使用的LsFT-RNAi载体选用5'末端AscⅠ位点、3'末端SwaⅠ位点、5'末端BamHⅠ位点和3'末端SpeⅠ位点构建得到。
5、根据技术方案2至4中任一项所述的方法，其特征在于，所述LsFT-RNAi载体借助农杆菌通过子叶转染法浸染生菜子叶来导入。
6、根据技术方案2至5中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法采用包括种子培养基、共培养培养基、分化培养基、生芽培养基、和生根培养基的遗传转化培养基体系进行，其中：
所述种子培养基包含4.44g/L的MS粉，30g/L的蔗糖和6.8g/L的琼脂；
所述共培养培养基包含4.44g/L的MS粉、30g/L的蔗糖，6.8g/L的琼脂，0.1mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA；
所述分化培养基包含4.44g/L的MS粉，30g/L的蔗糖，6.8g/L的琼脂，0.1至0.2mg/L的6-BA，0.1mg/L的NAA和300mg/L的头孢霉素；
所述生芽培养基包含2.22g/LMS粉，15g/L的蔗糖，2.22g/L的植物凝胶和300mg/L的头孢霉素；和/或
所述生根培养基包含2.22g/L的MS粉，15g/L的蔗糖，6.8g/L的琼脂和300mg/L的头孢霉素。
7、根据技术方案2至6中任一项所述的方法，其特征在于，所述种子培养基、共培养培养基、分化培养基、生芽培养基和生根培养基pH各自独立地为6.5至6.8。
8、根据技术方案2至7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将生菜种子在30％次氯酸钠溶液里消毒5分钟，然后播种在所述种子培养基上；
(2)在播种后第6天时，切下幼苗子叶划伤并放入含有农杆菌的1/2MS液体培养基里侵染13分钟，然后将子叶放到所述共培养培养基中在28℃黑暗培养2天，所述农杆菌导入有LsFT-RNAi载体并且所述1/2MS液体培养基的OD600nm为0.2–0.3；
(3)将在共培养培养基培养后的的子叶移到分化培养基培养1至2周内从而在愈伤组织上长出芽体；
(4)将芽体切下并移植到生芽培养基中培养2周；
(5)将在生芽培养基中培养后的芽体转移到生根培养基中培养直至得到根长达到5至8cm的幼苗；
(6)将幼苗转入带有培养土的种植容器中驯化培养2周的时间，然后移栽至土壤中直至收获。
9、LsFT基因在提前植物生殖生长发生时间中的应用，所述LsFT基因具有SEQ IDNO.27所示的编码序列，并且所述提前植物生殖生长发生时间通过增强LsFT基因的功能来实现。
10、LsFT基因在延迟植物生殖生长发生时间中的应用，所述LsFT基因具有SEQ IDNO.27所示的编码序列，并且所述延迟植物生殖生长发生时间通过抑制LsFT基因的功能来实现。
本发明方法所使用的LsFT基因不仅可以完全恢复拟南芥突变体的表型，而且表达量甚至达到野生型的两倍以上。而且，通过抑制例如干扰生菜中LsFT基因的表达，可以将生菜抽薹开花时间推迟至75天，几乎是LsFT基因表达没有被干扰的植物的两倍，这意味着使植株商品生产时间延长至约两倍的时间，也为种植提供了更加宽裕的时间安排，从而使显著提高生菜商品生产效率成为可能。
附图说明
图1显示了LsFT在生菜不同部位以及在抽薹时间不同的生菜品种中荧光定量PCR分析结果，其中，(A)LsFT在不同的生菜组织中的荧光定量PCR分析。YL:幼嫩的叶片；ML：成熟的叶片：FB：花芽；F：开放的花；AF：开放后缩紧的花；R：根；S:茎。(B)LsFT在抽薹时间不同的生菜品种中荧光定量PCR分析。
图2显示了LsFT蛋白在洋葱表皮上质壁分离后的亚细胞定位，其中，上面的一排图为对照(空载GFP(绿色荧光蛋白))，标尺＝50μm。
图3显示了LsFT异源过表达在拟南芥突变体ft-2中的表型观察及统计分析结果。其中，(A)ArFT和LsFT在ft-2、WT、35S-LsFT/ft-2(OV-1、OV-6和OV-14)表达系的荧光定量PCR分析；(B)LsFT异源过 表达到拟南芥突变体ft-2中的表型观察；(C)LsFT转基因植株的开花天数和莲座叶数目的统计；标尺＝6cm。
图4显示了生菜LsFT-RNAi株系的表达量分析及表型观察与统计的结果，其中，(A)生菜LsFT基因在对照组和转基因LsFT-RNAi株系叶片中的荧光定量PCR分析。(B)LsFT-RNAi株系在57天时的表型，标尺＝6cm。(C)LsFT-RNAi株系抽薹开花的表型统计。(D)LsAP1、LsAP3和LsLF在不同的LsFT-RNAi株系里的荧光定量PCR分析。
