CN106636193A - 一种利用RNAi载体调节菊花开花时间的方法 - Google Patents

一种利用RNAi载体调节菊花开花时间的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于菊花栽培技术领域，具体涉及一种利用RNAi载体调节菊花开花时间的方法。该方法包括构建RNAi表达载体、制备浸染用农杆菌菌液、对菊花愈伤组织进行浸染、对转基因菊花幼苗进行筛选、鉴定、培养等步骤。本申请所采用构建菊花新品种的方法，对于菊花基因组没有大的影响，不会改变菊花花型、花色等特性，但可较好调节菊花开放时间，可使菊花提前6~8天开花，表现出较好的应用效果；同时由于这一表观遗传修饰可以稳定遗传，借助成熟的组培体系，可使提前开花的菊花新品种稳定、快速繁殖，从而节约大量的人力、物力成本。总之，本申请在菊花花期的调控中表现出较好的、较为稳定的调控效果，表现出较好的理论和应用价值。

Description

一种利用RNAi载体调节菊花开花时间的方法
技术领域
本发明属于菊花栽培技术领域，具体涉及一种利用RNAi载体调节菊花开花时间的方法。
背景技术
菊花是一种比较常见的观赏花卉，具有花色多样、花型各异以及花期长等特点，是花卉产业中极具经济价值的花卉品种。栽培过程中，由于各地大型节假日活动的繁盛、菊花节的开展，为适应不同地域、不同时间段花展布置的需要，亟需培育一些能够在节假日期间开花的中花品种、晚花品种等早花系菊花。因此，对于菊花花期进行调控具有十分重要的应用意义。
植物从营养生长向生殖生长的转化过程称为“成花转变”，这个过程的关键是成花诱导。植物成花诱导过程由自身遗传物质和外界环境因素两方面决定。外界环境的调控途径有很多，传统菊花花期调控技术中主要是利用菊花花芽分化对光照时间和强度的要求，通过遮光或补光处理，人为制造短日照环境，促使菊花提前开花；此外，人们也会根据栽培经验计算好播种、扦插、修剪、打顶的时间，利用摘心、修剪、摘蕾、剥芽摘叶、环割等措施达到花期调控的目的。这两种方法都需要经验丰富的专业技术人才，过程繁琐，而且每年都要根据实际情况进行处理，极大的损耗人力资源。
中国专利CN200810049322公开了一种调控菊花花期的方法，该方法用5-氮杂胞嘧啶核苷处理菊花组织培养的试管苗，然后移栽，使菊花提前开花。但是这种处理方式仍然容易受具体生长环境、栽培条件等方式制约，容易发生逆转，存在效果不够稳定缺陷，加上这种处理方式并不能形成能够稳定遗传的菊花品种，每年均需处理，因而生产中应用较为有限。因此，培育新的能能够提前开花的菊花品系仍然是现有菊花培育中的重点工作。
发明内容
本发明目的在于提供一种利用RNAi干涉技术来调节菊花开放时间的方法，该方法通过构建特定的RNAi载体，利用所构建的特定RNAi载体来调节菊花组织体内MET1基因表达水平，进而促进菊花的提前开放。
本申请的技术方案详述如下。
一种利用RNAi载体调节菊花开花时间的方法，该方法包括如下步骤：
（1）根据菊花DNA甲基转移酶MET1基因的全长cDNA序列中的保守序列，构建RNAi表达载体，具体为：
参考《菊花与青蒿MET1基因克隆及菊花RNAi载体构建》（施冬青，2014年河南大学硕士论文）中方法，利用3’和5’RACE技术获得菊花甲基转移酶MET1基因全长cDNA序列，然后针对菊花MET1基因全长cDNA序列中的保守片段序列构建多个RNAi表达载体；
所构建的RNAi表达载体，由于以菊花MET1基因中的保守序列（100-300bp）作为目的片段，因此当菊花MET1基因与RNAi表达载体配对结合时，可使相应配对部分的碱基形成发夹结构，形成双链siRNA，对目标基因MET1的mRNA起降解作用，从而促使MET1基因的失活，使其无法正常表达；
所述保守片段序列包括3个部分：Chry1、Chry3、Chry4；
其中Chry1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，即：
Chry1:CCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTACAGCTTTTCAACTTATTAAAATCATATGAAATATAAAGACATGCAGCACAACATTAATGTTCCTTTTACAACATAGGATGAGACATTCTTAACATTTTAAATATTTATACAGGGATTTTCTGGTATGAATAGGTTCAATACAAGCACATGGAGCAAGGTTCAGTGTGAAATGATATTGGCGCTTTTGTCTTTTGCTGAGTACTTCCGTCCCAAGTATTTCTTGCTAGAAAATGTGAGGAACTTTG；
