CN107502604A - 菊花独脚金内酯合成酶基因CmCCD8及其改变菊花花期的应用 - Google Patents

菊花独脚金内酯合成酶基因CmCCD8及其改变菊花花期的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程和转基因育种领域，公开了菊花独脚金内酯合成酶基因CmCCD8及其改变菊花花期的应用，本发明通过转CmCCD8基因调控菊花花期的方法包括以下步骤：从切花菊‘神马’中克隆CmCCD8基因；构建pBIG‑CmCCD8植物表达载体并转入菊花叶盘中，进行继代培养初步获得转基因植株。对转基因植株进行花期表型观察，发现与未转基因植株相比，转基因植株在长日照下能正常开花。本发明通过转化内源CmCCD8基因从而调控了切花菊的开花时间，为利用基因工程技术提高切花菊观赏品质提供新颖而实用的方法，将有效推动菊花生物技术育种进程。

Description

菊花独脚金内酯合成酶基因CmCCD8及其改变菊花花期的应用
技术领域
本发明属于植物基因工程和转基因育种领域，涉及一种通过转独脚金内酯合成酶基因CmCCD8调控菊花花期的方法。
背景技术
菊花(Chrysanthemum morifolium)是我国十大传统名花和世界四大切花之一，消费量仅次于月季(Zheng et al.2004)。目前，大多数切花菊品种均为短日照品种，花期多集中在秋季，限制了菊花的周年生产。目前，生产上多采用人工遮光、补光和加温等栽培措施调控花期，以满足周年生产的需求，但易导致品质下降而且成本及能耗高。
独脚金内酯(SL)是一类萜类小分子化合物，来源于类胡萝卜素(carotenoid)生物合成途径，以类胡萝卜素为前体物质，由一系列酶催化合成。拟南芥中MAX4/番茄SlCCD/水稻D10参与独脚金内酯合成，编码类胡萝卜素裂解酶CCD8，催化合成独脚金内酯前体；独脚金内酯作为一类新型植物激素，调控多种发育过程，如抑制植株地上部分枝，促进不定根形成、根毛伸长，茎的次生生长和节间伸长等(Liang et al.,2010；Foo and Reid,2013；Xi etal.,2015)。沉默SlCCD8基因的番茄，其分枝数增加(Vogel et al.,2010；Kohlen et al.,2012)；沉默水稻D10基因的植株其分蘖数显著增多(Zhang et al.,2010)。但转化CCD8调控植物花期的研究尚未见报道。
菊花花期遗传改良研究发现，将反花素基因CsAFT超表达菊花，转基因菊花开花时间延迟(Higuchi et al.,2013)。菊花BBX24沉默后，转基因菊花提前开花(Yang et al.,2014)。但遗传转化菊花CmCCD8基因改变菊花开花时间的研究未见报道。因此，通过农杆菌介导法将菊花内源基因CmCCD8导入切花菊‘神马’调控菊花花期是一种新的探索，为采用基因工程技术选育菊花观赏品种提供新颖而实用的方法。
参考文献：
Foo E.,Reid JB.(2013)Strigolactones:new physiological roles for anancient signal.Journal of Plant Growth Regulation,32:429-442.
Higuchi Y.,Narumi T.,Oda A.,Nakano Y.,Sumitomo K.,Fukai S.,HisamatsuT.(2013)The gated induction system of a systemic floral inhibitor,antiflorigen,determines obligate short-day flowering in chrysanthemums.PNAS,110(42):17137-17142.
Kohlen W.,Charnikhova T.,Lammers M.,Pollina T.,Tóth P.,Haider I.,PozoMJ.,de Maagd RA.,Ruyter-Spira C.,Bouwmeester HJ.,López-Ráez JA.(2012)Thetomato CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE8(SlCCD8)regulates rhizospheresignaling,plant architecture and affects reproductive development throughstrigolactone biosynthesis.New Phytologist,196(2):535-47.
Liang J.,Zhao L.,Challis R.,Leyser O.(2010)Strigolactone regulationof shoot branching in chrysanthemum(Dendranthema grandiflorum).Journal ofExperimental Botany,61:3069-3078.