图5显示了遗传转化体系的建立过程和结果。其中，图5A显示生菜种子被播种在种子培养基上的照片；图5B和图5C显示了子叶侵染后被放到共培养培养基培养的照片；图5D显示有芽体从愈伤组织里长出的照片；图5E显示了第7号培养基(参见图5E)能够出芽的照片；图5F显示了在2周后长大的芽体被移到生根培养基里培养的照片；图5G和5H显示了植株被转入带有草炭营养土的培养容器中培养然后被移栽至常规大棚进行种植的照片。
具体实施方式
本发明人经过深入研究发现，LsFT基因不仅可以完全恢复拟南芥ft突变体的功能，而且还可以通过LsFT基因的反向调节例如RNAi技术显著地延迟生菜的开花时间，从而延长生菜的营养生长时间。另外，本发明人还发现，尽管生菜的再生体系比较成熟，但是在材料转入LsFT基因之后，现有技术推荐的再生体系不适用于用作生菜LsFT转基因材料的遗传转化，因此经过发明人的全面深入的研究，提出了可供生菜LsFT转基因材料的遗传转化体系。
于是，本发明第一方面提供了一种通过控制LsFT基因来调节生菜抽薹开花起始时间的方法，所述LsFT基因具有SEQ ID NO.27所示的编码序列。
控制包括正向调节和反向调节。正向调节例如促进所述基因的表达，增强所述基因的作用，从而使开花提前；反向调节例如抑制基因的表达，减弱甚至阻断所述基因的作用，从而使生殖生长例如抽薹开花延迟。表达的调节例如可以在转录水平上的调节或者转录后水平上例如翻译水平上的调节，例如mRNA丰度的调节或者翻译、蛋白剪切或运输水平上的调节。
在一些实施方式中，所述控制LsFT基因可以为抑制LsFT基因的功能，所述调节生菜抽薹开花起始时间可以为延迟生菜抽薹开花起始时间，即反向调节。在一些优选的实施方式中，所述抑制LsFT基因的功能通过LsFT基因的转录抑制或者转录后抑制来实现；在一些更优选的实施方式中，所述抑制LsFT基因的功能通过基因敲除或者基因沉默的方式实现；在一些进一步优选的实施方式中，所述抑制LsFT基因的 功能通过LsFT-RNAi技术来实现。例如，在一些实施方式中，LsFT-RNAi技术使用的LsFT-RNAi载体选用5'末端AscⅠ位点、3'末端SwaⅠ位点、5'末端BamHⅠ位点和3'末端SpeⅠ位点构建得到。
在一些实施方式中，所述LsFT-RNAi载体借助农杆菌可以通过子叶转染法浸染生菜子叶来导入。
在一些实施方式中，所述方法可以采用包括种子培养基、共培养培养基、分化培养基、生芽培养基、和生根培养基的遗传转化培养基体系进行，其中：
所述种子培养基包含4.44g/L的MS粉，30g/L的蔗糖和6.8g/L的琼脂；
所述共培养培养基包含4.44g/L的MS粉、30g/L的蔗糖，6.8g/L的琼脂，0.1mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA；
所述分化培养基包含4.44g/L的MS粉，30g/L的蔗糖，6.8g/L的琼脂，0.1至0.2mg/L的6-BA，0.1mg/L的NAA和300mg/L的头孢霉素；
所述生芽培养基包含2.22g/LMS粉，15g/L的蔗糖，2.22g/L的植物凝胶和300mg/L的头孢霉素；和/或
所述生根培养基包含2.22g/L的MS粉，15g/L的蔗糖，6.8g/L的琼脂和300mg/L的头孢霉素。
有趣的是，当共培养培养基中的6-BA为0.1mg/L并且NAA为0.3mg/L时，长出的愈伤组织会长出根而不长出芽体来。
本发明对这些培养基的配制方法没有特别的限制。但是优选的是，这些培养基可以按照如下方法配制：
MS培养基(种子培养基)：加入2.22gMS粉和15g蔗糖，定容到500ml，将pH调节为6.5至6.8，再加入琼脂3.4g，于121℃灭菌30min。
共培养培养基：加入2.22gMS粉、15g蔗糖和0.1mg/L6-BA，定容到500ml，将pH调节为6.5至6.8，再加入琼脂3.4g，于121℃灭菌30min。灭菌后再加入0.1mg/L NAA。
分化培养基：加入2.22gMS粉、15g蔗糖和0.1mg/L6-BA，定容到500ml，将pH调节为6.5至6.8，再加琼脂3.4g，121℃灭菌30min。灭 菌后再加0.1mg/L NAA和300mg/L头孢霉素。
生芽培养基：1.11gMS粉和7.5g蔗糖定容到500ml，将pH调节为6.5至6.8，再加入植物凝胶1.11g，121℃灭菌30min。灭菌后再加300mg/L头孢霉素。
生根培养基：1.11gMS粉和7.5g蔗糖定容到500ml，将pH调节为6.5至6.8，再加琼脂3.4g，121℃灭菌30min。灭菌后再加300mg/L头孢霉素。
在一些实施方式中，所述种子培养基、共培养培养基、分化培养基、生芽培养基和生根培养基pH各自独立地为6.5至6.8。