Chry3的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，即：
Chry3:AGGGGTAATGACGGCAGATGATGGAAGTGGATTCTGTTTAGATGATGAACCTGGTAGTGCATCAGGTTCCTCTGCTGCACCAAATGAAGACGGCATCCCTATATACCTGAGTGCTATAAAGGAATGGATGATTGAATTTGGATCATCAATGGTTTTCATTTCAATTCGAACAGATATGGCCTGG；
Chry4的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，即：
Chry4:CAGAAGACAATGAGCAGGAAGATTGTGAAGAACCTGAAGAAGAAAGCACCCTTCCTGTTCAGGAACCTGAAAAACCTCATTCTGCATCAAAGGAAAAGAAATCTCGCATTTCAAAAACCGACATCAGTTGGGTTGG；
对上述特定保守区段进行PCR扩增时，特异性引物序列设计如下：
PCR克隆扩增保守序列Chry1时，引物序列设计如下：
FADi1-XbalⅠ: GCTCTAGACCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTA，
FADi1-XhoⅠ: CCGCTCGAGCCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTA；
FADi1-HindⅢ: CCCAAGCTTCACAAAGTTCCTCACATTTTCTAGCAA，
FADi1-KpnⅠ: GGGGTACCCACAAAGTTCCTCACATTTTCTAGCAA；
PCR克隆扩增保守序列Chry3时，引物序列设计如下：
Chry3-Sense-LB-FADi-XbaI: GCTCTAGAAGGGGTAATGACGGCAG，
Chry3-Sense-RB-FADi-HindIII:CCCAAGCTTCCAGGCCATATCTGTTC；
Chry3-Antisense-LB-FADi-XhoI:CCGCTCGAGAGGGGTAATGACGGCA，
Chry3-Antisense-RB-FADi-Kpn:GGGGTACCCCAGGCCATATCTGTTCG；
PCR克隆扩增保守序列Chry4时，引物序列设计如下：
Chry4-Sense-LB-FADi-XbaI:GCTCTAGACAGAAGACAATGAGCAG，
Chry4-Sense-RB-FADi-HindIII:CCCAAGCTTCCAACCCAACTGATGT；
Chry4-Antisense-LB-FADi-XhoI:CCGCTCGAGCAGAAGACAATGAGC，
Chry4-Antisense-RB-FADi-Kpn:GGGGTACC CCAACCCAACTGATGTC；
所述多个RNAi表达载体具体有：Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry1-KX-HX、Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry3-KX-HX和Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry4-KX-HX；
（2）将步骤（1）中所构建RNAi表达载体转化农杆菌，具体为：
利用冻融法，将步骤（1）中所构建的多个RNAi表达载体分别转入农杆菌GV3101，并筛选、保留转化正确的菌株，并制备浸染液备用；
详细步骤为：
将0.5~1µL的RNAi表达载体（大约0.5~1μg）加入到100 μL的GV3101农杆菌感受态菌液中，冰浴30 min，再液氮中冷冻1.5 min，再立即置于37℃水浴中5 min；
加入1000 μL的YEB 液体培养基，148 rpm、28℃、避光培养3 h；
培养结束后，5000 rpm离心5 min，保留约200μL上清（其余弃掉），用移液枪将沉淀吹打混匀，涂布于加有Rif（利福平，50mg/L）和壮观霉素（浓度为50 mg/L）的YEB固体平板上，倒置、避光、28℃，培养1~2天，将生成单菌落保存备用或直接制备浸染用农杆菌菌液；
制备浸染用农杆菌菌液时，具体制备方法为：
将筛选获得的农杆菌菌株于YEB培养基（50 mg/L Rif+50 mg/L壮观霉素）中，培养至OD600=0.5~0.7左右，然后5000rpm离心15 min，以收集菌体；将所收集农杆菌菌体用含10%蔗糖的1/2MS培养液重悬，然后再28℃、200 rpm 的条件下培养2~3 h，作为浸染液备用；