VogelJT.,Walter MH.,Giavalisco P.,Lytovchenko A.,Kohlen W.,Charnikhova T.(2010)SlCCD7 controls strigolactone biosynthesis,shootbranching and mycorrhiza-induced apocarotenoid formation in tomato.PlantJournal,61:300-311.
Xi L.,Wen C.,Fang S.,Chen X.L.,Nie J.,Chu J.F.,Zhao L.J.(2015)Impactsof strigolactone on shoot branching under phosphate starvation inchrysanthemum(Dendranthema grandiflorum cv.Jinba).Frontiers in Plant Science,6.
Yang YJ.,Ma C.,Xu YJ.,Wei Q.,Imtiaz M.,Lan HB.,Gao S.,Cheng L.,WangMY.,Fei ZJ.,Hong B.,Gao JP.(2014)A zinc finger protein regulates floweringtime and abiotic stress tolerance in chrysanthemum by modulating Gibberellinbiosynthesis.The Plant Cell,26(5):2038-2054.
Zhang SY.,Li G.,Fang J.,Chen WQ.,Jiang HP.,Zou JH.,Liu X.,Zhao XF.,LiXB.,Chu CC.,Xie Q.,Jiang XN.,Zhu LH.(2010)The Interactions among DWARF10,Auxin and Cytokinin Underlie Lateral Bud Outgrowth in Rice.Journal ofIntegrative Plant Biology,52(7):626-638.
Zheng C,Kim K,Matsui S(2004)Effect of brushing on dwarfing,branchingand flowering of Dendramthema indicum var.hortense.Horticultural Research,3:1-10.
发明内容
本发明的目的在于解决定向改良菊花观赏性状的问题，提供独脚金内酯合成酶基因CmCCD8在调控菊花花期中的基因工程应用。
本发明的另一目的在于提供一种通过转独脚金内酯合成酶基因CmCCD8调控菊花花期的方法。本发明涉及的农杆菌介导遗传转化，转基因植物的分子检测及转基因植株后代表型观察，为利用基因工程技术开展观赏性菊花分子育种提供方法和实例。
本发明的又一目的在于提供一种CmCCD8基因植物表达载体及其应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
如SEQ ID NO.1所示的CmCCD8基因在调控菊花花期中的基因工程应用。
上述的应用，其在于：将所述CmCCD8基因的植物表达载体导入切花菊，调控菊花的开花时间，提高菊花观赏性。
上述的应用，其在于：所述CmCCD8基因植物表达载体的构建方法为：以切花菊‘神马’的cDNA为模板，设计如SEQ ID NO.4所示的上游引物CmCCD8-Xba I-F和如SEQ ID NO.5所示的下游引物CmCCD8-BamH I-R，进行PCR反应，在CmCCD8基因的上游和下游分别引入XbaI和BamH I酶切位点，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由Xba I和BamH I双酶切得到的CmCCD8片段与Xba I和BamH I双酶切的pBIG载体连接，转化，提取阳性质粒，得到CmCCD8基因植物表达载体pBIG-CmCCD8；所述的引物序列如下：
上游引物CmCCD8-XbaI-F：5′-GCTCTAGAGCATGGCTTCCTCCCTACTTTC-3′(SEQ IDNO.4)，
下游引物CmCCD8-BamHI-R：5′-CGGGATCCCGTCAACATTTTGGAACCCAACAT-3′(SEQ IDNO.5)。
一种通过转CmCCD8基因调控菊花花期的方法，包括以下步骤：
(1)以切花菊‘神马’为材料，提取花瓣的总RNA，进行反转录获得cDNA；
(2)构建CmCCD8基因植物表达载体：以步骤(1)获得的cDNA为模板，设计如SEQ IDNO.4所示的上游引物CmCCD8-Xba I-F和如SEQ ID NO.5所示的下游引物CmCCD8-BamH I-R，进行PCR反应，在CmCCD8基因的上游和下游分别引入Xba I和BamH I酶切位点，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由Xba I和BamHI双酶切得到的CmCCD8片段与Xba I和BamH I双酶切的pBIG载体连接，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pBIG-CmCCD8构建成功；