在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
(1)将生菜种子在30％次氯酸钠溶液里消毒5分钟，然后播种在所述种子培养基上；
(2)在播种后第6天时，切下幼苗子叶划伤并放入含有农杆菌的1/2MS液体培养基里侵染13分钟，然后将子叶放到所述共培养培养基中在28℃黑暗培养2天，所述农杆菌导入有LsFT-RNAi载体并且所述1/2MS液体培养基的OD600nm为0.2–0.3；
(3)将在共培养培养基培养后的的子叶移到分化培养基培养1至2周内从而在愈伤组织上长出芽体；
(4)将芽体切下并移植到生芽培养基中培养2周；
(5)将在生芽培养基中培养后的芽体转移到生根培养基中培养直至得到根长达到5至8cm的幼苗；
(6)将幼苗转入带有培养土的种植容器中驯化培养2周的时间，然后移栽至土壤中直至收获。
本发明在第二方面提供了LsFT基因在提前植物生殖生长发生时间中的应用，所述LsFT基因具有SEQ ID NO.27所示的编码序列，并且所述提前植物生殖生长发生时间通过增强LsFT基因的功能来实现。所述植物可以选自由十字花科(Cruciferae)植物组成的组，优选选自十字花科拟南芥属(Arabidopsis Heynh)植物，更优选为拟南芥(Arabidopsisthaliana)。
本发明在第三方面提供了LsFT基因在延迟植物生殖生长发生时间 中的应用，所述LsFT基因具有SEQ ID NO.27所示的编码序列，并且所述延迟植物生殖生长发生时间通过抑制LsFT基因的功能来实现。在一些实施方式中，所述植物可以选自由菊科(Asteraceae)植物组成的组，优选选自菊科莴苣属(Lactuca)植物，更优选为生菜(Lactuca sativaL.)。
实施例
下文将通过实施例的形式对本发明进行进一步的说明。这些实施例仅用于说明目的而非用于限定本发明的保护范围。
1.材料与方法
1.1植物材料
供试生菜材料S39购自北京农学院。供试拟南芥材料为FLOWERING LOCUS T(FT)基因的功能缺失突变体ft-2购自拟南芥官网(http://www.arabidopsis.org/index.jsp)。拟南芥种子经3％Triton处理2min，再经75％酒精处理2min两次，播种于含有1％蔗糖和0.2％植物凝胶的MS培养基上。在4℃条件下春化3天，然后转移到昼夜温度22/18℃、16h光照/8h黑暗条件下进行培养。一周后，种子萌发，将幼苗移栽到含有花卉营养土和蛭石的营养钵中继续培养。
1.2菌株与载体
供试所用的大肠杆菌DH5α感受态和中间载体PMD19-T分别购于艾德莱生物科技有限公司(北京)和天根生化科技有限公司(北京)。农杆菌菌株为C58(天根生化科技有限公司(北京))。表达载体PBI121，pFGC1008和PUC-19载体均由任华中实验室惠赠(天根生化科技有限公司(北京))。
1.3酶及生化试剂
总RNA、DNA提取试剂盒购于华越洋有限公司；DNA凝胶回收试剂盒和质粒小提试剂盒购于天根生化科技有限公司(北京)。各种限制性内切酶购于NEB和TAKARA公司。T4连接酶、DNA Maker、primer Star高保真酶及SYBR PremixEx Taq荧光定量试剂等均购自大连宝生物公司。引物合成和测序分别由生工生物公司和华大基因公司完成。
1.4试验方法
1.4.1生菜LsFT基因的克隆
提取生菜S39叶片的总RNA，然后利用反转录试剂盒反转录成cDNA。经利用同源序列比对，在生菜基因中找到目的基因LsFT，并用Primer5设计上下游引物，然后以cDNA为模板进行PCR扩增，得到LsFT的CDS(编码序列)(参见SEQ ID NO.27)。所用的引物见附表1(SEQID NO.1和2)。
1.4.2荧光定量PCR
本试验的模板选用生菜的各个部位和拟南芥叶片，用RNA提取试剂盒提取总RNA，RNA反转录合成cDNA。荧光定量PCR是在ABI PRISM 7500仪器(Applied Biosystems,美国)上进行的。每个qRT-PCR实验都进行3个生物学重复和3个技术重复(SEQ ID NO.15-22)。其中生菜以18srRNA(基因号为HM047292.1)为内参基因(SEQ ID NO.23和24)，拟南芥以ACTIN2基因为内参基因(SEQ ID NO.25和26)。表达倍数变化是运用2-ΔΔCt相对定量分析方法计算的。基因特异性引物见附表1。
1.4.3亚细胞定位
将LsFT去终止密码子的CDS整合到GFP瞬时表达载体PUC-19上(SEQ ID NO.9-10)，轻轻撕下洋葱表皮细胞，将其放在MS培养基上暗培养12h。制备LsFT:GFP与金粉结合的子弹，利用PDS-1000/He Particle Delivery System仪器将子弹轰击到培养好的洋葱表皮细胞上，最后利用Carl Zeiss LSM 510仪器观察荧光信号。