（3）制备菊花愈伤组织，并浸染，具体为：
制备菊花愈伤组织，利用步骤（2）中所制备浸染液对菊花愈伤组织进行浸染，浸染后将愈伤组织用无菌水短暂冲洗一次，放在无菌滤纸上自然晾干后再进行继续培育；浸染时，将菊花愈伤组织置于农杆菌菌液中浸泡5~7 min，浸泡期间可不断摇晃，以确保愈伤组织与菌液充分接触；
具体培育过程为：
消毒后外植体先接种于愈伤诱导培养基上，诱导形成愈伤组织，将所形成的愈伤组织在分化培养基上预培养2~3周后用于农杆菌浸染；
农杆菌浸染后愈伤组织再接种于分化培养基中暗培养2~3 d左右；
然后将愈伤组织置于含有cef（头孢霉素，100 mg/L）的无菌水中浸洗3~5 min，无菌水冲洗干净后，将愈伤组织铺于无菌滤纸上，自然风干，转接于延迟培养基中延迟培养2~4 d；
将延迟培养后愈伤组织再转接到选择培养基中培养1~2个月；
最后将选择培养基中愈伤组织置于生根培养基中促进生根；
菊花组培期间温度条件为：20~25℃；
所述分化培养基为：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA；
所述延迟培养基为：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA+200 mg/L cef；
所述选择培养基为：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA+100 mg/L cef +8 mg/L Kan；
所述生根培养基为：MS+10 mg/L Kan；
菊花愈伤组织的制备方法，具体可参考如下步骤：
取菊花幼嫩的茎段作为外植体，对外植体进行消毒后接种于愈伤诱导培养基上，诱导形成愈伤组织，将所形成的愈伤组织在分化培养基上预培养2~3周后用于农杆菌浸染；
对外植体进行消毒时，具体方式例如为：先用自来水冲洗外植体10 min，然后在超净工作台上用75%的乙醇浸泡5~8 s，再在0.1%的氯化汞中浸泡5 min，期间可不断摇晃，以确保消毒彻底，最后再用无菌蒸馏水清洗外植体3~5次；
将外植体置于愈伤诱导培养基上培养时，可将外植体切割为0.5~0.8 mm长的茎段进行接种，所述愈伤诱导培养基为：MS+2.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L 2，4-D ，pH= 5.8，培养条件为：外植体接种后先暗培养一周，再每天光照16 h/黑暗8 h进行培养；
所述菊花，具体例如可采用“紫精灵”品种的幼嫩的茎段（具体例如未5cm长度左右侧枝茎段），
（4）转基因植株筛选、鉴定，具体为：
对步骤（3）中生根后菊花幼苗进行鉴定，确保为正确的转基因植株后，移栽到大田，正常管理；
以河南地区为例，4月中旬左右将根系发达健壮的转基因菊花幼苗炼苗后，5月初移栽到大田，生长过程中及时摘除腋芽，9月下旬左右摘除侧蕾，仅留主蕾开花。
本发明的主要技术原理是：通过干涉维持CpG位点DNA甲基化酶的基因（MET1）从而使DNA甲基化水平降低，进而改变菊花表观遗传信息，促进菊花花期提前开放。本发明的主要技术操作思路为：首先通过3’和5’RACE技术得到菊花DNA甲基转移酶基因（MET1）全长的cDNA序列，然后构建可以沉默MET1基因的特定RNAi表达载体，再然后通过将预培养的菊花愈伤组织浸泡在含有特定RNAi表达载体的农杆菌菌液中，使RNAi表达载体通过植物伤口进入细胞，实现外源基因向植物组织细胞的转移与整合，最后经过组织培养，再生出转基因植株，常规炼苗后即可移栽至田间，正常管理，从而获得菊花开放时间有所调整的新品种菊花。
检测表明，与非转基因菊花相比，经筛选获得的转基因菊花植株在不同条件下（组织培养、大田栽种），其MET1基因表达丰度和DNA甲基化水平都有明显下降（转基因植株的甲基转移酶CmMET1基因的表达量为对照的53.25%，从而引起转化植株的DNA甲基化水平比对照下降12%），已获得的表观遗传修饰可以稳定遗传，因此可以通过扦插进行大量繁殖。
总体而言，本申请所采用构建菊花新品种的方法，对于菊花基因组没有大的影响，不会改变菊花花型、花色等特性，但可较好调节菊花开放时间，可使菊花提前6~8天开花，表现出较好的应用效果；同时由于这一表观遗传修饰可以稳定遗传，借助成熟的组培体系，可使提前开花的菊花新品种稳定、快速繁殖，从而节约大量的人力、物力成本。总之，本申请在菊花花期的调控中表现出较好的、较为稳定的调控效果，同时也为菊花新品种培育提供了较好的借鉴和参考，表现出较好的理论和应用价值。
附图说明