(3)采用农杆菌介导法将步骤(2)获得的CmCCD8基因植物表达载体导入菊花，经过卡那霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对阳性转化植株进行PCR、荧光定量RT-PCR检测验证内源基因已经转入转基因植株的基因组DNA中并发生转录；获得花期具有差异的转基因菊花植株。
上述的对阳性转化植株进行PCR、荧光定量RT-PCR检测的过程为：
所述的PCR检测：
取卡那霉素抗性筛选得到的阳性转化植株叶片及未转化植株叶片，提取基因组DNA，设计引物，扩增出的片段长为325bp，引物序列为：
上游引物NPTII-F：TCTGATGCCGCCGTGTTC
下游引物NPTII-R：GATGTTTCGCTTGGTGGTCG
分别以阳性转化植株和未转化植株DNA为模板，以NPTII-F和NPTII-R为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；
所述的荧光定量RT-PCR检测：
提取卡那霉素抗性筛选得到的阳性转化植株叶片及未转化植株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，建立荧光定量RT-PCR扩增体系，根据数据分析得到各个样品的CT值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物扩增出的片段长为145bp，引物序列为：
上游引物CmCCD8-RT-F：TCCCCAACACTCTGACTAAGATAGA
下游引物CmCCD8-RT-R：CGAAATTACAACTCCATCATCCTCA
以EF1α扩增的基因片段为内标，片段长度为151bp，引物序列：
上游引物EF1α-F：TTTTGGTATCTGGTCCTGGAG，
下游引物EF1α-R：CCATTCAAGCGACAGACTCA。
一种CmCCD8基因植物表达载体，该植物表达载体采用以下方法制备：以切花菊‘神马’的cDNA为模板，设计如SEQ ID NO.4所示的上游引物CmCCD8-Xba I-F和如SEQ ID NO.5所示的下游引物CmCCD8-BamH I-R，进行PCR反应，在CmCCD8基因的上游和下游分别引入XbaI和BamH I酶切位点，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由Xba I和BamH I双酶切得到的CmCCD8片段与Xba I和BamH I双酶切的pBIG载体连接，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pBIG-CmCCD8构建成功。
上述的CmCCD8基因植物表达载体在调控菊花花期中的基因工程应用。
上述的应用为：采用农杆菌介导法将所述的CmCCD8基因植物表达载体导入菊花，调控菊花的开花时间，提高菊花观赏性。
本发明所述的技术方案利用根癌农杆菌介导法，将CmCCD8基因导入切花菊‘神马’，并经过卡那霉素筛选抗性植株；经过卡那霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对转化植株进行PCR、定量RT-PCR检测验证内源基因已经转入转基因植株的基因组DNA中并发生转录。对转基因植株后代进行表型观察，最终获得开花时间具有差异的转基因菊花植株。CmCCD8基因从‘神马’中克隆得到，该基因的序列为SEQ ID NO.1。
本发明所述通过转独脚金内酯合成酶基因CmCCD8调控菊花花期的方法，具体包括以下详细步骤：
(1)菊花CmCCD8基因的克隆
以切花菊‘神马’根系为材料，提取RNA并反转录成cDNA，根据序列信息设计特异引物，结合PCR扩增目的基因的全长序列，
上游引物CmCCD8-F：5′-ATGGCTTCCTCCCTACTTTC-3′(SEQ ID NO.2)，
下游引物CmCCD8-R：5′-TCAACATTTTGGAACCCAACAT-3′(SEQ ID NO.3)；
以反转录的cDNA为模板，进行PCR反应，产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，获得目的基因的序列为SEQ ID NO.1。
(2)植物表达载体pBIG-CmCCD8的构建
根据CmCCD8基因全长序列设计引物，以切花菊‘神马’的cDNA为模板，用高保真酶进行PCR反应，在CmCCD8基因的上游和下游分别引入Xba I和BamH I酶切位点，
上游引物CmCCD8-Xba I-F：5′-GCTCTAGAGCATGGCTTCCTCCCTACTTTC-3′(SEQ IDNO.4)，
下游引物CmCCD8-BamH I-R：5′-CGGGATCCCGTCAACATTTTGGAACCCAACAT-3′(SEQ IDNO.5)；
PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由Xba I和BamH I双酶切得到的CmCCD8片段与Xba I和BamH I双酶切的pBIG载体连接，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pBIG-CmCCD8构建成功，所述的CmCCD8基因序列为SEQID NO.1。