1.4.4拟南芥遗传转化
将LsFT的CDS序列连接到PBI121载体上(SEQ ID NO.3-4)，将构建好的载体通过电转法转到农杆菌C58里，再利用蘸花法侵染拟南芥突变体ft-2。转基因植株在含有40mg/L的KANA抗生素的MS培养上筛选，获得的阳性植株。将该阳性植株种在含有花卉营养土和蛭石的营养钵中。
1.4.5生菜遗传转化
1.4.5.1干扰载体的构建和农杆菌转化
LsFT-RNAi载体选择AscⅠ(5'末端)/SwaⅠ(3'末端)和BamHⅠ(5'末端)/SpeⅠ(3'末端)四个位点来构建得到(SEQ ID NO.5-8)，将LsFT-RNAi载体和pFGC1008载体电转到C58农杆菌菌株里，获得导入有所述干扰载体的农杆菌菌株。
1.4.5.2遗传转化体系的建立
转化使用子叶转染法进行。将生菜种子在30％次氯酸钠溶液里消毒5分钟，播种在MS培养基(种子培养基)上(参见图5A)。
将播种后第6天，将幼苗的子叶切下划伤，放入含有所述农杆菌菌株的MS液体培养基(OD600nm为0.2–0.3)中侵染13分钟。紧接着，将子叶放到共培养培养基中并在28℃黑暗培养2天(参见图5B和5C)。
2天之后，将子叶转移到分化培养基中，1至2周内长出愈伤，有芽体从愈伤里长出(参见图5D)。
切下芽体，并将其转移到如下生芽培养基中进行芽体诱导培养。
表1不同生芽培养基及其出芽效果
培养基编号 6-BA(mg/L) NAA(mg/L) 出芽数 培养数量 出芽率(％)
1 0 0 0 22 0.0
2 0 0.1 0 20 0.0
3 0 0.2 0 20 0.0
4 0 0.3 0 23 0.0
5 0 0.5 0 17 0.0
6 0.1 0 0 26 0.0
7 0.1 0.1 13 23 56.5
8 0.1 0.2 0 25 0.0
9 0.1 0.3 0 24 0.0
10 0.1 0.5 0 25 0.0
11 0.2 0 0 25 0.0
12 0.2 0.1 2 25 8.0
13 0.2 0.2 0 25 0.0
14 0.2 0.3 0 25 0.0
15 0.2 0.5 0 25 0.0
16 0.3 0 0 25 0.0
17 0.3 0.1 12 22 54.5
18 0.3 0.2 0 21 0.0
19 0.3 0.3 0 21 0.0
20 0.3 0.5 0 21 0.0
21 0.5 0 0 21 0.0
22 0.5 0.1 0 21 0.0
23 0.5 0.2 0 24 0.0
24 0.5 0.3 0 25 0.0
25 0.5 0.5 0 24 0.0
结果发现，第7号培养基(参见图5E)和第17号培养基能够的出芽率达到了50％以上，而其他现有技术推荐的几乎长不出不出芽体。芽体诱导以后的程序采用第7号生芽培养基进行。在2周后芽体长大，移到生根培养基里培养(图5F)。待根长长到5cm至8cm，将植株转入带有草炭营养土的培养容器中培养，在光照培养(200μmol光子m-2s-1，12h光期/12h暗期)里驯化培养2周，然后将植株移栽至常规大棚(图5G和5H)中进行种植。
遗传转化过程中所需的培养基按照如下方法配制：
MS培养基(种子培养基)：加入2.22gMS粉和15g蔗糖，定容到500ml，将pH调节为6.5至6.8，再加入琼脂3.4g，于121℃灭菌30min。
共培养培养基：加入2.22gMS粉、15g蔗糖和0.1mg/L6-BA，定容到500ml，将pH调节为6.5至6.8，再加入琼脂3.4g，于121℃灭菌30min。灭菌后再加入0.1mg/L NAA。
分化培养基：加入2.22gMS粉、15g蔗糖和0.1mg/L6-BA，定容到500ml，将pH调节为6.5至6.8，再加琼脂3.4g，121℃灭菌30min。灭菌后再加0.1mg/L NAA和300mg/L头孢霉素。
生芽培养基：1.11g MS粉和7.5g蔗糖定容到500ml，将pH调节为6.5至6.8，再加入植物凝胶1.11g，121℃灭菌30min。灭菌后再加300mg/L头孢霉素。
生根培养基：1.11gMS粉和7.5g蔗糖定容到500ml，将pH调节为6.5至6.8，再加琼脂3.4g，121℃灭菌30min。灭菌后再加300mg/L头孢霉素。
2.结果与分析
2.1生菜LsFT基因的定量表达分析