图1为茎段愈伤组织诱导与再生体系的组织培养过程，其中A：初期培养，B：转接培养，C：分化初期——出芽，D：分化后期——成苗，E：生根培养，F： 移栽；
图2为RNAi干涉后对菊花花期影响效果，其中CK：菊花“紫精灵”对照组，处理组1、2：转基因植株。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明，但需要说明的是，下述实施例仅以较为常见的菊花品种“紫精灵”为例，进行了相关实验，但不应理解为本发明依赖于或仅可用于这一菊花品种，初步实验表明，本申请对于常规菊花栽培品种（如国庆红、洹水金秋、南农丽雅等品种）都具有类似的促进提前开放的技术效果。
实施例1
本发明的应用依赖于特定RNAi表达载体的构建，相关载体构建过程，具体操作可参见《菊花与青蒿MET1基因克隆及菊花RNAi载体构建》（施冬青，2014年河南大学硕士论文）中方法及构建过程。为保证文本结构的完整性，在本实施例中，仅就相关相关过程简要介绍如下。
、获得菊花DNA甲基转移酶MET1基因全长cDNA序列
利用3’和5’RACE技术获得菊花甲基转移酶MET1基因全长cDNA序列，然后以菊花MET1基因中的保守序列（100-300bp）作为目的片段，所述保守片段序列包括3个部分：Chry1、Chry3、Chry4；
其中Chry1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，即：
Chry1:CCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTACAGCTTTTCAACTTATTAAAATCATATGAAATATAAAGACATGCAGCACAACATTAATGTTCCTTTTACAACATAGGATGAGACATTCTTAACATTTTAAATATTTATACAGGGATTTTCTGGTATGAATAGGTTCAATACAAGCACATGGAGCAAGGTTCAGTGTGAAATGATATTGGCGCTTTTGTCTTTTGCTGAGTACTTCCGTCCCAAGTATTTCTTGCTAGAAAATGTGAGGAACTTTG；
Chry3的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，即：
Chry3:AGGGGTAATGACGGCAGATGATGGAAGTGGATTCTGTTTAGATGATGAACCTGGTAGTGCATCAGGTTCCTCTGCTGCACCAAATGAAGACGGCATCCCTATATACCTGAGTGCTATAAAGGAATGGATGATTGAATTTGGATCATCAATGGTTTTCATTTCAATTCGAACAGATATGGCCTGG；
Chry4的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，即：
Chry4:CAGAAGACAATGAGCAGGAAGATTGTGAAGAACCTGAAGAAGAAAGCACCCTTCCTGTTCAGGAACCTGAAAAACCTCATTCTGCATCAAAGGAAAAGAAATCTCGCATTTCAAAAACCGACATCAGTTGGGTTGG。
、PCR克隆保守序列
提取“紫精灵”DNA，并反转录为cDNA，以cDNA为模板，进行PCR扩增，PCR扩增时，特异性引物序列设计如下：
PCR克隆扩增保守序列Chry1时，引物序列设计如下：
FADi1-XbalⅠ: GCTCTAGACCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTA，
FADi1-XhoⅠ: CCGCTCGAGCCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTA；
FADi1-HindⅢ: CCCAAGCTTCACAAAGTTCCTCACATTTTCTAGCAA，
FADi1-KpnⅠ: GGGGTACCCACAAAGTTCCTCACATTTTCTAGCAA；
PCR克隆扩增保守序列Chry3时，引物序列设计如下：
Chry3-Sense-LB-FADi-XbaI: GCTCTAGAAGGGGTAATGACGGCAG，
Chry3-Sense-RB-FADi-HindIII:CCCAAGCTTCCAGGCCATATCTGTTC；
Chry3-Antisense-LB-FADi-XhoI:CCGCTCGAGAGGGGTAATGACGGCA，
Chry3-Antisense-RB-FADi-Kpn:GGGGTACCCCAGGCCATATCTGTTCG；