(3)采用农杆菌介导法将步骤(2)构建的CmCCD8基因植物表达载体转入切花菊‘神马’中，进行培养初步获得抗性植株。
制备感受态的农杆菌，将步骤(2)中构建的CmCCD8基因植物表达载体转入感受态的农杆菌中，挑选阳性克隆，摇菌至OD＝0.5，离心后，弃上清，用MS(pH 5.8)培养液将沉淀等体积悬浮，用于侵染；取组培瓶中菊花苗顶端叶盘作为转化受体，在预培养基中培养3d，然后浸入上述备好的转入了pBIG-CmCCD8的植物表达载体的农杆菌菌液中侵染8～10min，用滤纸吸干叶盘表面的菌液后再将其接种到共培养基上，暗培养3d，然后转入筛选培养基上继代培养4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株。所用的农杆菌菌株为EHA105。
菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH 5.8，100Kpa、121℃灭菌20分钟；预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L；筛选培养基：MS+卡那霉素(Kan)10mg/L+羧卞青霉素(Carb)500mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.1mg/L；生根培养基：MS+卡那霉素(Kan)8mg/L。
详细操作过程为：
从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的100mM CaCl2(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。
取10μL pBIG-CmCCD8载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μL YEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌，用于转化菊花。
以切花菊‘神马’叶片为外植体，取组培瓶中菊花苗顶端叶盘(0.5cmⅹ0.5cm)作为转化受体，在预培养培养基中预培养3d，然后浸入备好的农杆菌菌液中感染8～10min，用滤纸吸干菌液后再接种到共培养基上黑暗中共培养3d，然后转入筛选培养基上继代培养4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基上培养，初步获得抗性植株。
将转CmCCD8基因初步获得的抗性植株进行PCR鉴定、荧光定量RT-PCR分子检测，筛选阳性植株，获得转基因菊花株系。对通过PCR、荧光定量RT-PCR分子检测所获得转基因植株后代进行表型观察：
选取6-8叶龄的野生型菊花(WT)和转基因菊花(OX)的扦插苗作为表型观察的材料，每个株系15株苗。观察每个株系的开花表型。
本发明所提供的通过转CmCCD8基因调控菊花花期的方法具有如下优点:
本发明提供的方法选育了转基因菊花材料，采用转基因技术，将CmCCD8基因整合到菊花基因组中，通过表型观察及分析获得具有开花时间差异的转基因菊花株系。结果发现，与未转基因植株相比，转入CmCCD8基因的植株在长日照下开花，利用本方法向菊花基因组中转入的CmCCD8基因可以显著改变菊花开花时间。
附图说明
图1pBIG-CmCCD8植物载体构建路线图
图2为植物表达载体pBIG-CmCCD8构建过程的琼脂糖凝胶电泳图
M1：Marker 2000；1：CmccCCD8；M2：Marker 15000；
2：pBIG质粒Xba I和BamH I双酶切；
3：pBIG质粒；
4：pMD19-CmCCD8质粒Xba I和BamH I双酶切；
5：pBIG-CmCCD8表达载体质粒电泳图。
图3转CmCCD8基因菊花的转化和再生过程
a：转化叶盘分化出愈伤；b：转化叶盘分化出抗性苗；c：抗性苗生根筛选；
d：抗性苗生根；e：抗性苗生根长成完整植株。
图4转CmCCD8基因菊花特异引物检测电泳图
M：DL2000Marker1：阳性质粒；2：野生型植株；
3～12：转CmCCD8的菊花株系。
图5转基因及未转基因的菊花植株中CmCCD8基因的相对表达量水平
WT：野生型植株；OX：转CmCCD8的株系。
图6转基因菊花开花的表型观察
WT：野生型植株；OX：转CmCCD8的株系；
具体实施方式
下面对发明的具体实施例进行详细的说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，其具体实施方式如下：
实施例1.CmCCD8基因的克隆
以切花菊‘神马’为材料，取根系0.15g，参照Trizol RNA提取试剂盒(TaKaRa)说明书的操作方法提取根系的总RNA，根据M-MLV反转录试剂盒(TaKaRa)进行反转录获得cDNA，根据菊花文库中该基因的序列信息，运用primer 5软件设计特异引物扩增CmCCD8；
上游引物CmCCD8-F：5′-ATGGCTTCCTCCCTACTTTC-3′(SEQ ID NO.2)，
下游引物CmCCD8-R：5′-TCAACATTTTGGAACCCAACAT-3′(SEQ ID NO.3)；