本发明人利用荧光定量PCR技术分析了生菜中LsFT在幼嫩的叶片(YL)、成熟的叶片(ML)、花芽(FB)、开放的花(F)、闭合的花(AF)、根(R)、茎(S)中的表达量。结果表明，LsFT在成熟的叶片中表达量最 高，而且令人惊奇的是，成熟叶片中的表达量显著高于其他部分的表达量。为了探索LsFT的表达是否与生菜的抽薹开花有关，本发明人选择了9株抽薹时间不一样的植株(S24:59-61d；S43和S7：46-48d；S1、S3和S8：39-41d；S28和S26:34–36d；S39:29–31d)进行荧光定量分析。结果显示，生菜中LsFT的表达量与抽薹开花成正相关。而且，令人想不到的是，在最早抽薹的植株S39中，LsFT的表达量竟然是最晚抽薹植株S24的356倍！(如图1所示)。
2.2生菜LsFT蛋白的亚细胞定位分析
本发明人构建了LsFT:GFP融合蛋白瞬时表达载体，利用粒子轰击的方法，将表达载体打入洋葱表皮细胞，Carl Zeiss LSM 510仪器观察荧光信号，结果表明，LsFT蛋白定位在细胞核里，其中空载GFP作为对照(如图2所示)。
3.3生菜LsFT可以恢复拟南芥突变体ft-2的表型
为了检验生菜LsFT基因的功能在其他植物中是否能够发挥作用，本发明人以模式植物拟南芥作为材料，将35S::LsFT转到拟南芥突变体ft-2中。通过抗性培养基筛选和DNA鉴定(鉴定使用的引物参见表1中的SEQ ID NO.11至12)，本发明人获得30株阳性植株，所有植株开花都比ft-2早。基于表型的表现程度，本发明人把转基因植株分成三类：第一类植株表型最明显，比WT开花早9-11天；第二类植株表型适中，比野生型开花早5-7天；第三类植株表型最弱，和WT开花时间相似但比ft-2开花早9-11天。荧光定量的结果显示，转基因植株表型的表现程度与LsFT的表达量成正相关。令人预料不到的是，LsFT不仅可以完全恢复拟南芥突变体ft-2的表型，而且FT基因的表达量甚至达到野生型的两倍以上！(如图3所示)。
2.4干扰LsFT基因导致生菜抽薹开花变晚
为了进一步了解LsFT在生菜中的生物学功能，本发明人将LsFT-RNAi转化到S39植株中，通过DNA鉴定获得7株T0代阳性植株(鉴定使用的引物参见表1中的SEQ NO.13至14)。本发明人从中选择了3个株系(Ri-22，Ri-9和Ri-63)的T1代进行下一步的研究，三株抽薹显著晚于CK。例如，Ri-22，Ri-9和Ri-63的抽薹天数分别为45，55和75天，对照植株38天抽薹，这意味着使植株商品生产时间延长至约两倍的时间，也为种植提供了更加宽裕的时间安排，从而使显著提高生菜商品生产效率成为可能。另外，转基因植株的第一朵花芽和第一朵开放的花出现的时间也显著地推迟了。这些数据都证明了转基因植株中LsFT含量的下降抑制了生菜抽薹开花。本发明人继续检测了下游基因LsAP1，LsAP3和LsLFY的变化量，与对照植株相比，转基因植株的三个下游基因的表达量都显著地下降，分别下降到43％、27％和17％，这进一步证明LsFT基因在生菜抽薹中发挥着重要的作用，利用基于LsFT基因的生物技术可以延迟植物的营养生长。
表2.研究中使用的引物列表
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明。另外，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国农业大学
<120> 一种通过控制LsFT基因来培育耐抽薹型生菜的方法
<130>
<160> 27
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgatgccta gggagaggga ccc 23
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttatcttctt cgcccaccaa 20
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctctagaat gatgcctagg gagagggacc c 31
<210> 4
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tcccccgggt tatcttcttc gcccaccaa 29
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttggcgcgcc cgtgtgatag gagatgttct 30
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
atttaaatga tcgaccatca ctaa 24
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