PCR克隆扩增保守序列Chry4时，引物序列设计如下：
Chry4-Sense-LB-FADi-XbaI:GCTCTAGACAGAAGACAATGAGCAG，
Chry4-Sense-RB-FADi-HindIII:CCCAAGCTTCCAACCCAACTGATGT；
Chry4-Antisense-LB-FADi-XhoI:CCGCTCGAGCAGAAGACAATGAGC，
Chry4-Antisense-RB-FADi-Kpn:GGGGTACC CCAACCCAACTGATGTC；
对PCR扩增产物分别进行电泳，并提取、回收，备用。
、与pMD18-T载体进行连接
将步骤2中PCR扩增产物分别与pMD18-T连接，以Chry4序列为例，具体过程为：
将正向Chry4序列（以Chry4-Sense-LB-FADi-XbaI、 Chry4-Sense-RB-FADi-HindIII引物序列克隆获得）、反向Chry4序列（以Chry4-Antisense-LB-FADi-XhoI、Chry4-Antisense-RB-FADi-Kpn引物序列克隆获得）分别与pMD18-T连接，然后将连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞（购于大连宝生物），挑取阳性克隆菌株，并进行测序验证，最终获得重组正确的质粒pMD18-T- Chry4-HX和pMD18-T- Chry4-KX。
、双酶切RNAi空载（Dhpart27RNAiFADP1P4）和T-KX质粒，并连接
需要解释的是，所述T-KX质粒，即步骤3中所构建的重组质粒，如：pMD18-T- Chry4-KX。
将含有RNAi空载质粒（Dhpart27RNAiFADP1P4）和含有质粒T-KX的菌株（如步骤3中含有pMD18-T-Chry4-KX质粒的菌株）预先活化，并提取质粒备用（参考takara质粒提取试剂盒说明书进行操作）；
将所提取的RNAi空载质粒（Dhpart27RNAiFADP1P4）和质粒T-KX（如步骤3中的pMD18-T-Chry4-KX）分别采用XhoⅠ和KpnⅠ进行双酶切，将酶切产物分别进行回收、纯化；
将酶切产物利用T4 DNA Ligase进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，筛选，酶切验证，最终获得：Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry4-KX、Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry3-KX、Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry1-KX。
、双酶切步骤4中所构建重组质粒及T-HX，并连接
所述T-HX质粒，即步骤3中所构建的重组质粒，如：pMD18-T- Chry4-HX。
利用XbalⅠ和HindⅢ对步骤4中所构建重组质粒和步骤3中所构建T-HX质粒进行双酶切，将酶切产物分别进行回收、纯化；
将酶切产物利用T4 DNA Ligase进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5ɑ感受态细胞，筛选，酶切验证，最终获得RNAi表达载体：Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry1-KX-HX、Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry3-KX-HX和Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry4-KX-HX。
实施例2
本实施例就转化菊花用农杆菌菌液（转化液）的制备过程，简要介绍如下。
利用冻融法，将实施例1中所构建的多个RNAi表达载体分别转入农杆菌GV3101，并筛选、保留转化正确的菌株，并制备浸染液备用；
详细步骤为：
将0.5~1µL的RNAi表达载体（大约0.5~1μg）加入到100 μL的GV3101农杆菌感受态菌液中，冰浴30 min，再液氮中冷冻1.5 min，再立即置于37℃水浴中5 min；
加入1000 μL的YEB 液体培养基，148 rpm、28℃、避光培养3 h；
培养结束后，5000 rpm离心5 min，保留约200μL上清（其余弃掉），用移液枪将沉淀吹打混匀，涂布于加有Rif（50 mg/L）和壮观霉素（50 mg/L）的YEB固体平板上，倒置、避光、28℃培养1~2天，随机挑取12个单菌落，培养24 h后，以目的序列的特异性引物为引物，进行菌液PCR筛选，选取阳性克隆保存备用或直接制备浸染用农杆菌菌液。