以根系的cDNA为模板，进行PCR反应，50μL反应体系：10×PCR Buffer 5.0μL，CmCCD8-F、CmCCD8-R引物各1.0μL(20μmol·L-1)，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L-1)，Taq DNAPolymerase 0.2μL，cDNA模板1μL，ddH2O 37.8μL；反应程序：95℃预变性5min，然后94℃解链45sec，55℃退火45sec，72℃延伸1min，反应30个循环，72℃延伸10min；产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN,USA)回收，用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接到pMD19-T载体(TaKaRa)，转化DH5α感受态细胞，序列测定为SEQ ID NO.1。
实施例2.植物表达载体pBIG-CmCCD8的构建
根据CmCCD8全长基因序列设计引物进行PCR反应，在目的基因CmCCD8的上游和下游分别引入酶切位点Xba I和BamH I，PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒用Xba I和BamH I双酶切得到的CmCCD8片段与Xba I和BamH I双酶切的pBIG连接，转化，提取阳性质粒。上游引物CmCCD8-Xba I-F：5′-GCTCTAGAGCATGGCTTCCTCCCTACTTTC-3′(SEQ ID NO.4)，下游引物CmCCD8-BamH I-R：5′-CGGGATCCCGTCAACATTTTGGAACCCAACAT-3′(SEQ ID NO.5)；
以切花菊‘神马’根系cDNA作为模板，用高保真酶(PrimeSTARTM HS DNAPolymerase，TaKaRa)进行PCR反应，50μL反应体系：10×HS PCR Buffer 5.0μL，CmCCD8-XbaI-F、CmCCD8-BamH I-R引物各1.0μL(20μmol·L-1)，dNTP mix 4.0μL(2.5mmol·L-1)，PrimeSTARTM HS DNA Polymerase 0.4μL，cDNA模板1μL，ddH2O 37.6μL；反应程序：95℃预变性5min，然后94℃解链45sec，55℃退火30sec，72℃延伸1min，反应30个循环，72℃延伸10min；PCR产物用凝胶回收试剂盒(AXYGEN,USA)回收，连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒pMD19-CmCCD8；
取载体pBIG(Invitrogen,USA)和pMD19-CmCCD8用Xba I和BamH I双酶切，双酶切体系(50μL)：10×H Buffer 5μL，BSA 5μL，质粒pBIG或pMD19-CmCCD8 15μL，Xba I 2μL，BamH I 2μL，ddH2O 21μL；37℃反应1h；双酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收质粒pBIG片段和CmCCD8片段。用T4DNA连接酶(TaKaRa)连接两个回收的产物，连接反应体系(10μL)：10×T4ligase Buffer 1μL，pBIG片段2μL，pMD19-CmCCD8片段6μL，T4DNA连接酶1μL；16℃过夜连接反应，取5μL连接产物转化DH5α感受态细胞。37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养，提取质粒pBIG-CmCCD8，电泳和测序验证。植物表达载体pBIG-CmCCD8构建成功(如图1、图2)。
实施例3.农杆菌EHA105介导叶盘法转化菊花
从YEB(50μg/mL利福平)平板上挑取EHA105单菌落，接种于50mL含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值0.5，而后冰浴菌液30min，离心收集菌体，悬浮于2mL预冷的100mM CaCl2(20％甘油)溶液中，200μL/管分装，待用。
取10μL pBIG-CmCCD8载体质粒，加入200μL感受态细胞，冰浴30min，液氮冷冻5min，37℃5min，加入800μL YEB液体培养基，28℃200rpm预培养4h，菌液涂板于YEB(50μg/mL利福平+50μg/mL卡那霉素)固体培养基上，28℃暗培养2天，挑取单克隆检测，选取阳性克隆摇菌至OD＝0.5，离心后，弃上清，用MS(pH 5.8)培养液将沉淀等体积悬浮，用于转化菊花。
采用的农杆菌指包含CmCCD8基因的植物表达载体的EHA105，用YEB液体培养基培养农杆菌EHA105；将转基因植株后代命名为OX，以切花菊‘神马’叶片为外植体，采用根癌农杆菌介导法将‘神马’中克隆得到的CmCCD8基因导入菊花。取组培瓶中菊花苗顶端叶盘(0.5cmⅹ0.5cm)作为转化受体，在预培养培养基中预培养3d，然后浸入备好的农杆菌菌液中感染10min，用滤纸吸干菌液后再接种到共培养培养基上黑暗中共培养3d，然后转入筛选培养基上继代培养4代，等分化出的抗性芽长至2～3厘米时转入生根培养基上培养，初步获得卡那霉素抗性植株(图3)。