ggactagtcg tgtgatagga gatgttct 28
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
cgggatccga tcgaccatca ctaa 24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
ggactagtat gatgcctagg g 21
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
tcccccgggt cttcttcgcc caccaa 26
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
gacgcacaat cccactatcc 20
<210> 12
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
tcccccgggt tatcttcttc gcccaccaa 29
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
cgtcttcaaa gcaagtggat t 21
<210> 14
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
cgaaaccaat gcctaaagag ag 22
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
gacagtttca caaagtcgat taa 23
<210> 16
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
tgtgaaaagc ccggagg 17
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ctagagaaag acataccctc ccac 24
<210> 18
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tcacttgttc atgtgttgaa tca 23
<210> 19
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
tgccggaaga gggtgaaaa 19
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
tcaaggaagg cgatgatcat g 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
tctgtcatgc tgaacgcagc 20
<210> 22
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ctaaaactgg agatgaccac cacc 24
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gtgagtgaag aagggcaatg 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
agtgaattgg tttcgagagc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 25
ccttcgtctt gatcttgcgg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 26
agcgatggct ggaacagaac 20
<210> 27
<211> 528
<212> DNA
<213> 生菜（Lactuca sativa L.）
<400> 27
atgatgccta gggagaggga cccgttggtt gttggacgtg tgataggaga tgttctcgac 60
agtttcacaa agtcgattaa cctttctgta acatacaacg atagagaagt tagcaatggg 120
tgcgagctaa aaccctctca ggtggtaaat cagcctaggg ttgatattgg aggtgacgac 180
ctccgggctt ttcacacttt agtgatggtc gatcctgatg ctccaagtcc tagtgaccct 240