制备浸染用农杆菌菌液时，具体制备方法为：
将筛选获得的农杆菌菌株于YEB培养基（50 mg/L Rif+50 mg/L壮观霉素）中，培养至OD600=0.5~0.6左右，然后5000rpm离心15 min，以收集菌体；
将所收集农杆菌菌体用含10%蔗糖的1/2MS培养液重悬，然后再28℃、200 rpm 的条件下培养2~3 h，作为浸染液备用。
实施例3
本实施例就菊花的具体转化、筛选过程，简要介绍如下。
、制备菊花愈伤组织
本实施例以菊花“紫精灵”品种为例，制备了愈伤组织，外植体来源为：
取菊花幼嫩的茎段（为确保实验的可重复性和实验结果的稳定性，发明人以组培苗为实验材料进行实验，具体为：将组培幼苗移栽到实验田后生长3个月，摘除顶端优势，使侧枝生长，一个月左右后生长至5 cm长度左右的侧枝茎作为外植体）用自来水冲洗10 min；然后在超净工作台上用75%的乙醇浸泡6s，取出在0.1%的氯化汞中浸泡5 min，期间不断摇晃；最后用无菌蒸馏水清洗茎段5次；然后接种于愈伤诱导培养基上。
为确定愈伤诱导培养基的最佳配方，发明人对愈伤诱导培养基进行了优化组合实验，简要介绍如下。
愈伤诱导培养基在MS+3%蔗糖+0.7%琼脂粉的基础培养基（pH=5.8）上，添加不同浓度的6-BA和2，4-D后，调节pH=5.8，然后121℃高压灭菌20 min进行接种实验。
实验过程中，每瓶接种7根茎段（0.5~0.8 mm左右），每种培养基5瓶重复，每个重复3次。培养时，培养温度为20℃~25℃，先暗培养一周，再每天光照16 h、黑暗8 h进行诱导直至切口处长出翠绿色的愈伤组织（大约需要20~30 d左右）。
实验过程中，6-BA和2，4-D分别设置3个浓度梯度，其中6-BA的浓度1.0 mg/L、2.0mg/L、3.0 mg/L，2，4-D的浓度为0.5 mg/L、1.0 mg/L、1.5 mg/L，共9种培养基配方。最终实验结果如下表1所示。
表1， 不同培养基对“紫精灵”茎段愈伤组织诱导的影响：
注：字母a-g，不同字母表示在0.05水平具有显著差异，同列内的相同字母则表示在该水平上的差异不显著。
以诱导率（诱导率=长出愈伤的茎段数/接种的炽情茎段数×100%）和愈伤生长状态为判定标准，可以看出，最佳愈伤诱导培养基组合为MS+2.0 mg/L 6-BA+ 1.0 mg/L 2，4-D，此时诱导率为76.7%。
进一步分析可以看出，当6-BA 浓度不超过 2.0 mg/L时，诱导率随6-BA 的浓度增加而上升，愈伤组织的质地松软湿润；但 2，4-D 浓度过高会导致合作组织质地硬化、偏干，生长缓慢。实验过程中观察发现，在MS+2.0 mg/L 6-BA+ 1.5 mg/L 2，4-D 的培养基上，愈伤诱导率虽然可以达到77.3%，但在转接培养过程中愈伤组织容易褐化，不利于后期实验，因而并不适合作为最佳培养基。
、将步骤1中培育的愈伤组织进行预分化培养
将步骤1中最佳愈伤诱导培养基组合上诱导的愈伤组织进行预分化培养，为确定最佳的分化培养基组合，发明人同样进行了分化培养基的优化组合，简要介绍如下。
分化培养基在MS+3%蔗糖+0.7%琼脂粉的基础培养基上，添加不同浓度的6-BA和NAA，然后调节pH=5.8，121℃高压灭菌20 min后，进行实验。
实验过程中，6-BA设置3个梯度，分别0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L；NAA设置5个梯度，分别为0.1 mg/L、0.4 mg/L、0.6 mg/L、0.8 mg/L、1.0 mg/L。
实验过程中，选取嫩绿、松软、湿润、生长快的菊花愈伤组织接种于愈伤分化培养基，每瓶接种7块愈伤，每种培养基5瓶重复，每个重复3次。培养时，培养温度为20℃~25℃。培养过程中，25天一个周期连续转接2~3次后，愈伤组织即开始出现芽点，而对不同组合的培养基上出现芽点的时间在统计上没有明显差异，因而在转接2次后，统计愈伤的分化率。具体统计结果如下表2所示。
表2，不同培养基对“紫精灵”茎段愈伤组织分化的影响：
注：字母a-g，不同字母表示在0.05水平具有显著差异，同列内的相同字母则表示在该水平上的差异不显著。
对上表分析可以看出，细胞分裂素与生长素的比值偏大，有利于芽的形成。当6-BA浓度为1.0 mg/L 6-BA ，NAA浓度为0.4~1.0 mg/L 时，愈伤组织的分化率明显高于其他培养基配方，且彼此之间差异也小，分化率范围为68.3~75.3。