菊花组织培养基以MS培养基为基础，pH 5.8，100Kpa、121℃灭菌20分钟；预培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L；共培养培养基：MS+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.5mg/L；筛选培养基：MS+卡那霉素(Kan)10mg/L+羧卞青霉素(Carb)500mg/L+6-苄氨基嘌呤(6-BA)1mg/L+萘乙酸(NAA)0.1mg/L；生根培养基：MS+卡那霉素(Kan)8mg/L。
实施例4.将转CmCCD8基因抗性植株进行分子检测(PCR、荧光定量RT-PCR)呈阳性，获得转基因菊花株系
1)PCR检测
取生根筛选得到的卡那霉素抗性植株嫩叶及未转化株嫩叶，提取基因组DNA，将Kan基因作为检测目标，根据Kan基因两端合成扩增反应引物，扩增出的片段长325bp，引物序列为：
上游引物NPT II-F：5′-TCTGATGCCGCCGTGTTC-3′(SEQ ID NO.6)，
下游引物NPT II-R：5′-GATGTTTCGCTTGGTGGTCG-3′(SEQ ID NO.7)；
分别以卡那霉素抗性植株和未转化植株DNA为模板，以NPT II-F和NPT II-R为引物，进行PCR检测。扩增体系为：1μL DNA模板，2.5μL 10×PCR Buffer，2μL dNTP，1.5μL2.5mmol·L-1MgCl2，5U·μL-1Taq酶0.2μL，NPT II-F和NPT II-R各1μL，去离子水补足体积至25μL。扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，58℃退火45s，72℃延伸1min，30个循环；72℃延伸10min。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析(如图4)。图中可以看到，转CmCCD8的植株均可扩增出与阳性对照相同的特异扩增带，野生型植株没有扩增出条带。
2)荧光定量RT-PCR检测
提取抗卡那霉素植株叶片及未转化株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，用荧光定量RT-PCR对CmCCD8基因的表达量进行检测。按照荧光定量试剂盒(Green Realtime PCR Master Mix-Plus-(QPK-212))说明书建立扩增体系，扩增条件：95℃1min；95℃15s，60℃15s，72℃45s，40个循环。根据数据分析得到各个样品的CT值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况。特异引物扩增出的片段长为145bp，引物序列为：
上游引物CmCCD8-RT-F：5′-TCCCCAACACTCTGACTAAGATAGA-3′(SEQ ID NO.8)，
下游引物CmCCD8-RT-R：5′-CGAAATTACAACTCCATCATCCTCA-3′(SEQ ID NO.9)；
以EF1α扩增的基因片段为内标，片段长度为151bp，引物序列：
上游引物EF1α-F：5′-TTTTGGTATCTGGTCCTGGAG-3′(SEQ ID NO.10)，
下游引物EF1α-R：5′-CCATTCAAGCGACAGACTCA-3′(SEQ ID NO.11)；
根据荧光定量RT-PCR检测结果(图5)，与野生型相比，转CmCCD8的植株株系基因表达量有所提高，OX-1、OX-2株系表达量明显较高。证实内源源基因已经转入切花菊基因组DNA中并表达。
实施例5.转基因植株后代的表型观察
选取6-8叶龄的野生型菊花(WT)和转基因菊花(OX)的扦插苗作为表型观察的材料，定植于温室大棚。长日照条件下，26-28叶龄的CmCCD8转基因菊花，能够正常开花，而野生型切花菊‘神马’不开花(图6)。
转基因植株表型观察实验表明CmCCD8超表达转基因的菊花株系长日照条件下可正常开花，CmCCD8基因对菊花花期具有明显的调控作用。
序列表
<110> 南京农业大学
<120> 菊花独脚金内酯合成酶基因CmCCD8及其改变菊花花期的应用
<130> 112017I1794
<141> 2017-09-07
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1668
<212> DNA
<213> 菊花‘神马’(Chrysanthemum morifolium'shenma')
<400> 1
atggcttcct ccctactttc atttttagcc accggaaact atatttcatc gtcatgcagg 60
gcgatttcca accatgatat tgatagttgt acctttgggc aagctagttt ctctaataaa 120
cgtaagagta gggagttaag tgtagttagt gtagcaactg atttgccgct tgttgttaaa 180
caacagccgt ggaaggtggt agaaaaggag aagaagctag tagcgtggac tagcattcag 240
caagatcggt gggagggcga gctcgttgtt gaaggaacga tcccacaatg gctgaatggg 300
acctacttga gaaatggacc gggactatgg cacctcggag actacgactt ccgccacctc 360