aaccttaggg aatacttgca ttggttggtg accgatatac cagcgaccac gggagcacgt 300
tttggccaag aaattgtgtg ctatgagagt ccaaggccgt caatgggaat tcatcgcatg 360
gtttttgtgt tattccgaca gttgggtcga caaactgtgt atgcccctgg atggcgtcag 420
aacttcaata ctaaagactt tgcggagctt tacaaccttg gttctccggt ggcagcagtc 480
tacttcaact gccaacgtga aagtgggttt ggtgggcgaa gaagataa 528

Claims (10)

1.一种通过控制LsFT基因来调节生菜抽薹开花起始时间的方法，其特征在于，所述LsFT基因具有SEQ ID NO.27所示的编码序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述控制LsFT基因为抑制LsFT基因的功能，并且所述调节生菜抽薹开花起始时间为延迟生菜抽薹开花起始时间。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述抑制LsFT基因的功能通过LsFT基因的转录抑制或者转录后抑制来实现；优选的是，所述抑制LsFT基因的功能通过基因敲除或者基因沉默的方式实现；更优选的是，所述抑制LsFT基因的功能通过LsFT-RNAi技术来实现。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，LsFT-RNAi技术使用的LsFT-RNAi载体选用5'末端AscⅠ位点、3'末端SwaⅠ位点、5'末端BamHⅠ位点和3'末端SpeⅠ位点构建得到。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述LsFT-RNAi载体借助农杆菌通过子叶转染法浸染生菜子叶来导入。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述方法采用包括种子培养基、共培养培养基、分化培养基、生芽培养基、和生根培养基的遗传转化培养基体系进行，其中：
所述种子培养基包含4.44g/L的MS粉，30g/L的蔗糖和6.8g/L的琼脂；
所述共培养培养基包含4.44g/L的MS粉、30g/L的蔗糖，6.8g/L的琼脂，0.1mg/L的6-BA和0.1mg/L的NAA；
所述分化培养基包含4.44g/L的MS粉，30g/L的蔗糖，6.8g/L的琼脂，0.1至0.2mg/L的6-BA，0.1mg/L的NAA和300mg/L的头孢霉素；
所述生芽培养基包含2.22g/LMS粉，15g/L的蔗糖，2.22g/L的植物凝胶和300mg/L的头孢霉素；和/或
所述生根培养基包含2.22g/L的MS粉，15g/L的蔗糖，6.8g/L的琼脂和300mg/L的头孢霉素。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述种子培养基、共培养培养基、分化培养基、生芽培养基和生根培养基pH各自独立地为6.5至6.8。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将生菜种子在30％次氯酸钠溶液里消毒5分钟，然后播种在所述种子培养基上；
(2)在播种后第6天时，切下幼苗子叶划伤并放入含有农杆菌的1/2MS液体培养基里侵染13分钟，然后将子叶放到所述共培养培养基中在28℃黑暗培养2天，所述农杆菌导入有LsFT-RNAi载体并且所述1/2MS液体培养基的OD600nm值为0.2–0.3；
(3)将在共培养培养基培养后的的子叶移到分化培养基培养1至2周内从而在愈伤组织上长出芽体；
(4)将芽体切下并移植到生芽培养基中培养2周；
(5)将在生芽培养基中培养后的芽体转移到生根培养基中培养直至得到根长达到5至8cm的幼苗；
(6)将幼苗转入带有培养土的种植容器中驯化培养2周的时间，然后移栽至土壤中直至收获。
9.LsFT基因在提前植物生殖生长发生时间中的应用，所述LsFT基因具有SEQ ID NO.27所示的编码序列，并且所述提前植物生殖生长发生时间通过增强LsFT基因的功能来实现。
10.LsFT基因在延迟植物生殖生长发生时间中的应用，所述LsFT基因具有SEQ IDNO.27所示的编码序列，并且所述延迟植物生殖生长发生时间通过抑制LsFT基因的功能来实现。
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