以分化率（分化率=分化的愈伤数/接种的总愈伤数×100%）和分化苗生长状态为判定标准，最终确定最佳的愈伤分化培养基为：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6 mg/L NAA（PH5.8），此时分化率为75.3%。
、将预分化后愈伤组织进行浸染，延迟培养和选择培养
利用实施例2中所制备浸染液，对步骤2中预分化后愈伤组织进行浸染，浸染时，将菊花组织置于农杆菌菌液中浸泡5~7 min，浸泡期间可不断摇晃，以确保愈伤组织与菌液充分接触；
浸染后将愈伤组织用无菌水短暂冲洗一次，放在无菌滤纸上自然晾干后再接种于步骤2的最佳分化培养基中暗培养3d（20℃~25℃），然后转接于延迟培养基进行培育3d；再转接于选择培养基中培育2~3个月后形成转基因幼苗，最后转接于生根培养基中生根；生根后菊花幼苗经炼苗后移栽至田间，正常管理即可；
炼苗之前，菊花组培过程中温度为20~25℃；
所述选择培养基为：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA+100mg/L cef +8 mg/L Kan；
所述延迟培养基为：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA+200mg/L cef；
所述生根培养基为：MS+10 mg/L Kan。
实验过程中，在河南大学的实验田内（河南省开封市），2016年4月中旬进行常规练苗，5月4日转移至穴盘，遮光，待长出新根后上盆（6月8日），移栽到大田。转基因苗与非转基因苗各20盆，生长过程中及时摘除腋芽，9月下旬左右摘除侧蕾，仅留主蕾开花。9月 7 日选取生长健硕、一致且无病虫害的顶端叶片，自来水冲洗干净锡箔纸包裹经液氮速冻后于-80℃超低温冰箱中保存备用，取材时间为上午10:00左右。
记录试验过程中的现蕾日期（现蕾日期以出现肉眼可见的花苞为标准进行统计）、开花日期（开花日期以花瓣全部展开为标准进行统计）、现蕾时间（现蕾时间以现蕾日期-移栽日期为标准进行统计）、开花时间（开花时间以开花日期-移栽日期为标准进行统计）。
组培过程中部分结果如图1所示，开花情况如图2所示。
其中移栽日期为6月8日最终统计结果如下表所示：
注：数据后的 * 表示 0.05 水平上的差异显著性。
由上表可知：菊花品种“紫精灵”对照组与处理组花蕾出现时间和初花时间分为109 d 和 135 d、99 d 和 127 d，花蕾出现时间和初花时间与对照相比都显著降低，分别提前 10d 和 8 d、12 d 和 9 d，花蕾发育时间处理组与对照间没有差异。菊花DNA甲基化水平降低可以使花期提前。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南大学
<120> 一种利用RNAi载体调节菊花开花时间的方法
<130> none
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 273
<212> DNA
<213> Dendranthema morifolium
<400> 1
ccatgtcagg tattaattcc aacctttaca gcttttcaac ttattaaaat catatgaaat 60
ataaagacat gcagcacaac attaatgttc cttttacaac ataggatgag acattcttaa 120
cattttaaat atttatacag ggattttctg gtatgaatag gttcaataca agcacatgga 180
gcaaggttca gtgtgaaatg atattggcgc ttttgtcttt tgctgagtac ttccgtccca 240
agtatttctt gctagaaaat gtgaggaact ttg 273
<210> 2
<211> 184
<212> DNA
<213> Dendranthema morifolium
<400> 2
aggggtaatg acggcagatg atggaagtgg attctgttta gatgatgaac ctggtagtgc 60
atcaggttcc tctgctgcac caaatgaaga cggcatccct atatacctga gtgctataaa 120
ggaatggatg attgaatttg gatcatcaat ggttttcatt tcaattcgaa cagatatggc 180
ctgg 184
<210> 3
<211> 136
<212> DNA
<213> Dendranthema morifolium
<400> 3