ttcgacggtt acgccaccat ggtccgcctc aacttcgaca atggccgcct cgtgatgggt 420
caccggcaaa ttgaatctga tgcatataag gccgcaagaa aaaataataa actttgttac 480
cgtgaatttt ctgaggtccc aaaatatgac aatttcttag catatattgg agacttggct 540
aatttattct ctggtgcgtc cctaaccgac aatgccaata ctggtgttgt tcagttaggg 600
gatggacgag tggtttgtct cacggagaca attaaagggt cgattgtgat cgaccctaat 660
aatttagata cgctagggaa gtttgagtat agtgacgcgc tgggtggctt ggtccattca 720
gcgcatccta tagtgacaga gtcagaattt ttgacattgt tgcccgacct gttgaaccct 780
ggctatctgg tggcaaggat ggagcccggt tcaaatgaga ggaaggtgat tggccgagtt 840
gattgtcgtg gtggcccgtc accagggtgg gtccactcat tcccggtgac tgaacattat 900
gtgattgtgc ccgagatgcc attaagatat tgtgcacaaa atttgttaag ggctgaacct 960
acaccattgt ataagtttga atggcatcct gagtcgaaag cgtatatgca tgttatgtgt 1020
aaagctagtg gcaaactggt ggcaagtgtg gaagttcctt tatttgtgac atttcacttc 1080
atcaacgcat acgaagagaa agatgaagat gggagagtaa caggagttat agccgattgt 1140
tgtgaacata atgccgacac aaccatcctt gacaagctgc ggcttcaaaa tctacgatca 1200
tggtccgggg aggatgttct acctgatgct agggttgggc ggtttaagat accattcgat 1260
cgtagtccaa agggagaact agtagacgct cttaacccca gtgaacatgg tagagggatg 1320
gatatgtgta gcatcaatcc agcttatttg ggtaagaaat acagatatgc ttacgcttgt 1380
ggtgctcaac gcccgtgtaa cttccccaac actctgacta agatagactt aaaagagaaa 1440
aaagcaaaaa attggcatga tgaaggtgca gttccatctg aaccattttt cgtcgcccgt 1500
cctggtgcaa cagatgagga tgatggagtt gtaatttcga tggtaagtga caaaaatggt 1560
gaaggctacg cactaatatt aaacgcgtca acatttgaag aaatcgcgag agcaaagttc 1620
ccttatgggc ttccatatgg acttcatgga tgttgggttc caaaatgt 1668
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggcttcct ccctactttc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcaacatttt ggaacccaac at 22
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gctctagagc atggcttcct ccctactttc 30
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgggatcccg tcaacatttt ggaacccaac at 32
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tctgatgccg ccgtgttc 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gatgtttcgc ttggtggtcg 20
<210> 8
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccccaacac tctgactaag ataga 25
<210> 9
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cgaaattaca actccatcat cctca 25
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ttttggtatc tggtcctgga g 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ccattcaagc gacagactca 20