cagaagacaa tgagcaggaa gattgtgaag aacctgaaga agaaagcacc cttcctgttc 60
aggaacctga aaaacctcat tctgcatcaa aggaaaagaa atctcgcatt tcaaaaaccg 120
acatcagttg ggttgg 136

Claims (3)

1.一种利用RNAi载体调节菊花开花时间的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：
（1）根据菊花甲基转移酶MET1基因的全长cDNA序列中的保守序列，构建RNAi表达载体，具体为：
利用3’和5’RACE技术获得菊花甲基转移酶MET1基因全长cDNA序列，然后针对菊花MET1基因全长cDNA序列中的保守片段序列构建RNAi表达载体；
所述保守片段序列包括3个部分：Chry1、Chry3、Chry4；
其中Chry1的碱基序列如SEQ ID NO.1所示，即：
Chry1:CCATGTCAGGTATTAATTCCAACCTTTACAGCTTTTCAACTTATTAAAATCATATGAAATATAAAGACATGCAGCACAACATTAATGTTCCTTTTACAACATAGGATGAGACATTCTTAACATTTTAAATATTTATACAGGGATTTTCTGGTATGAATAGGTTCAATACAAGCACATGGAGCAAGGTTCAGTGTGAAATGATATTGGCGCTTTTGTCTTTTGCTGAGTACTTCCGTCCCAAGTATTTCTTGCTAGAAAATGTGAGGAACTTTG；
Chry3的碱基序列如SEQ ID NO.2所示，即：
Chry3:AGGGGTAATGACGGCAGATGATGGAAGTGGATTCTGTTTAGATGATGAACCTGGTAGTGCATCAGGTTCCTCTGCTGCACCAAATGAAGACGGCATCCCTATATACCTGAGTGCTATAAAGGAATGGATGATTGAATTTGGATCATCAATGGTTTTCATTTCAATTCGAACAGATATGGCCTGG；
Chry4的碱基序列如SEQ ID NO.3所示，即：
Chry4:CAGAAGACAATGAGCAGGAAGATTGTGAAGAACCTGAAGAAGAAAGCACCCTTCCTGTTCAGGAACCTGAAAAACCTCATTCTGCATCAAAGGAAAAGAAATCTCGCATTTCAAAAACCGACATCAGTTGGGTTGG；
所述RNAi表达载体具体为：Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry1-KX-HX、Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry3-KX-HX和Dhpart27RNAiFADP1P4-Chry4-KX-HX；
（2）将步骤（1）中所构建RNAi表达载体转化农杆菌，制备浸染用农杆菌菌液；
（3）制备菊花愈伤组织，并利用步骤（2）中所制备浸染液对菊花愈伤组织进行浸染，并培育形成幼苗；
（4）对步骤（3）中转基因菊花幼苗进行筛选、鉴定，确保为正确的转基因植株后，移栽到大田，正常管理。
2.如权利要求1所述利用RNAi载体调节菊花开花时间的方法，其特征在于，步骤（3）中，
将愈伤组织在分化培养基上预培养2~3周后再进行农杆菌浸染；
浸染操作时，将菊花愈伤组织置于农杆菌菌液中浸泡5~7 min；
农杆菌浸染后愈伤组织再接种于分化培养基中暗培养2~3 d；
然后将愈伤组织转接于延迟培养基中延迟培养2~4 d；
将延迟培养后愈伤组织再转接到选择培养基中培养1~2个月；
最后将选择培养基中愈伤组织置于生根培养基中促进生根；
所述分化培养基为：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA；
所述延迟培养基为：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA+200 mg/L cef；
所述选择培养基为：MS+1.0 mg/L 6-BA+ 0.6mg/L NAA+100 mg/L cef +8 mg/L Kan；
所述生根培养基为：MS+10 mg/L Kan。
3.如权利要求1或2所述利用RNAi载体调节菊花开花时间的方法，其特征在于，所述菊花，具体品种为紫精灵、国庆红、洹水金秋或南农丽雅。
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