Claims (8)

1.如SEQ ID NO.1所示的CmCCD8基因在调控菊花花期中的基因工程应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：将所述CmCCD8基因的植物表达载体导入切花菊，调控菊花的开花时间，提高菊花观赏性。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述CmCCD8基因植物表达载体的构建方法为：以切花菊‘神马’的cDNA为模板，设计如SEQ ID NO.4所示的上游引物CmCCD8-Xba I-F和如SEQ ID NO.5所示的下游引物CmCCD8-BamH I-R，进行PCR反应，在CmCCD8基因的上游和下游分别引入Xba I和BamH I酶切位点，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由Xba I和BamH I双酶切得到的CmCCD8片段与Xba I和BamH I双酶切的pBIG载体连接，转化，提取阳性质粒，得到CmCCD8基因植物表达载体pBIG-CmCCD8。
4.一种通过转CmCCD8基因调控菊花花期的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)以切花菊‘神马’为材料，提取花瓣的总RNA，进行反转录获得cDNA；
(2)构建CmCCD8基因植物表达载体：以步骤(1)获得的cDNA为模板，设计如SEQ ID NO.4所示的上游引物CmCCD8-Xba I-F和如SEQ ID NO.5所示的下游引物CmCCD8-BamH I-R，进行PCR反应，在CmCCD8基因的上游和下游分别引入Xba I和BamH I酶切位点，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由Xba I和BamH I双酶切得到的CmCCD8片段与Xba I和BamH I双酶切的pBIG载体连接，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pBIG-CmCCD8构建成功；
(3)将步骤(2)获得的CmCCD8基因植物表达载体导入菊花，经过卡那霉素抗性筛选得到阳性转化植株，对阳性转化植株进行PCR、荧光定量RT-PCR检测验证内源基因已经转入转基因植株的基因组DNA中并发生转录；获得花期具有差异的转基因菊花植株。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述的对阳性转化植株进行PCR、荧光定量RT-PCR检测的过程为：
所述的PCR检测：
取卡那霉素抗性筛选得到的阳性转化植株叶片及未转化植株叶片，提取基因组DNA，设计引物，扩增出的片段长为325bp，引物序列为：
上游引物NPTII-F：TCTGATGCCGCCGTGTTC
下游引物NPTII-R：GATGTTTCGCTTGGTGGTCG
分别以阳性转化植株和未转化植株DNA为模板，以NPTII-F和NPTII-R为引物，进行PCR检测，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测分析；
所述的荧光定量RT-PCR检测：
提取卡那霉素抗性筛选得到的阳性转化植株叶片及未转化植株叶片总RNA，反转录成第一链cDNA，建立荧光定量RT-PCR扩增体系，根据数据分析得到各个样品的CT值，以未转化植株的表达为基准值，计算各转基因植株及野生型基因相对表达情况；特异引物扩增出的片段长为145bp，引物序列为：
上游引物CmCCD8-RT-F：TCCCCAACACTCTGACTAAGATAGA
下游引物CmCCD8-RT-R：CGAAATTACAACTCCATCATCCTCA
以EF1α扩增的基因片段为内标，片段长度为151bp，引物序列：
上游引物EF1α-F：TTTTGGTATCTGGTCCTGGAG，
下游引物EF1α-R：CCATTCAAGCGACAGACTCA。
6.一种CmCCD8基因植物表达载体，其特征在于：该植物表达载体采用以下方法制备：以切花菊‘神马’的cDNA为模板，设计如SEQ ID NO.4所示的上游引物CmCCD8-Xba I-F和如SEQID NO.5所示的下游引物CmCCD8-BamH I-R，进行PCR反应，在CmCCD8基因的上游和下游分别引入Xba I和BamH I酶切位点，将PCR产物连接到pMD19-T载体，转化DH5α感受态细胞，提取阳性质粒，将提取的阳性质粒由Xba I和BamH I双酶切得到的CmCCD8片段与Xba I和BamH I双酶切的pBIG载体连接，转化，提取阳性质粒，植物表达载体pBIG-CmCCD8构建成功。
7.权利要求6所述的CmCCD8基因植物表达载体在调控菊花花期中的基因工程应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于：采用农杆菌介导法将所述的CmCCD8基因植物表达载体导入菊花，调控菊花的开花时间，提高菊花观赏性。
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